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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui descriviamo le fasi di raccolta e preparazione dei campioni per RIBO-seq nei batteri. Il sequenziamento delle biblioteche elaborate secondo queste linee guida si traduce in dati sufficienti per un'analisi bioinformatica completa. Il protocollo che presentiamo è semplice, utilizza attrezzature di laboratorio standard e richiede sette giorni dalla lisi all'ottenimento delle biblioteche.

Abstract

La tecnica di profilazione ribosoma (RIBO-seq) è attualmente lo strumento più efficace per studiare il processo di sintesi proteica in vivo. Il vantaggio di questo metodo, rispetto ad altri approcci, è la sua capacità di monitorare la traduzione mappando con precisione la posizione e il numero di ribosomi su una trascrizione di mRNA.

In questo articolo, descriviamo le fasi consecutive della raccolta e della preparazione dei campioni per il metodo RIBO-seq nei batteri, evidenziando i dettagli rilevanti per la pianificazione e l'esecuzione dell'esperimento.

Poiché il RIBO-seq si basa su ribosomi intatti e mRNA correlati, il passo chiave è la rapida inibizione della traduzione e un'adeguata disintegrazione delle cellule. Pertanto, suggeriamo la filtrazione e il congelamento flash nell'azoto liquido per la raccolta cellulare con un pretrattamento opzionale con cloramfenicolo per arrestare la traduzione nei batteri. Per la disintegrazione, proponiamo la macinazione di cellule congelate con malta e pestello in presenza di ossido di alluminio per interrompere meccanicamente la parete cellulare. In questo protocollo non è richiesto un cuscino di saccarosio o un ultracentrifugazione gradiente di saccarosio per la purificazione monosomatica. Invece, viene applicata la separazione dell'mRNA utilizzando l'elettroforesi del gel di poliacrilammide (PAGE) seguita dall'escissione dell'impronta ribosomiale (banda 28-30 nt) e fornisce risultati soddisfacenti. Ciò semplifica in gran parte il metodo e riduce i tempi e i requisiti delle apparecchiature per la procedura. Per la preparazione della biblioteca, si consiglia di utilizzare il piccolo kit di RNA disponibile in commercio per il sequenziamento Illumina da New England Biolabs, seguendo le linee guida del produttore con un certo grado di ottimizzazione.

Le librerie cDNA risultanti presentano la quantità e la qualità appropriate necessarie per il sequenziamento di nuova generazione (NGS). Il sequenziamento delle librerie preparate secondo il protocollo descritto comporta da 2 a 10 mln letture mappate in modo univoco per campione fornendo dati sufficienti per un'analisi bioinformatica completa. Il protocollo che presentiamo è rapido e relativamente semplice e può essere eseguito con apparecchiature di laboratorio standard.

Introduzione

La tecnica di profilazione ribosoma (RIBO-seq) è stata sviluppata nel laboratorio di Jonathan Weissman presso l'Università della California, San Francisco1. Rispetto ad altri metodi usati per studiare l'espressione genica a livello traslazionale, RIBO-seq si concentra su ogni legame ribosoma all'mRNA e fornisce informazioni sulla sua posizione e sul numero relativo di ribosomi su una trascrizione. Consente di monitorare il processo di sintesi proteica in vivo e può fornire una risoluzione e una precisione del codone singolo consentendo la misurazione della densità ribosoma su entrambi, il singolo mRNA e lungo l'intero trascrittame nella cellula. Alla base della tecnica RIBO-seq si trova il fatto che durante la traduzione il ribosoma lega la molecola di mRNA e quindi protegge il frammento sepolto della trascrizione da una digestione della ribonucleasi. Dopo l'aggiunta della ribonucleasi, l'mRNA non protetto viene digerito e i frammenti racchiusi da ribosomi - tipicamente lunghi ~28-30 nt - rimangono intatti. Questi frammenti, chiamati impronte ribosomiali (RF), possono quindi essere isolati, sequenziati e mappati sulla trascrizione da cui hanno avuto origine con conseguente rilevamento della posizione esatta dei ribosomi. Infatti, la capacità ribosoma di proteggere i frammenti di mRNA è stata utilizzata dagli anni '60 per studiare i siti di rilegatura ribosomiale e iniziazione alla traduzione (TIS)2,3,4. Tuttavia, con l'avanzamento della tecnologia di sequenziamento profondo, RIBO-seq è diventato un gold standard per il monitoraggio dellatraduzione 5 che, attraverso l'impegno ribosoma, può fornire informazioni a livello genomico sulla sintesi proteica6. La profilazione ribosoma ha colmato il divario tecnologico esistente tra la quantificazione del trascrittame e il proteoma6.

Per condurre la profilazione ribosoma è necessario ottenere il lisato cellulare dell'organismo che era cresciuto nelle condizioni studiate. Interrompere queste condizioni durante la raccolta e lalisi cellulare può fornire dati inaffidabili. Per evitare ciò, vengono comunemente utilizzati inibitori della traduzione, raccolta rapida e congelamento lampo nell'azoto liquido. Le cellule possono essere lisciviate mediante macinazione criogenica in un omogeneizzatore meccanico come un miscelatore7,8 o un battitore diperline 9e per triturazione attraverso una pipetta10 o con un ago11. Il tampone di lysis può essere aggiunto poco prima o poco dopo la polverizzazione delle cellule. Nel nostro protocollo utilizziamo azoto liquido per preraffreddare malta e pestello, così come l'ossido di alluminio come approccio più delicato all'interruzione della parete cellulare batterica, che impedisce la tosatura dell'RNA spesso riscontrata quando vengono applicati metodi come la sonificazione. Dopo la polverizzazione, aggiungiamo un tampone di lisi ghiacciata nel contenuto raffreddato della malta. La selezione di un buffer di lisi appropriato è importante per ottenere la migliore risoluzione delle impronte ribosomiali. Poiché la forza ionica influisce sia sulla dimensione RF che sulla precisione del fotogramma di lettura, si consiglia attualmente di utilizzare buffer di lisi con bassa forza ionica e capacità tampone, anche se sembra che la composizione tampone non influenzi l'occupazione ribosomiale su mRNA11,12. Componenti importanti del tampone di lisi sono gli ioni di magnesio, la cui presenza previene la dissociazione delle subunità ribosomiali e inibisce i cambiamenti conformazionali spontanei nei ribosomibatterici 11,13. Anche gli ioni di calcio svolgono un ruolo significativo e sono essenziali per l'attività della nucleasi micrococcica (MNasi) utilizzata nel metodo di profilazione ribosomabatterica 14. L'aggiunta di guanosina 5′-[β,γ-imido]trifosfato (GMP-PNP), un analogo non idrolabile di GTP, insieme al cloramfenicolo inibisce la traduzione durante la lisi15.

Quando il lisato viene ottenuto, viene chiarito per centrifugazione e diviso in due porzioni, ognuna per un RIBO-seq e un sequenziamento totale dell'mRNA ad alta produttività (RNA-seq) poiché vengono eseguite simultaneamente(Figura 1). RNA-seq fornisce un punto di riferimento che consente il confronto dei dati sia ribo-seq che RNA-seq durante l'analisi dei dati. Il translatoma studiato è definito dalla normalizzazione delle impronte ribosomiche all'abbondanza di mRNA16. I dati di RNA-seq possono anche aiutare a identificare la clonazione o sequenziare gliartefatti 17.

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Figura 1. Schemi di preparazione del campione di mRNA per RIBO-seq e RNA-seq. Per la preparazione della libreria RIBO-seq, l'RNA viene digerito con MNasi (A), seguito dalla selezione delle dimensioni di RF di ~28-30 nt di lunghezza (B); per l'RNA RNA-seq è isolato (C), impoverito di rRNA (D), e l'mRNA risultante è frammentato casualmente in frammenti di varie lunghezze (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I primi passi della procedura di preparazione del campione per RIBO-seq e RNA-seq differiscono leggermente (Figura 1). Per la profilazione ribosomiale, il lisato deve essere digerito da una specifica endonucleasi per degradare le molecole di mRNA non protette dai ribosomi. Nei protocolli standard, i monosomi ottenuti vengono recuperati da un cuscino di saccarosio ultracentrifugato o da un gradiente di saccarosio ultracentrifugazione8,14. In questo articolo, mostriamo che questo passaggio non è necessario per isolare RF richiesto per il RIBO-seq nei batteri, allo stesso modo per le cellule eucariotiche18e che la selezione delle dimensioni dei frammenti di mRNA di lunghezza appropriata dal gel di poliacrilammide è sufficiente.

Per l'RNA-seq, l'mRNA è ottenuto dall'esaurimento dell'rRNA dalle molecole totali di RNA - rRNA che si ibridano alle sonde oligonucleotidi biotinylate che si legano alle perline magnetiche rivestite di streptavidina. I complessi rRNA-oligonucleotide-perline vengono quindi rimossi dal campione con un magnete con conseguente campionamento impoverito di rRNA19,20. Le molecole di mRNA purificate vengono quindi frammentate casualmente per idrolisi alcalina. I frammenti ottenuti di mRNA e le impronte ribosomiali vengono convertiti in librerie cDNA e preparati per il sequenziamento profondo (Figura 2). Ciò comporta la riparazione delle estremità necessaria dopo l'idrolisi alcalina (per mRNA) e la digestione enzimatica (per RF): defosforilazione di 3' estremità seguita da fosforilazione di 5' estremità. I passaggi successivi sono la legatura degli adattatori e la trascrizione inversa per creare inserti cDNA incorniciati da sequenze necessarie per il sequenziamento di nuova generazione (NGS) utilizzando la piattaforma Illumina. L'ultima fase della preparazione della libreria è una reazione PCR in cui i costrutti vengono amplificati ed etichettati con codici a barre specifici del campione per consentire il multiplexing e il sequenziamento di vari campioni su un canale. Prima del sequenziamento, la qualità e la quantità delle librerie sono valutate dall'elettroforesi su chip del DNA ad alta sensibilità. Le librerie cDNA con parametri appropriati possono quindi essere raggruppate e sequenziate. Il sequenziamento può essere eseguito su diverse piattaforme Illumina, come MiSeq, NextSeq o HighSeq, a seconda del numero di librerie, della lunghezza di lettura e della profondità di sequenziamento richieste. Dopo il sequenziamento, viene eseguita l'analisi bioinformatica.

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Figura 2. Preparazione della biblioteca. La preparazione della libreria include la riparazione delle estremità, la legatura degli adattatori, la trascrizione inversa e l'amplificazione con codifica a barre. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La profilazione ribosoma è un metodo universale che può essere facilmente modificato e regolato in base alla questione scientifica. Originariamente è stato utilizzato nellievito 1,ma poco dopo è stato applicato alle cellulebatteriche 21 così come agli organismi modello eucariotico tra cui topo10,zebrafish22,mosca dellafrutta 23 e Arabidopsis thaliana24. È stato anche usato per studiare diversi tipi di ribosomi: citoplasmatico, mitocondriale25,26 e cloroplasto27,28. Negli eucarioti RIBO-seq è comunemente adattato e raffinato per indagare aspetti specifici della traduzione, tra cuiiniziazione 10,11,29,30,31,32,allungamento 1,10,11,31,33,ribosoma stallo33 e modifica conformazione33. La maggior parte delle modifiche comporta l'uso di diversi inibitori della traduzione. Nei batteri, tuttavia, studi analoghi sono stati difficili da condurre a causa della scarsità di inibitori con il meccanismo d'azionerichiesto 34. L'inibitore della traduzione più comunemente usato nei batteri è il cloramfenicolo (CAM) che si lega al centro peptidil transferasi (PTC) e impedisce il corretto posizionamento dell'amminoacil-tRNA nel sito A. Di conseguenza, CAM impedisce la formazione di un legame peptidico che porta ad arrestare i ribosomi allunganti35. Altri esempi di inibitori della traduzione nei batteri sono la tetraciclina (TET)36, la retapamulina (RET)34 e l'Onc11237 che sono stati utilizzati per studiare i siti di iniziazione alla traduzione. TET, che impedisce la consegna di tRNA al ribosoma sovrapponendosi direttamente con l'anello staminali anticodonte del tRNA nel sito A, è stato originariamente applicato per verificare i risultati ottenuti dal trattamento CAM poiché sono entrambi antibiotici che inibiscono l'allungamento dellatraslazione 38. Tet è stato trovato per rilevare tis primario, tuttavia non è stato in grado di rivelare tis36 interno. Il RET si lega nel PTC del ribosoma batterico e previene la formazione del primo legame peptidico interferendo con un aminoacil-tRNA allungatore nel sito A. L'applicazione del RET comporta l'arresto dei ribosomi sia al TISs34primario che a quello interno. Onc112, un peptide antimicrobico ricco di prolina, si lega nel tunnel di uscita e blocca il legame amminoacil-tRNA nel sito ribosomiale A. Di conseguenza, Onc112 impedisce ai complessi di iniziazione di entrare nella fase diallungamento 37.

La principale profilazione ribosoma delle informazioni fornisce la densità dei ribosomi e la loro posizione sull'mRNA. È stato applicato con successo per studiare l'espressione genica differenziale a livello di traduzione in varie condizioni dicrescita 1,6,misurare l'efficienza traslazionale1,38,39 e rilevare eventi di regolazione della traduzione come la pausa ribosomiale10. RIBO-seq consente inoltre di scoprire la traduzione di ncRNA annotato, pseudogeni e piccoli telai di lettura aperti senza preavviso (ORF) che portano all'identificazione di geni di codifica proteica nuovi e/o molto brevi10,12,22,30,37. In questi casi, RIBO-seq può perfezionare e migliorare l'annotazione del genoma. Con la sua elevata sensibilità per l'identificazione degli ORF tradotti e la sua natura quantitativa, la profilazione ribosoma può anche servire da proxy per la determinazione del proteoma o per aiutare gli studi di proteomica31,34,39. Mappando TIS, la profilazione ribosoma rivela isoforme estese e troncate N-terminale di proteinenote 10,32. RIBO-seq è stato anche adattato per studiare il ripiegamento co-traslazionaledelle proteine 14,21,24. Questo metodo consente di misurare i tassi diallungamento 1,10,39 o velocità di decodifica dei singolicodoni 6 e aiuta a sviluppare modelli quantitativi ditraduzione 17. Il metodo di profilazione ribosoma è anche in grado di fornire approfondimenti meccanicistici sulla pausa ribosoma neibatteri 7,15,17,frameshifting40,stop-codon readthrough21,difetti di terminazione /riciclaggio41,42 e modifiche alla conformazione ribosomiale33 negli eucarioti. RIBO-seq è stato anche adattato per esaminare l'impatto di specifici fattori trans-acting sulla traduzione come le miRNA6 e le proteine leganti l'RNA negli eucarioti16,43. Tuttavia, è importante riconoscere che il progetto sperimentale e la risoluzione ottenuta di RIBO-seq determinano la quantità di informazioni che possono essere estratte dai dati di sequenziamentorisultanti 12.

Protocollo

1. Raccolta dei campioni

  1. Preparare una coltura batterica. Si consiglia un volume di coltura di 100 mL per campione.
  2. Preparare attrezzature e reagenti per la raccolta dei campioni: due scoopula per campione, filtri sterili a membrana di cellulosa mista (MCE) da 0,45 μm, tubi sterili da 50 ml, azoto liquido, 50 mg/mL di cloramfenicolo nel 70% (vol/vol) di etanolo (facoltativo). Forare il coperchio di tubi da 50 ml per consentire l'evaporazione dell'azoto liquido e prevenire l'esplosione di tubi chiusi. Scoopulas decontaminati con detergente da laboratorio e 70% etanolo.
  3. Prewarm l'apparecchiatura filtrante e una delle scoopulas alla temperatura di crescita della coltura batterica.
    NOTA: Si consiglia un apparato di filtrazione tutto vetro con imbuto, base fritte, pallone a giunto a terra e morsetto a molla Ø da 47 mm.
  4. Prima della raccolta del campione, aggiungere il cloramfenicolo nella coltura batterica alla concentrazione finale di 100 μg/mL e incubare 1 minuto (facoltativo).
  5. Versare azoto liquido in un tubo sterile da 50 ml e posizionare la seconda scoopula all'interno del tubo per raffreddare.
    cautela! L'azoto liquido può causare l'esplosione di contenitori chiusi a causa del cambiamento di pressione all'evaporazione. Per evitare ciò, è necessario creare alcuni fori nel coperchio di tubi da 50 ml per consentire l'evaporazione dell'azoto liquido.
  6. Raccogliere le cellule per filtrazione. Interrompere il filtraggio quando il mezzo è passato attraverso la membrana, ma non lasciare asciugare completamente il filtro.
  7. Raccogliere pellet batterici raschiando rapidamente le cellule dal disco filtrante utilizzando una scoopula prebellica. Posizionare immediatamente l'intera scoopula con le cellule raccolte nel tubo da 50 ml riempito con azoto liquido. Il pellet raccolto deve essere completamente ricoperto di azoto liquido.
  8. Lasciare congelare accuratamente il pellet e spodedare le cellule congelate utilizzando una seconda scoopula precedentemente raffreddata. Chiudere il coperchio perforato e trasferire il tubo a -80°C. Punto STOP
    NOTA: Disinfettare le scoopulas dopo ogni raccolta del campione.

2. Llisi cellulare

  1. Preparare 0,1 M GMP-PNP in 10 mM Tris pH 8, DNasi I e 1,5 mL di tubi di reazione per lisati e tenerli sul ghiaccio. Raffreddare la centrifuga a 4 °C.
  2. Preparare tampone di lysis (20 mM TRIS pH 7.6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0.4% TRITON X-100, 6 mM β-mercaptoetanolo, 5 mM CaCl2 e opzionale 1 mM cloramfenicolo). Aliquota 500 μL del tampone di lisi per campione in tubi di reazione da 1,5 ml e metterli sul ghiaccio.
  3. Decontaminare malta e pestello con un detergente da laboratorio e 70% di etanolo, e asciugarli. Raffreddare malta e pestello versando azoto liquido nella malta.
  4. Trasferire il pellet congelato nella malta prerimente refrigerata e macinarlo in polvere. Con una spatola, aggiungere circa 1 volume di ossido di alluminio e continuare la macinazione. Mantenere malta, pestello e cellule raffreddare versando azoto liquido quando necessario, non lasciare che il contenuto della malta si scongeli.
  5. Poco prima di utilizzare il buffer di lisi, aggiungere GMP-PNP e DNasi I nell'aliquota del tampone di lisi alla concentrazione finale rispettivamente di 2 mM e 100 U/mL. Trasferire la soluzione nella malta con celle e ossido di alluminio e continuare la macinazione. Lasciare il disgelo del lysate lentamente durante la macinazione e trasferire la miscela nel tubo di reazione prerifuotto da 1,5 ml e posizionarlo immediatamente sul ghiaccio.
  6. La centrifuga si disatti a 20 000 x g per 5 minuti a 4 °C. Trasferire i supernatanti in nuovi tubi di reazione pre-raffreddati da 1,5 ml e tenerli sul ghiaccio.
  7. Misurare la concentrazione di RNA in ogni campione con un NanoDrop. Utilizzare 1:10 diluizioni di campioni e 1:10 diluizione del tampone di lisi in acqua priva di nucleasi come vuoto.
    NOTA: Tenere presente che il cloramfenicolo mostra un assorbimento significativo a 260 nm.
  8. Dividere ogni lisato in due porzioni: una per RIBO-seq (0,5 - 1 mg di RNA) e la seconda per RNA-seq (il resto).
  9. Pulire i campioni per RNA-seq utilizzando un kit di pulizia dell'RNA disponibile in commercio secondo il protocollo del produttore.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare il kit Zymo RNA Clean & Concentrate -25 (vedi Tabella dei materiali). Si consiglia inoltre di aggiungere 4,5 volumi di etanolo (rispetto al volume del campione) nella miscela di campione e Buffer di legame per impronte ribosomiali e mRNA frammentato, al fine di aumentare l'efficienza di purificazione dei frammenti di RNA brevi.
  10. Conservare i campioni destinati all'RNA-seq a -80 °C. La procedura per RNA-seq continuerà dal passaggio 5.

3. Digestione MNasi di campioni per RIBO-seq

  1. A 1 mg di RNA aggiungere 3,8 μL di 187,5 U/μL MNasi in 10 mM Tris pH 8 e completarlo con tampone di lysis al volume totale di 500 μL.
  2. Incubare a 25 °C, 300 giri/min, per 45 minuti in un termomixer.
  3. Pulire i campioni con un kit di pulizia dell'RNA disponibile in commercio (come nel passaggio 2.9).
  4. Conservare i campioni per RIBO-seq a -80 °C (punto STOP) o procedere alla selezione delle dimensioni.

4. Elettroforesi in gel di poliacrilammide (PAGE) e selezione delle dimensioni dei campioni per RIBO-seq

  1. Preparare un gel poliacrilammide-TBE al 15% con urea da 8 M e posizionare in un serbatoio con tampone TBE. Pre-eseguire per almeno 10 minuti ad una tensione costante di 200 V.
  2. Mescolare i campioni con TBE-Urea Sample Buffer, denaturare a 95 °C per 1 minuto e posizionarli immediatamente sul ghiaccio.
  3. Lavare l'urea iniettando il tampone TBE in pozzi di gel usando una siringa. Caricare i campioni lasciando uno spazio ben compreso tra di loro per separare ogni campione e prevenire la contaminazione incrociata. Utilizzare come marcatori oligonucleotidi da 29 nt e una miscela di oligonucleotidi da 26 nt e 32 nt. Eseguire l'elettroforesi ad una tensione costante di 180 V.
  4. Preparare tampone sterile per l'incubazione notturna (5 mM EDTA, 10 mM NaOAc pH 5).
  5. Dopo l'elettroforesi, macchiare il gel in un bagno d'oro SYBR per circa 2-3 minuti e risciacquare il gel con acqua priva di nucleasi.
  6. Asportare frammenti di gel tra 26 e 32 nt con gli aghi sterili o le lamette da barba e posizionare i frammenti di gel in tubi separati da 1,5 ml per ciascun campione. Cambiare l'ago o la lama del rasoio tra i campioni.
  7. Aggiungere 200 μL del tampone di incubazione notturno a ciascun tubo di reazione.
  8. Incubare i campioni a 10 °C, 1000 giri/min durante la notte in un termomixer.
  9. Il giorno successivo pulire i campioni come nel passaggio 2.9. Elute le impronte in 80 μL di acqua priva di nucleasi.
  10. Conservare i campioni a -80 °C. PUNTO STOP. La procedura per RIBO-seq proseguirà dal passaggio 7.

5. Purificazione dell'mRNA batterico mediante esaurimento dell'rRNA da campioni per RNA-seq

  1. Rimuovere l'rRNA dai campioni con un kit di purificazione dell'mRNA batterico (ad esempio, Invitrogen MICROBExpress). Seguire il protocollo del produttore.
  2. Pulire i campioni come nel passaggio 2.9. Elute l'mRNA in 50 μL di acqua priva di nucleasi.
  3. Conservare i campioni per RNA-seq a -80 °C (punto STOP) o continuare a frammentazione alcalina.

6. Frammentazione alcalina dei campioni per RNA-seq

  1. Preparare tampone di idrolisi alcalina (miscela 220 μL di 0,1 M NaHCO3, 30 μL di 0,1 M Na2CO3 e 1 μL di 0,5 M EDTA). Mescolare 1 volume (50 μL) di tampone alcalino con 1 volume (50 μL) del campione e incubare a 95 °C per 25 minuti.
  2. Aggiungere 5 μL di 3 M NaOAc pH 5.5 per fermare la reazione.
  3. Pulire i campioni come al passaggio 2.9 ed elutare i campioni in 80 μL di acqua priva di nucleasi.
  4. Possibile punto STOP: conservare campioni di RNA-seq a -80 °C. Tuttavia, si consiglia di andare direttamente al passaggio 7 per evitare inutili congelamento e scongelamento.

7. Defosforilazione e fosforilazione di campioni sia per l'RNA che per il RIBO-seq

  1. Aggiungere 10 μL di 10x tampone di reazione PNK e 5 μL T4 PNK ad ogni campione. Incubare a 37 °C per 1,5 ore per defosforire le estremità 3 '.
  2. Aggiungere 3 μL di 1 mM di ATP e incubare a 37 °C per 1 ora per fosforilate le estremità 5'.
  3. Pulire i campioni come nel passaggio 2.9, elute in acqua priva di nucleasi da 30 μL.
  4. Conservare i campioni a -80 °C. PUNTO STOP.

8. Preparazione della libreria con NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set per Illumina

  1. Preparare 100-1000 ng di RNA di ingresso (frammenti di mRNA ottenuti e impronte ribosomiali) in 6 μL di acqua priva di nucleasi e aggiungere 1 μL di adattatore SR da 3'. Incubare secondo il protocollo del produttore.
  2. Aggiungere 10 μL di 3' Ligation Reaction Buffer (2X) e 3 μL di 3' Ligation Enzyme Mix e incubare a 37 °C per 2,5 ore, invece di 1 ora a 25 °C come specificato dal protocollo del produttore.
  3. Ibridare il primer di trascrizione inversa secondo il protocollo del produttore con un programma modificato: 5 minuti a 75 °C, 30 minuti a 37 °C e tenere a 4 °C.
  4. Ligate l'adattatore SR da 5'. Seguire il protocollo del produttore con una sola modifica: eseguire l'incubazione a 37 °C per 2,5 ore, invece di 1 ora a 25 °C.
  5. Eseguire la trascrizione inversa in base al protocollo del produttore.
  6. Possibile punto STOP: incubare i campioni contenenti cDNA sintetizzati a 70 °C per 15 minuti per inattivare la transcriptasi inversa e conservarli a -80 °C. Tuttavia, si consiglia di procedere direttamente ai passaggi successivi per evitare inutili congelamento e scongelamento dei campioni.
  7. Conservare metà di ogni libreria cDNA a -80 °C come backup.
  8. Eseguire l'amplificazione PCR secondo il protocollo del produttore. Utilizzare metà del mix di reazione. Conservare le librerie ottenute a -80 °C. PUNTO STOP.

9. Selezione delle dimensioni delle librerie cDNA utilizzando PAGE

  1. Preparare il 6% di gel poliacrilammide-TBE e posizionare in un serbatoio con tampone TBE. Pre-eseguire per almeno 10 minuti ad una tensione costante di 200 V.
  2. Mescolare i campioni con Gel Loading Dye, Blue (6X) e caricarli sul gel. Utilizzare il digest pBR322 DNA-MspI a caricamento rapido come scala. All'inizio, eseguire l'elettroforesi ad una tensione costante di 120 V per consentire al DNA di entrare nel gel e quindi cambiare la tensione a 180 V.
  3. Al termine dell'elettroforesi, macchiare il gel in un bagno d'oro SYBR per circa 2-3 minuti e risciacquare il gel con acqua priva di nucleasi.
  4. Frammenti di gel di accisa contenenti le biblioteche. Per campioni di RNA-seq accisa tra 135-180 nt e per RIBO-seq tra 135-170 nt. Utilizzare aghi sterili o lamette da barba e posizionare i frammenti di gel asportati in tubi di reazione separati da 1,5 ml. Ricordarsi di cambiare l'ago o la lama del rasoio tra i campioni.
    NOTA: gli adattatori e il codice a barre di NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina hanno 119 nt in totale che determina il taglio dell'escissione inferiore.
  5. Aggiungere 100 μL di acqua priva di nucleasi a ogni frammento di gel accisa.
  6. Incubare i frammenti di gel a 10 °C, 450 giri/min durante la notte in un termomixer.
  7. Pulire e concentrare le librerie cDNA con un kit di pulizia del DNA commerciale secondo il protocollo del produttore.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare il kit Zymo DNA Clean & Concentrate -5 (vedi Tabella dei materiali).
  8. Conservare le librerie cDNA purificate a -80 °C. Punto STOP.

Risultati

I risultati esemplari qui presentati sono stati ottenuti in uno studio che esamina la regolazione della traduzione nelle cellule subtili sporulate di Bacillus bacillus. Le colture notturne sono state diluite in OD600 pari a 0,1 in 100 mL di mezzo ricco e incubate a 37 °C con scuotimenti vigorosi fino a quando L'OD600 ha raggiunto 0,5-0,6. Il ricco mezzo è stato quindi sostituito con un mezzo minimo per indurre il processo di sporulazione e l'incubazione è stata continuata per un massimo ...

Discussione

La sfida tecnica chiave della profilazione ribosoma è la necessità di inibire rapidamente la traduzione al fine di catturare un'istantanea dei ribosomi sugli mRNA in un particolare stato fisiologico di interesse. A tal fine, vengono comunemente utilizzati inibitori della traduzione, raccolta rapida e congelamento flash nell'azoto liquido. L'applicazione di antibiotici è facoltativa poiché possono causare artefatti. Il cloramfenicolo è un farmaco comunemente usato per arrestare i ribosomi allunganti nel ribo-seq batt...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

ALS desidera riconoscere il sostegno finanziario delle sovvenzioni per l'installazione EMBO IG 3914 e POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 realizzato nell'ambito del programma First TEAM della Fondazione per la scienza polacca cofinanziato dall'Unione europea nell'ambito del Fondo europeo di sviluppo regionale.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10X TBE (powder)InvitrogenAM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pureAcros Organics125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)New England BiolabsP0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a.Chempur114560600
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC3881-500G
ChloramphenicolMP Biomedicals190321
DNA Clean & Concentrator -5Zymo ResearchD4004
Dnase I recombinant, Rnase-freeRoche4716728001
EDTA disodium saltFisher ScientificE/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-BasicPOCH Avantor Performance Materials Poland S.ABA6480111
Filtration apparatusVWR Collection511-0265all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1)Rotiphorese3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6XNew England BiolabsE6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrateSigma-AldrichG0635-25MG
labZAPA&A Biotechnology040-500
Magnesium acetate tetrahydrateSigma-AldrichM5661-250G
MCE membrane fiterAlfatec TechnologyM47MCE45GWSpore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA PurificationInvitrogenAM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for IlluminaNew England BiolabsE7300S
Nuclease-Free WaterAmbionAM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.POCH Avantor Performance Materials Poland S.A744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI DigestNew England BiolabsE7323A
RNA Clean & Concentrator -25Zymo ResearchR1018
Sodium acetateSigma-AldrichS2889-250G
Sodium carbonateSigma-Aldrich223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a.POCH Avantor Performance Materials Poland S.A810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stainLife TechnologiesS11494
T4 Polynucleotide KinaseNew England BiolabsM0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction BufferNew England BiolabsB0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x)InvitrogenLC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%AlfaAesarJ65594
Triton X-100, 98%Acros Organics327371000
Urea G.R.lach:ner40096-AP0

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