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Zusammenfassung

Das Laden von Perlen führt Proteine, Plasmide und Partikel in anhaftende Säugetierzellen ein. Diese Zellladetechnik ist kostengünstig, schnell und beeinträchtigt die Zellgesundheit nicht wesentlich. Es eignet sich am besten für die Bildgebung von lebenden Zellen.

Zusammenfassung

Viele Lebendzell-Bildgebungsexperimente verwenden exogene Partikel (z. B. Peptide, Antikörper, Perlen), um Zellen zu kennzeichnen oder zu funktionieren. Es ist jedoch schwierig, Proteine über ihre Membran in eine Zelle einzuführen. Die begrenzte Auswahl an aktuellen Methoden kämpft mit geringem Wirkungsgrad, erfordert teure und technisch anspruchsvolle Geräte oder funktioniert innerhalb enger Parameter. Hier beschreiben wir eine relativ einfache und kostengünstige Technik, um DNA, RNA und Proteine in lebende menschliche Zellen zu laden. Die Perlenbelastung induziert eine vorübergehende mechanische Störung der Zellmembran, so dass Makromoleküle in adhärente, lebende Säugetierzellen eindringen können. Mit weniger als 0,01 USD pro Experiment ist das Laden von Perlen die kostengünstigste verfügbare Zelllademethode. Darüber hinaus belastet die Beladung von Perlen die Zellen nicht wesentlich und beeinträchtigt ihre Lebensfähigkeit oder Proliferation nicht. Dieses Manuskript beschreibt die Schritte des Perlenladeverfahrens, Anpassungen, Variationen und technische Einschränkungen. Diese Methodik eignet sich besonders für die Bildgebung lebender Zellen, bietet aber eine praktische Lösung für andere Anwendungen, die die Einführung von Proteinen, Perlen, RNA oder Plasmiden in lebende, adhärente Säugetierzellen erfordern.

Einleitung

Das Laden von Makromolekülen in Säugetierzellen erfordert eine Methodik, die es ihnen ermöglicht, die Plasmamembran der Zelle zu durchqueren1. Mehrere Methoden können Plasmide durch Transfektion in Säugetierzellen einführen, einschließlich liposomaler Transfektion2 und Diethylaminoethyl-Dextran-Transfektion3. Methoden zum Laden von Proteinen oder membrandurchlässigen Partikeln in Zellen sind jedoch begrenzter.

Mehrere Techniken haben diese schwierige Hürde mit verschiedenen Strategien umgangen. Zunächst liefert die Mikroinjektion Partikel durch eine Mikropipette in lebende Zellen untereinem Mikroskop 4. Obwohl diese Technik wohl die kontrollierteste und am wenigsten invasive Methode ist, ist sie relativ durchsatzarm, da die Zellen nacheinander geladen werden müssen. Darüber hinaus erfordert die Mikroinjektion spezielle Ausrüstung und ist technisch anspruchsvoll.

Zweitens ist die Elektroporation eine Möglichkeit, Proteine durch spannungsinduzierte Membranaufschluss in Zellen zu injizieren5,6,7. Diese Methode erfordert jedoch wiederum spezielle, teure Ausrüstung, und der Schock kann Zellstress und Mortalität verursachen. Darüber hinaus müssen Zellen vor der Elektroporation trypsinisiert und anschließend neu plattiert werden, wodurch der Zeitrahmen begrenzt wird, in dem Zellen nach der Elektroporation untersucht werden können.

Drittens können Zellmembranen chemisch für eine vorübergehende, reversible Permeabilisierung modifiziert werden8,9. Streptolysin-O-Ladung führt ein Endotoxin in Zellmembranen ein, das temporäre Poren bildet, so dass exogene membranimpermeable Partikel, einschließlich Proteine und DNA-Plasmide, in Zellen eindringenkönnen 10. Nach einer 2- h-Erholung repariert etwa die Hälfte der Zellen diese Poren und stoppt die Internalisierung von Partikeln aus der Lösung. Diese Technik erfordert jedoch eine lange Erholungszeit und ist mit Zelltypen, die Endotoxine nicht vertragen, nicht kompatibel.

Viertens belastet die mechanische Störung Partikel durch physikalische Störung der Zellmembran in die Zellen11. Dies kann auf verschiedene Arten erfolgen, einschließlich Kratzen, Abkratzen und Rollen von Perlen auf den Zellen12,13. Bereits 1987 wurden Perlen verwendet, um Proteine mechanisch in Zellen zu laden14. In jüngerer Zeit wurde die Perlenladetechnik optimiert und über Proteine hinaus angepasst, um die Beladung von Plasmiden und RNA einzubeziehen, wie hier beschrieben.

Das Laden von Perlen ist eine einfache, kostengünstige und schnelle Methode zum Laden von Protein und Plasmiden in adhärente menschliche Zellen. Glasperlen werden kurz auf Zellen gerollt und stören vorübergehend ihre Zellmembran. Dadurch können Partikel in Lösung eindringen. Da die Perlenbeladung einen geringen Wirkungsgrad aufzeigt, eignet sie sich am besten für Einzelmolekül- oder Einzelzellmikroskopieexperimente. Das Laden von Perlen kann eine Vielzahl von Proteinen einführen, darunter fragmentierte Antikörper (Fab),15,16 gereinigte Proteine wie scFvs,17 Intrabodies,18,19oder mRNA-Coat-Proteine, z. B. MS2-Coat-Protein (MCP)20,21. Plasmidexpressionsvektoren können auch der Proteinlösung zugesetzt und gleichzeitig mit Perlen beladen werden22,23,24,25.

Neben Proteinen und Plasmiden wurden Moleküle mit einer Größe von bis zu 250 nm Polystyrolperlen über Perlenladung (persönliche Kommunikation) in die Zellen eingebracht. Das Laden von Perlen ist unglaublich kostengünstig, kostet weniger als 0,01 USD pro Experiment in Materialien und erfordert keine zusätzliche teure Ausrüstung. Die Kosten werden weiter reduziert, indem die Anzahl der pro Experiment verwendeten Sonden minimiert wird, da nur die Zellen im zentralen Mikrobrunnen mit einem Durchmesser von 14 mm einer Bildgebungskammer belastet werden. Es ist zu beachten, dass die begrenzte Ladefläche bedeutet, dass die Perlenbeladung nicht ideal für die Beladung von Schüttzellen ist.

Dieses Manuskript stellt den Perlenladeprozess vor, einschließlich der Konstruktion der Perlenladevorrichtung und der Durchführung eines Experiments. Es zeigt, dass Proteine, RNA und DNA in verschiedene Zelltypen geladen werden können und dass zwei verschiedene, gleichzeitig perlenbeladene Proteine stark korrelierte Zellkonzentrationen und relativ geringe Varianz aufweisen. Diskutiert werden auch Variationen im Protokoll, die auf dem Zelltyp und der Belastung von Protein, Plasmid oder RNA basieren. Obwohl angenommen wird, dass Perlen die Zellmembran perforieren und stören, verdrängt der Perlenbeladungsprozess bei entsprechender Durchführung nur eine kleine Anzahl von Zellen vom Boden der Bildgebungskammer. Nach einer kurzen Erholungsphase wachsen und teilen sich die Zellen weiter. Diese Methodik ist ideal für Experimente in der Lebendzellmikroskopie, einschließlich Einzelmolekülprotein- und RNA-Tracking, post-translationaler Modifikationsdetektion, Beobachtung dynamischer zellulärer Mechanismen oder subzelluläre Lokalisierungsüberwachung15,16,22,26,27.

Protokoll

1. Reinigen, sterilisieren und trocknen Sie Glasperlen, um verklumpen zu vermeiden und eine gleichmäßige Ausbreitung auf den Zellen zu gewährleisten.

  1. Sterilisieren Sie ca. 5 ml Glasperlen in Natriumhydroxid (NaOH). Messen Sie die Perlen in einem 50 ml konischen Rohr. Fügen Sie 25 ml 2 M NaOH hinzu und mischen Sie es vorsichtig mit einem Shaker oder Rotator für 2 h.
  2. Dekantieren Sie die NaOH und behalten Sie so viele Perlen wie möglich. Wenn die Perlen in Suspension sind, drehen Sie das Perlenrohr kurz in einer Zentrifuge herunter (1 min bei ~1000 × g,Raumtemperatur).
  3. Waschen Sie die Perlen gründlich mit Wasser in Zellkulturqualität, bis der pH-Wert neutral ist (verwenden Sie einen pH-Teststreifen auf dem Eluenten, um einen neutralen pH-Wert zu bestätigen). Dekantieren Sie das Waschwasser jedes Mal, wie zuvor.
  4. Waschen Sie die Perlen gründlich mit 100% Ethanol 2-3x. Dekantieren Sie das Ethanol jedes Mal, wie zuvor.
  5. Trocknen Sie die Perlen. Streuen Sie die Perlen zu einer dünnen Schicht in einen sterilen Behälter (z. B. eine 10 cm Petrischale). Lassen Sie den Behälter offen und lassen Sie die Perlen über Nacht in einer Biosicherheitswerkbank an der Luft trocknen. Stellen Sie sicher, dass die Perlen vollständig trocken sind, indem Sie den Behälter klopfen oder vorsichtig schütteln und überprüfen, ob die Perlen eine sandige Textur ohne Verklumpen oder Abblättern haben.
  6. UV-sterilisieren Sie die trockenen Perlen für 15 min.

2. Montieren Sie die Perlenladervorrichtung.

  1. Befestigen Sie einen Netzfleck (Polypropylen oder gleichwertiges Material, 105 μm Öffnungen, damit die Perlen durchgehen können), um die gesamte Öffnung der Perlenhaltekammer entweder mit Klebeband abzudecken oder das Netz zwischen den männlichen und weiblichen Enden einer wiederverwendbaren Metallabbildungskammer zu klemmen (Abbildung 1A).
  2. UV-sterilisieren Sie das Gerät für 15 min. Fügen Sie die Perlen in das Gerät ein und verschließen Sie es fest mit wachsartigem Film.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Perlen in diesem Schritt vollständig sauber und trocken sind. Sie sollten locker sein und sandig aussehen ohne Klumpen. Wenn sie nicht so erscheinen, waschen Sie die Perlen erneut und trocknen Sie sie vollständig.
  3. Lagern Sie das Gerät in einem versiegelten, trockenen Behälter, der mit Kieselgel oder einem anderen Trockenmittelmedium getrocknet ist. Wenn die Perlen feucht werden, was sich durch Perlenklumpen besennt, trocknen und sterilisieren Sie den Perlenlader gründlich und sterilisieren Sie ihn durch frische Perlen.
    HINWEIS: Alle diese Vorsichtsmaßnahmen verhindern, dass Schimmel oder Bakterien auf oder um die Perlen im Perlenlader wachsen. Die Perlenladervorrichtung kann auf verschiedene Arten hergestellt werden. Siehe die Details in der Diskussion.

3. Bereiten Sie Glasbodenkammern aus adhärenten Zellen vor.

  1. Sämt anhaftende Säugetierzellen auf einer 35 mm Glasbodenkammer. Stellen Sie sicher, dass die Zellen zum Zeitpunkt der Perlenbeladung zu etwa 80% konfluent sind. (Siehe Tabelle 1 für weitere Informationen zu verschiedenen Zelltypen und Hinweise zur Wirksamkeit der Perlenbelastung in verschiedenen Zelltypen.)
    HINWEIS: Zellen können nur in der Mikrowell in der Mitte der Kammer ausgesät werden, um zu erhalten, wie viele Zellen verwendet werden.
  2. Inkubieren Sie die Zellen unter normalen Bedingungen, bis sie vollständig am Glas haften.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Zelldichte hoch genug ist und dass die Zellen sicher am Glas haftet. Wenn diese Anforderungen nicht erfüllt werden, werden sich die Zellen während des Perlenladens wahrscheinlich ablösen. Der Zeitplan zwischen Zellaussaat und Perlenbeladung kann verlängert werden, um eine ordnungsgemäße Zelladhäsion und -konfluenz zu gewährleisten.

4. Wulst-Ladezellen

HINWEIS: Bei Bedarf die Zellen kurz mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen und dann 2 ml des optimalen Mediums hinzufügen. Mindestens 30 Min. inkubieren.

  1. Stellen Sie eine Lösung aus 3-8 μL mit den gewünschten Plasmiden, Proteinen und / oder Partikeln vor. Verwenden Sie ~1 μg (0,1-1 pmol) jeder Art von Plasmid und ~0,5 μg (0,01 nmol) Protein, abhängig von den experimentellen Anforderungen. Verwenden Sie eine Low-Retention-Röhre für Proteine, damit sie nicht an den Röhrenwänden zurückbleiben. Bringen Sie die Lösung mit PBS auf ein Minimum von 3 μL und stellen Sie das Lösungsvolumen so ein, dass der gesamte Bereich der zu ladenden Zellen beschichtet wird (d. h. das Mikrowell der Kammer, Abbildung 1B).
  2. Mischen Sie die Lösung gründlich, indem Sie die Röhre auf und ab pipettieren und/oder streichen. Drehen Sie die Lösung kurz in einer Tischmikruge bis zum Boden der Röhre.
  3. Übertragen Sie die Perlenladelösung und die Zellkammer in eine Gewebekulturhaube. Führen Sie die verbleibenden Schritte in der Gewebekulturhaube mit steriler Technik durch.
  4. Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und lagern Sie es vorübergehend in einem sterilen Röhrchen. Saugen Sie vorsichtig das gesamte Medium an den Rändern der Kammer an, neigen Sie die Kammer in einem Winkel von etwa 45 ° und entfernen Sie den verbleibenden Tropfen des Mediums im mittleren Mikrowell. Achten Sie während der Mediumentfernung darauf, dass die Pipettenspitze das Glas nicht berührt, was zu Zellabblättern und -verlust führen kann. Gehen Sie schnell zum nächsten Schritt über, damit die Zellen nicht lange trocken sind.
  5. Pipetten Sie die Perlenladelösung vorsichtig auf das Glasmikrobrunnen in der Mitte der Kammer. Optional: Mit sanftem Schaukeln für ~30 s inkubieren, ohne dass die Kammer vollständig austrocknet.
  6. Verteilen Sie vorsichtig eine Monoschicht aus Glasperlen auf den Zellen, vorzugsweise unter Verwendung einer Perlenladevorrichtung (Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass die Perlen die Zellen im Glasboden-Mikrobrunnen vollständig bedecken.
  7. Klemmen Sie die Kammer mit zwei Fingern, klopfen Sie sie gegen die Haubenoberfläche, indem Sie sie ~ 2 Zoll anheben und fest nach unten bringen. Verwenden Sie eine Kraft, die ungefähr dem Fallen der Schüssel aus dieser Höhe entspricht. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt ~10 Taps.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Wasserhähne die Zellen nicht wesentlich schälen. Das Klopfen kann für den Zelltyp optimiert werden. Wenn Zellen schlecht geladen sind, tippen Sie härter; Wenn sich jedoch viele Zellen ablösen, tippen Sie leichter.
  8. Fügen Sie das Medium vorsichtig wieder in die Kammer ein, indem Sie es langsam auf die Kunststoffseite der Kammer pipettieren. Versuchen Sie, schwimmende Perlen abzusaugen, ohne die Zellen zu stören. Fügen Sie in diesem Schritt weitere vorgewärmte Medien hinzu, wenn zu viel entfernt wurde. Inkubieren Sie die Zellen für 0,5-2 h im Inkubator.
  9. UV-sterilisieren Sie den Perlenlader für 15 Minuten, bevor Sie ihn unter Austrocknungsbedingungen wieder einlagern.
  10. Fügen Sie den Zellen Farbstoff (z. B. DAPI- oder HaloTag-Ligandenfleck, falls vom Experiment erforderlich) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll hinzu.
  11. Waschen Sie die Zellen vor der Bildgebung 3x mit Medium, um die Perlen und überschüssigen Belastungskomponenten in Lösung zu entfernen. Vermeiden Sie es, direkt auf Zellen zu pipettieren, um zu verhindern, dass sie sich schälen.

5. Abbildung der mit Perlen beladenen Zellen

  1. Stellen Sie die Zellen sofort oder bei Bedarf des Experiments ab. Verwenden Sie ein Mikroskop, das Fluoreszenz erfassen kann (Laser oder monochromatische Lichtquelle). Stellen Sie sicher, dass die Anregungswellenlängen für das gewählte Fluorophor oder den farbstoff geeignet sind (z. B. 488 nm Wellenlängenlicht für grünes Fluoreszenzprotein (GFP)).
    HINWEIS: Perlenbeladene Proteine können abgebildet werden, sobald sich die Zellen erholt haben (sobald 30 Minuten nach dem Laden für die hier beschriebenen Zelllinien). Die Plasmidausdrucksausdrucksausdrucksausdrücke dauert ≥2 h in Abhängigkeit von den Expressionsvektorelementen (Abbildung 1Cund weitere Erläuterung in der Diskussion). Die Bildgebung von perlenbeladenen Zellen kann an jedem Mikroskop durchgeführt werden, das mit den geeigneten Fluoreszenzquellen ausgestattet ist, die mit geladenen Sonden verbunden sind, einer Kamera, die fluoreszenzbilder aufnehmen kann, z. B. einem elektronenvermehrenden ladungsgekoppelten Gerät (EMCCD) oder einer wissenschaftlichen komplementären Metalloxidhalbleiterkamera (sCMOS), und einem Inkubator zur Kontrolle von Temperatur, Feuchtigkeit und Kohlendioxid. Eine Anleitung zur Fluoreszenzmikroskopie finden Sie unter 27.

Ergebnisse

Die häufigste Anwendung der Perlenbeladung besteht darin, eine oder mehrere Arten von Proteinen in anhaftende menschliche Zellen einzuführen. Um dies zu veranschaulichen, wurden die Zellen mit einer Lösung aus einem Cy3- und Alexa488-konjugierten Fab-Protein beladen. Obwohl nicht jede Zelle im Mikrobrunnen perlenbeladen war, hatten die Zellen, die geladen waren, fast immer sowohl Cy3- als auch Alexa488-markierte Proteine zusammen (Abbildung 2A). Nach einer früheren Schätzung, wenn 0,5 Mikrogramm Fab verdünnt in 4 Mikrolitern perlenbeladen29sind, wie in Abbildung 2A,wird jede Zelle mit etwa 106 Fab-Molekülen beladen.

Plasmid-DNA, die GFP (1 μg Plasmid-DNA, 1,8 μL einer 557 ng/μL-Lösung) und 0,5 μg Cy3-markiertes Fab kodiert, wurde ebenfalls über Perlenladung in die Zellen eingeführt und anschließend exprimiert und visualisiert(Abbildung 2B). Die GFP-Fluoreszenz zeigte, dass das GFP-kodierende Plasmid nicht nur in Zellen geladen, sondern auch exprimiert wurde. So kann in derselben Zelle eine Perlenbeladung eine Proteinsonde (z. B. Cy3-markiertes Fab) und ein Reporterplasmid (z. B. GFP) einführen, wie es in diesem Labor zuvor durchgeführt wurde22,23,24. Wir stellten fest, dass 40% der Zellen mit Fab-Protein beladen waren und 21% der mit Perlen beladenen Zellen das co-geladene Plasmid exprimierten, wie in den repräsentativen Sichtfeldern in Abbildung 2Bgezeigt. Typischerweise ist jede Kammer mit 1-2 μg Plasmid beladen, ungefähr die gleiche Menge wie die Lipofektion.

Perlenbeladene Zellen exprimieren sehr unterschiedliche Plasmide (Abbildung 2C, D). Um dies gezielt zu messen, haben wir den Fisher Ratio-Test verwendet, um die Verteilungen von Protein- und Plasmidintensitätsdaten zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Proteine 1 und 2 zwar ähnliche Intensitätsverteilungen aufwiesen (p = ~1), aber jedes Protein eine signifikant kleinere Verteilung als das Plasmid aufwies (p = 3,2e-6 und 1,8e-5). Obwohl dies auf die Variabilität der Anzahl der Plasmide pro Zelle zurückzuführen sein könnte, kann sich die größere Variabilitätsquelle aus den vielen Schritten ergeben, die für die Plasmidexpression erforderlich sind und wahrscheinlich stark zwischen den Zellen variieren, einschließlich des Imports in den Zellkern, der Transkription und der Translation. Im Gegensatz dazu hatten die Spiegel der mit Perlen beladenen Proteine eine leichte Zell-zu-Zell-Varianz, und die Spiegel von zwei gleichzeitig geladenen Proteinen waren stark miteinander korreliert (Abbildung 2D,E).

Die Plasmidexpression kann bereits 2-4 h nach der Perlenbeladung gesehen werden, kann aber später auftreten, je nachdem, wann eine optimale Plasmidexpression erreicht wird. Wir empfehlen, einen Zeitkurs durchzuführen, um das beste Ausdrucksfenster für ein bestimmtes Plasmid zu bestimmen, das sich über 2-24 Stunden nach dem Laden von Perlen erstreckt. Dies kann in einer Kammer mit langer Zeitrahmenbildgebung oder durch Perlenbeladung und Staffelung mehrerer Kammern erfolgen. Perlenbeladene Zellen bleiben haften und sind gesund genug, um zu wachsen und sich zu teilen. Perlenbeladene menschliche U2OS-Zellen wurden direkt vor, direkt nach und 24 Stunden nach dem Laden der Perlen abgebildet. Die richtige Perlenbeladung hatte fast keinen merklichen Einfluss auf die Anzahl der Zellen oder ihre Morphologie, wie in Abbildung 3A (links, Mitte) gezeigt.

Im Gegensatz dazu ist eine schlechte Wulstbelastung mit zu vielen Perlen und übermäßiger Abstichkraft in Abbildung 3Bdargestellt. Dies verursachte viel Zellverlust (große Flecken des Deckglases ohne Zellen und abgelöste, schwebende, unsympersaue Zellen), schlechte Zellmorphologie (Zellen, die aufgerundet und schlecht haftet erscheinen) und Perlenhaufen, die nach dem Laden von Perlen auf dem Deckglas verbleiben. Obwohl angenommen wird, dass Zellen während der Perlenbeladung mechanischen Schäden ausgesetzt sind, wuchsen und vermehrten sich die Zellen in der ordnungsgemäß perlenbeladenen Kammer, wie die erhöhte Anzahl von Zellen 24 h nach dem Laden der Perlen zeigt (Abbildung 3A, rechts). Die Wirkung auf die Zelllebensfähigkeit kann durch eine Vielzahl von Assays beurteilt werden, wie z. B. einen 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay, um Perlenbeladene mit Mock-geladenen Zellen zu vergleichen30. Darüber hinaus zeigen diese und frühere Arbeiten, dass die mit Perlen beladenen Zellen einer Zellteilung unterzogen werden (Abbildung 3C und ergänzendes Video 1), und der Zeitpunkt der Mitose wird nicht durch die Beulenbelastung31beeinflusst, was als weiterer Beweis für eine anhaltende Zellgesundheit nach der Perlenbeladung dient.

Das Laden von Perlen ist eine vielseitige Technik, die mehrere anhaftende Zelllinien und verschiedene Makromoleküle beherbergt. Hier wurde diese Vielfalt durch Laden von RPE1- und HeLa-Zelllinien mit Fab demonstriert (Abbildung 4A, B). Tabelle 1 enthält weitere Beispiele für die Beladung von Perlen in verschiedenen Zelllinien in diesem Labor und darüber hinaus und zeigt einige der nuancierten Unterschiede zwischen den Perlenladeprotokollen aus anderen Labors auf. Bemerkenswert ist, dass der Durchmesser der Glasperlen, die für die Beladung verwendet werden, zwischen den Laboratorien stark variiert, obwohl die effizienteste Belastung für kleine Perlen mit einem Durchmesser von 75 μm in mehreren Zelllinien gefunden wurde14. Darüber hinaus hat dieses Labor auch damit begonnen, RNA mit der Beulenladung von RNA zu beladen (Daten nicht gezeigt). Abbildung 4C zeigt eine repräsentative U2OS-Zellperle, die mit einem Cy5-RNA 9mer und Cy3-DNA 28mer zusammen beladen ist.

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Abbildung 1: Perlenladegerät, Technik und Zeitleiste Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2. Die Perlenbeladung führt zu einer geringen Variabilität der Proteinkonzentration, aber einer hohen Variabilität der Plasmidexpression. (A) Die Zellen wurden mit jeweils 0,5 μg Alexa488-konjugierter Anti-H3K27-Acetyl-Fab (grün) und Cy3-konjugierter Anti-RNAPII-Serin-5-phosphorylierter Fab (rot) in 4 μL Perlenladelösung beladen. Die Zellen wurden DAPI-gefärbt (blau) und dann sofort live abgebildet. Scale bars = 20 μm. (B) Die Zellen wurden mit 0,5 μg Fab-Protein (Cy3-konjugiertes Anti-RNAPII-Serin-5-phosphoryliertes Protein, rot) und 1 μg Plasmid-kodierender Superfolder GFP-H2B (grün) in 4 μL Perlenladelösung beladen. Nach 24 h wurden die Zellen DAPI-gefärbt (blau) und live abgebildet. Scale bars = 30 μm. (C-E) Protein 1 (JF646-HaloLigand-markiertes HaloTag-MCP), Protein 2 (Cy3-konjugiertes Anti-FLAG Fab) und ein Plasmid-kodierendes EGFP (λN-EGFP-LacZ) wurden zusammen in Zellen geladen. Die Gesamtintensität in jedem fluoreszierenden Kanal wurde in einem 1,3 x 1,3 μm Pflaster im Zytoplasma jeder Zelle gemessen. N = 25 Zellen. (C) Repräsentative Zellen, die das perlenbeladene Plasmid λN-EGFP-LacZ exprimieren. Für alle Zellen wurden die gleichen Bildbedingungen und -dichten verwendet. Flecken sind Aggregate des exprimierten Proteins. Skalenbalken = 10 μm. (D) Das Diagramm zeigt die Gesamtintensität jeder Zelle von Entweder Protein 1, Protein 2 oder EGFP, ausgedrückt aus dem Plasmid. Jeder Kanal wurde auf den Median normalisiert. Bonferroni-korrigierte P-Werte wurden durch den Fisher Ratio-Test berechnet, um festzustellen, ob die Verteilung der Protein- oder Plasmidintensitätsdaten die gleiche Variabilität aufweist. Jeder Punkt stellt eine Zelle dar. (E) Die Gesamtdicken für beide Proteine, Protein 1 und das Plasmid oder Protein 2 und das Plasmid, werden gegeneinander aufgezeichnet. BerechneteR2-Werte werden angezeigt. Jeder Punkt stellt eine Zelle dar. Abkürzungen: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindol; EGFP = verstärktes grün fluoreszierendes Protein; A.U. = beliebige Einheiten; MCP = MS2-Mantelprotein; RNAPII = RNA-Polymerase II. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Perlenbeladene Zellen bleiben adhärent und sind gesund genug, um zu wachsen und sich zu teilen. (A) U2OS-Zellen wurden mit 0,5 μg Cy3-konjugierter Anti-FLAG-Fab in 4 μL Perlenbeladungslösung beladen. Die Zellen wurden direkt vor, direkt nach dem Laden der Wulst und 24 Stunden nach dem Laden der Perlen abgebildet. Orangefarbene Pfeile kennzeichnen Bereiche, in denen sich Zellen während des Perlenladens ablösen. Maßstabsbalken = 2 mm. (B) Repräsentatives Bild von U2OS-Zellen, die mit Komponenten aus (A) beladen sind, aber mit hartem Klopfen und zu vielen Perlen. Der rote Pfeil kennzeichnet zusätzliche Glasperlen. Skalenleiste = 2 mm. (C) U2OS-Zellen wurden mit 1,5 μg des 14,4 kbp Plasmids smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2, 0,5 μg Cy3-konjugierter Anti-FLAG Fab (grün), 130 ng HaloTag-MCP (Magenta) in 8 μL Perlenladelösung beladen. Direkt vor der Bildgebung wurde der HaloTag mit JF646-HaloLigand gefärbt. Die MS2-Stammschleifen der mRNA, die aus dem Reporterplasmid transkribiert werden, werden durch MCP (Magenta-Flecken) markiert, und das FLAG-markierte übersetzte Reporterprotein wird durch Anti-FLAG Fab (grüne Kolokalisierung zu mRNA) markiert. Reifes Fab-markiertes Protein lokalisiert sich im Zellkern. Diese Zelle wurde 4-15 h nach dem Laden der Wulst abgebildet. Gelbe Pfeile identifizieren den Zellkern vor und die Kerne nach der Zellteilung. Maßstabsbalken = 5 μm. Abkürzung: MCP = MS2 coat protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Variationen des Zelltyp-Ladematerials des Perlenladeprotokolls. (A-B) RPE1 (A) und HeLa (B) Zellen wurden mit 1,5 μg eines nuklearen Fab-Proteins (Anti-RNAPII-Serin-5-Phosphorylierung) in 4 μL Ladelösung beladen. Der Zellkern (nuc) und das Zytoplasma (Cyto) sind markiert. Die Zellen wurden 6 h nach dem Beladen abgebildet. Schuppenbalken = 5 μm. (C) Menschliche U2OS-Zellen wurden mit Cy5-RNA 9mer (Magenta) und Cy3-DNA 28mer (grün) Oligos, jeweils 10 Picomole, in 4 μL Perlenladelösung beladen. Die Zellen wurden 4 h nach dem Beladen der Perle abgebildet. Alle Zellkerne werden durch eine gestrichelte Linie hervorgehoben. Maßstabsbalken = 5 μm. Abkürzungen: RNAPII = RNA polymerase II. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

ZelllinieZelltypEffektivität der PerlenbeladungAnmerkungen/Referenz
Stammzellen (human)Embryonale StammzellenSchwierig*Viele Zellen schälen sich während des Perlenladens ab, wenn sie auf gelatinebeschichteten Platten plattiert werden
HEK 293Menschliche embryonale NierenzellenSchwierig* Sie müssen vor dem Laden der Wulst eine Gelmatrix auf die Oberfläche der Bildkammer legen. Tippen Sie beim Laden der Wulst zunächst vorsichtig.
Neuronen (Ratte)Primäre embryonale Neuronen (e-18), dissoziiertSehr ineffizient*Eine effiziente Perlenbelastung von Neuronen wurde mit diesem Standard-Perlenladeprotokoll nicht beobachtet. Dies könnte auf die nicht adhärente Natur von Neuronen oder auf eine daraus resultierende Schädigung neuronaler Prozesse zurückzuführen sein.
MDCK (Hund)Madin-Darby-Nierenzellen von HundenSiehe McNeil und Warder (1987)14 * Perlenladung mit niedrigem Wirkungsgrad14
U2OS (Mensch)OsteosarkomStandard-Perlenladeprotokoll
HeLa (Mensch)GebärmutterhalskrebsStandard-Perlenladeprotokoll
RPE1 (Mensch)Mit hTERT verewigte EpithelzellenStandard-Perlenladeprotokoll
HFF (Mensch)Primäre VorhautfibroblastenSiehe Besteiro et al. (2009)31 * Modifiziertes Protokoll des Kippens anstelle des Tippens auf31
BALB/c 3T3, NIH 3T3 und Swiss 3T3 (Maus)Embryonale FibroblastenSiehe Gilmore und Romer (1996)32,Emerson et al. (2014)33 und McNeil und Warder (1987)14 *425–600 μm Glasperlen gemeldet32
*Gebrauchte 200–300 μm Glasperlen33
*75 μm Glasperlen lieferten bessere Ergebnisse als 400 μm14
DM (Indischer Muntjac)HautfibroblastenSiehe Manders, Kimura und Cook (1999)34
CHO (Hamster)Epithelartige EierstockzellenSiehe Memedula und Belmont (2003)35 *Gebrauchte 425–600 μm Glasperlen35
BAE (Rind)Bovine Aortenendothelzellen (BAEC-11)Siehe McNeil und Warder (1987)14 *75 μm Glasperlen lieferten bessere Ergebnisse als 400 μm14
PtK-2 (Potomus tridaclylis)EpithelnierenzellenSiehe McNeil und Warder (1987)14 *75 μm Glasperlen lieferten bessere Ergebnisse als 400 μm14
HUVEC (Mensch)Nabelvenen-EndothelzellenSiehe Gilmore und Romer (1996)32 *Gebrauchte 425–600 μm Glasperlen32
J774 und J774.2 (Maus)Monozyten-MakrophagenzellenSiehe Becker et al. (2005)36 und McNeil und Warder (1987)14 *Sanftes Rühren (statt Klopfen) und 425–600 μm Glasperlen36
MS-5 (Maus)KnochenmarkstromazellenSiehe Molenaar et al. (2003)37
WPE1-NB11 (Mensch)ProstataepithelzellenSiehe Gilmore und Romer (1996)32 und*Gebrauchte 425–600 μm Glasperlen32
Emerson et al. (2014)33 *Gebrauchte 200–300 μm Glasperlen33

Tabelle 1: Perlenbelastung in verschiedenen Zelllinien. Für die Zelllinien, die in diesem Labor noch nicht perlenbeladen wurden, werden Referenzen und Hinweise zu Variationen im Protokoll bereitgestellt.

Ergänzendes Video 1: Beispiel einer perlenbeladenen Zelle, die sich einer Zellteilung unterzieht. U2OS-Zellen wurden mit 1,5 μg des 14,4 kbp Plasmids smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2, 0,5 μg Cy3-konjugierter Anti-FLAG Fab (grün), 130 ng HaloTag-MCP (magenta) in 8 μL Perlenladelösung beladen. Direkt vor der Bildgebung wurde der HaloTag mit JF646-HaloLigand gefärbt. Die MS2-Stammschleifen der mRNA, die aus dem Reporterplasmid transkribiert werden, werden durch MCP (Magenta-Flecken) markiert, und das FLAG-markierte übersetzte Reporterprotein wird über Anti-FLAG Fab (grüne Kolokalisierung zu mRNA) markiert. Reifes Fab-markiertes Protein lokalisiert sich im Zellkern. Diese Zelle wurde 4-15 h nach dem Laden der Wulst abgebildet. Maßstabsleiste = 10 μm. Abkürzung: MCP = MS2 coat protein. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Diskussion

Die hier beschriebene Perlenbeladungstechnik ist eine kostengünstige und zeiteffiziente Methode, um Makromoleküle und andere Partikel in adhärente Zellen einzuführen. Dieser vielseitige Prozess kann Protein (Abbildung 2A)15,16,26,27, eine Kombination aus Protein und Plasmiden ( Abbildung2B,C)22,25,RNA ( Abbildung4C), 100 und 250 nm Polystyrolperlen (persönliche Korrespondenz), synthetische Farbstoffe39 oder Quantenpunkte34,40 . Die Bead-Beladung kann auch andere Arten von membrandurchlässigen Partikeln belasten. Seine am häufigsten verwendete Anwendung ist das Laden von Antikörpern oder Fabs, um endogene Epitope, wie post-translationale Modifikationen (PTMs), in lebende Zellen zu zielen. Targets, wie PTMs, sind in lebenden Zellen ohne etablierte PTM-spezifische, genetisch kodierte Sonden oft schwer zu kennzeichnen41,42. Im Gegensatz dazu kann das Laden von Perlen mehrere Arten von Sonden, Reportern oder anderen molekularen Werkzeugen zusammen in dieselbe Zelle einführen, um mehrere Auslesungen gleichzeitig zu überwachen. Wir gehen davon aus, dass das Laden von Perlen eine nützliche Technik zum Laden einer Vielzahl von Makromolekülen oder Partikeln sein wird.

Ein großer Vorteil der Perlenbeladung sind die geringen Kosten: Jedes Experiment kostet weniger als 0,01 USD. Ein Perlenladegerät kann leicht mit kostengünstigen Materialien hergestellt werden, die insgesamt ~ $ 150 kosten, was deutlich billiger ist als jede andere Zelllademethode. Die Kosten für ein Perlenladegerät können weiter auf unter 10 US-Dollar gesenkt werden, indem die wiederverwendbare Metallkammer durch eine Kunststoffkammer ersetzt wird. Bohren Sie dazu entweder ein Loch in eine 35-mm-Kammer oder entfernen Sie das Glas aus einer 35-mm-Glasbodenkammer, um das Netz dann sicher mit Klebeband zu befestigen. Anstelle einer Apparatur kann die Perlenbeladung sogar mit einer breit angelegten 1000 μL-Pipettenspitze durchgeführt werden, um Perlen auf Zellen zu schaufeln und zu streuen, obwohl diese Variation es schwierig macht, eine Monoschicht von Perlen auf Zellen zu streuen (Schritt 4.6).

Ein weiterer Vorteil der Perlenbeladung besteht darin, dass zellen die normale Gesamtmorphologie beibehalten, sich schnell erholen und weiter wachsen und sich teilen können, zumindest für die hier untersuchten U2OS-, RPE1- und HeLa-Zellen und für die anderen anderswo untersuchten Zelllinien(Abbildung 3; Abbildung 4A,B; Ergänzendes Video 1; und Tabelle 1)31. Während der Perlenbelastung unterliegen die Zellen körperlichem Stress und lösen sich manchmal ab und schälen sich (~ 5% der Zellen schälen sich unter optimalen Bedingungen, aber ein größerer Zellverlust kann auftreten, wenn die Perlenbeladung zu stark durchgeführt wird oder zu viele Glasperlen auf die Zellen geladen werden, wie in Abbildung 3Bdargestellt). Perlenbeladene Zellen, die an der Decke befestigt bleiben, erscheinen jedoch in der Regel gesund und können bereits 30 Minuten nach dem Laden der Perle abgebildet werden (Abbildung 3A). Wir erlauben den Zellen im Allgemeinen eine 30-minütige Erholungsphase, gehen aber davon aus, dass eine frühere Bildgebung nach dem Laden von Perlen möglich ist.

Ein großer Nachteil dieser Technik ist, dass die Zellen in der Lage sein müssen, leichten körperlichen Belastungen während der Belastung standzuhalten und sicher am Abdeckrutsch festzuhalten. Schlecht/nicht adhärente Zelllinien oder Zellen, die auf beschichteten Platten gezüchtet wurden (z. B. HEK und Stammzellen), lösen sich oft beim sanften Klopfen während der Perlenbeladung. Darüber hinaus hat die Erfahrung gezeigt, dass primäre Neuronen zu empfindlich für die Perlenbelastung sind.

Die Perlenbeladung eignet sich am besten für Einzelzell- oder Einzelmolekülexperimente. Nach unserer Erfahrung hat die Perlenbeladung eine Proteinbeladungseffizienz von etwa 20-40%, und ~ 20% der perlenbeladenen Zellen exprimierten auch ein co-geladenes Plasmid (Abbildung 2A, B). Daher können Perlenladeplasmide für die Proteinexpression weniger effizient sein als Perlenlader gereinigte Proteine, da Plasmide nicht nur in Zellen eindringen, sondern auch exprimiert werden müssen (was unter anderem Kernimport, Transkription und Translation beinhaltet, von denen jede die Expressionseffizienz verringern kann). Die geringe Effizienz der perlenbeladenen Plasmidexpression kann durch die Verwendung alternativer Transfektionsprotokolle wie Lipofektion vor perlenbeladenen Proteinen oder Sonden16,27umgangen werden. Darüber hinaus kann die Inkubation von Zellen in optimalen Medien für 30 Minuten vor dem Laden der Perlen die Plasmidexpression unterstützen. Aufgrund der geringen Plasmidexpression wurde die Perlenbelastung in diesem Labor nicht oft als Alternative zur lipofektionsbasierten Transfektion verwendet. Die einzige Ausnahme ist, wenn ein gereinigtes Protein, wie Fab, mitbeladen werden soll, in diesem Fall ist es sehr praktisch, das Protein und das Plasmid gleichzeitig mit Perlen zu laden. Darüber hinaus kann die Perlenbelastung für Zellen, die nicht auf Lipofektionen reagieren oder diese nicht verträglich sind, eine alternative, wenn auch wenig effizienter Methode für die transiente Plasmidexpression bieten.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken den Mitgliedern des Stasevich-Labors für unzählige Gespräche, die dazu beigetragen haben, dieses Protokoll zu verbessern und weiterzuentwickeln. Insbesondere Dr. Linda Forero und Dr. Phil Fox für Ratschläge zum Laden verschiedener Zelltypen. Wir möchten Dr. Yoko Hayashi-Takanaka, Dr. Yuko Sato und Dr. Hiroshi Kimura herzlich für die Weitergabe ihres Glasperlenladeprotokolls danken. Wir sind Dr. Ashok Prasad und Dr. Diego Krapf sehr dankbar, dass sie ihre Perlenladeprotokolle für die Einführung anorganischer Partikel in Zellen großzügig geteilt haben. Wir danken Dr. Travis Sanders, Craig Marshall und Dr. Thomas Santangelo für die großzügige Weitergabe ihres markierten RNA-Reagenzes. ALK, MNS, CAC, GG und TJS wurden durch den National Institutes of Health (NIH) Grant R35GM119728 und den National Science Foundation (NSF) CAREER Grant MCB-1845761 unterstützt, beide an TJS. CAC wurde auch durch den NSF NRT Award DGE-1450032 unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm cell culture dishesVWR82050-916Use to culture cells
35 mm cell culture dishesFalcon353001Use to construct bead loader
Attofluor Cell ChamberThermo Fisher ScientificA7816Use to construct the custom bead loader
DMEM, high glucose, no glutamineThermo Fisher Scientific11960069Use in general cell culture
Drierite Indicating AbsorbentsThermo Fisher Scientific07-578-3BStore the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets
Fetal Bovine SerumAtlas BiologicsF-0050-AUse in general cell culture and as a supplement before bead loading
Glass beads, acid washed, ≤106 µm*Millipore SigmaG4649Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glassMatTek CorporationP35G-1.5-14-CSeed cells onto these chambers for imaging
L-Glutamine-200 mMThermo Fisher Scientific25030081Use to make DMEM + media
Opti-MEM, Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step)
ParafilmVWR52858-032waxy film used to construct bead loader
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140-122Use to make DMEM + media
Phenol-free DMEMThermo Fisher Scientific31053036Use on cells before imaging
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9625Working stock of sterile 1X PBS
Sodium Hydroxide (NaOH)Thermo Fisher ScientificS318-500Use 2 M solution to wash glass beads
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm openingSpectrum Labs148496Use to construct bead loader
TrypsinThermo Fisher Scientific25300062Use in general cell culture

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