Il modello di ratto 6-idrossidopamina della malattia di Parkinson

Riepilogo

Il modello 6-idrossidopamina (6-OHDA) è stato utilizzato per decenni per far progredire la comprensione della malattia di Parkinson. In questo protocollo, dimostriamo come eseguire lesioni nigrostriatali unilaterali nel ratto iniettando 6-OHDA nel fascio proencefalico mediale, valutare i deficit motori e prevedere le lesioni utilizzando il test di stepping.

Abstract

I sintomi motori della malattia di Parkinson (PD) - bradicinesia, acinesia e tremore a riposo - sono conseguenze della neurodegenerazione dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta (SNc) e nel deficit striatale dopaminergico. I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per simulare la patologia umana in laboratorio. I roditori sono i modelli animali più utilizzati per pd grazie alla loro facilità di manipolazione e manutenzione. Inoltre, l'anatomia e i meccanismi molecolari, cellulari e farmacologici del PD sono simili nei roditori e negli esseri umani. L'infusione della neurotossina, 6-idrossidopamina (6-OHDA), in un fascio proencefalico mediale (MFB) di ratti riproduce la grave distruzione dei neuroni dopaminergici e simula i sintomi del PD. Questo protocollo dimostra come eseguire la microiniezione unilaterale di 6-OHDA nell'MFB in un modello di RATto di PD e mostra i deficit motori indotti da 6-OHDA e le lesioni dopaminergiche previste attraverso il test di stepping. Il 6-OHDA causa una significativa compromissione del numero di passaggi eseguiti con l'arto anteriore controlaterale.

Introduzione

Le principali caratteristiche neuropatologiche del PD sono la neurodegenerazione cronica progressiva dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta (SNc) e la presenza di corpi di Lewy contenenti α-sinucleina1. Poiché i neuroni dopaminergici SNc proiettano i loro assoni nello striato attraverso la via nigrostriatale, la neurodegenerazione dei neuroni in SNc provoca un deficit dopaminergico nello ^striato2. L'assenza di dopamina nello striato provoca uno squilibrio nelle attività delle vie di controllo motorio dirette e indirette, che è responsabile dei principali sintomi motori del PD: acinesia (movimento lento), bradicinesia (difficoltà nei movimenti iniziali), rigidità muscolare e tremore a riposo3,4,5.

Poiché i meccanismi molecolari e fisiologici coinvolti nell'insorgenza del PD non sono ancora completamente compresi, i principali trattamenti attualmente disponibili cercano di alleviare i sintomi motori attraverso farmacoterapie, stimolazione cerebrale ^profonda6,7, terapie ^genetiche8 e trapianto di ^cellule9. Pertanto, la ricerca preclinica è fondamentale per chiarire i meccanismi coinvolti nell'insorgenza della PD e scoprire nuove metodologie per la diagnosi precoce e nuove terapie per prevenire o fermare la degenerazione dei neuroni affetti da ^PD10.

I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per simulare la patologia umana in laboratorio, contribuendo al progresso della medicina e della scienza11,12,13,14. Tuttavia, è essenziale sottolineare che la scelta corretta del modello animale è fondamentale per il successo dello studio. Pertanto, il modello animale deve essere validato in tre aspetti principali: i) validità facciale, in cui il modello animale deve avere le caratteristiche della patologia umana; ii) validità costruttiva, in cui il modello animale deve avere una solida base teorica; e iii) validità predittiva, in cui i modelli animali devono rispondere ai trattamenti in modo simile al trattamento clinico.

Attualmente, diversi animali sono usati come modelli animali per PD. I gruppi principali includono mammiferi, come roditori, primati, minipig, cani e gatti e altri gruppi come drosophila e zebrafish. I roditori sono il modello animale più classico per PD e il più utilizzato per la loro facilità di manipolazione e manutenzione. Inoltre, l'anatomia e i meccanismi molecolari, cellulari e farmacologici del PD sono simili nei roditori e negli esseri ^umani15.

Una revisione pubblicata da Kin e colleghi nel 2019 ha analizzato le principali metodologie di modelli animali utilizzate per il PD negli anni 2000 e ha scoperto che il modello animale più utilizzato coinvolgeva neurotossine come la 6-idrossidopamina (6-OHDA) e l'1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP). Entrambe le neurotossine causano disregolazione mitocondriale nei neuroni dopaminergici nella via nigrostriatale, portando alla morte ^cellulare16. Un altro modello ampiamente utilizzato prevede la manipolazione genetica attraverso la mutazione in geni specifici coinvolti nell'insorgenza della PD, causando la disregolazione ^{mitocondriale17}. I modelli di neurotossina sono comunemente usati per valutare e confrontare le terapie, mentre i modelli genetici sono usati per studiare lo sviluppo di terapie preventive e ^PD15 idiopatiche.

La neurotossina MPTP è stata scoperta per causare parkinsonismo a metà degli anni 1980 dopo che sette pazienti hanno usato la sostanza e hanno mostrato gravi sintomi di PD. Oltre ai sintomi, i pazienti hanno risposto al trattamento con L-DOPA, che ha fatto sì che i ricercatori collegassero la molecola direttamente al PD. Dopo che il caso è stato pubblicato nel 1986, diversi ricercatori hanno iniziato a utilizzare MPTP nella ricerca preclinica sul ^PD18. I ricercatori hanno scoperto che essendo una molecola lipofila, MPTP può attraversare la barriera emato-encefalica (BBB) ed essere convertito in MPP ^{+ 19}. Questa sostanza tossica si accumula all'interno dei neuroni e provoca danni al complesso 1 della catena respiratoria mitocondriale, portando alla morte dei neuroni ^{dopaminergici20}.

Il modello di neurotossina 6-OHDA è stato utilizzato per la prima volta per indurre la degenerazione dei neuroni monoamminici della via nigrostriatale nel ¹⁹⁶⁸²¹. Il modello 6-OHDA è comunemente usato per causare neurodegenerazione nella via nigrostriatale in quanto è un analogo della dopamina e tossico per le cellule contenenti catecolamine. Dopo che il 6-OHDA entra nel cervello, può essere assorbito dal trasportatore della dopamina (DAT) nei neuroni dopaminergici, portando alla degenerazione della via nigrostriatale22. Poiché il 6-OHDA non penetra nella BBB, deve essere somministrato direttamente attraverso l'iniezione stereotassica intracerebrale23. Un inibitore della ricaptazione della noradrenalina è spesso combinato con la microiniezione 6-OHDA per preservare le fibre noradrenergiche e fornire una degenerazione più selettiva dei neuroni dopaminergici24.

Dopo che il DAT assume 6-OHDA, si accumulerà nel citosol dei neuroni, producendo specie reattive dell'ossigeno (ROS) e portando alla morte ^cellulare15. Vengono frequentemente utilizzati tre diversi modelli di lesioni di 6-OHDA: i) lesioni alla ^SNc25,26; ii) lesioni allo ^striato27,28; iii) lesioni al ^MFB29,30. Le lesioni causate nello striato provocano una degenerazione lenta e retrograda dei neuroni dopaminergici in SNpc. Al contrario, le lesioni causate in SNpc e MFB provocano una degenerazione rapida e totale dei neuroni, portando a sintomi parkinsoniani più ^avanzati31.

L'iniezione unilaterale o bilaterale di 6-OHDA può causare neurodegenerazione nei neuroni dopaminergici. 6-OHDA non sempre causa gravi danni ai neuroni; a volte, l'iniezione provoca danni parziali, che viene anche utilizzato per simulare le prime fasi di ^PD32. L'iniezione unilaterale è più comunemente usata a causa della capacità del modello di valutare i deficit motori dell'animale e prevedere la perdita cellulare attraverso test come la rotazione indotta da anfetamine / apomorfina e il test di ^stepping29. Le iniezioni bilaterali sono più utilizzate per valutare la memoria spaziale e il ^{riconoscimento33}.

Il test di rotazione indotto da anfetamine / apomorfina è un test comportamentale comunemente usato per prevedere la perdita cellulare nella via nigrostriatale. È definito come un processo in cui la somministrazione ripetuta di agonisti della dopamina porta ad un'intensificazione del comportamento rotazionale in animali 6-OHDA-lesionati34. Il comportamento rotazionale consiste nel quantificare la rotazione ipsilaterale indotta dalle anfetamine o le svolte controlaterali indotte dall'apomorfina nei roditori unilateralmente lesionati. Il comportamento rotazionale indotto da farmaci è stato criticato perché la rotazione non corrisponde ai sintomi del PD negli esseri umani e può essere influenzata da variabili come tolleranza, sensibilizzazione e "priming"³⁵.

L'adescamento è uno dei fattori più critici in questi test comportamentali. Sono stati riportati alcuni casi in cui una singola dose di L-DOPA ha portato a un fallimento nei comportamenti ^{rotazionali36}. Inoltre, un altro fattore critico correlato all'applicazione combinata del test indotto dalle anfetamine e del test indotto dall'apomorfina per uso parallelo è che misurano diversi endpoint a causa di diversi meccanismi d'azione, riflettendo l'inattivazione di diversi meccanismi e percorsi di segnalazione. Inoltre, il test indotto dalle anfetamine è più accurato per misurare le lesioni nigrostriatali superiori al 50-60%, mentre il test indotto dall'apomorfina è più accurato per le lesioni superiori all'80%³⁷.

Il test di passo è emerso come un test comportamentale che indica deficit legati alla degenerazione neuronale dopaminergica e agli effetti terapeutici. Consente l'analisi dell'acinesia causata da una lesione 6-OHDA nei neuroni dopaminergici senza una procedura indotta da farmaci. Inoltre, il test è stato ben consolidato e comunemente usato dal 1995, quando è stato descritto per la prima volta da Olsson et ^al.35. Nel 1999, Chang et ^al.38 hanno anche analizzato e confrontato le prestazioni dei ratti nel test di stepping con il livello di degenerazione causato da 6-OHDA e hanno scoperto che gli animali che hanno ottenuto risultati peggiori nel test di stepping avevano anche una degenerazione più significativa dei neuroni dopaminergici.

Il test di stepping è un metodo eccellente per prevedere un grave danno nigrostriatale dopaminergico nei ratti 6-OHDA-lesionati. L'evidenza suggerisce che i deficit motori compaiono nell'arto anteriore controlaterale dell'infusione di 6-OHDA durante il test di stepping quando il grado di perdita dopaminergica in SNc è >90%³⁹. Questo documento descrive i protocolli, le metodologie e i materiali utilizzati per eseguire la chirurgia stereotassica per l'infusione unilaterale di 6-OHDA nell'MFB dei ratti e come prevedere le lesioni dopaminergiche causate dalla tossina attraverso il test di stepping.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali hanno seguito i principi etici del Consiglio nazionale per il controllo della sperimentazione animale (CONCEA) e la legge Arouca (legge 11.794/2008) e sono state approvate dal comitato etico locale (CEUA-FFCLRP/USP (18.5.35.59.5).

1. Preparazione di farmaci

1. Anestesia con ketamina/xilazina
   NOTA: La dose di ketamina utilizzata è di 70 mg/kg e la dose di xilazina è di 10 mg/kg.
   1. Per preparare 1 mL di anestetico utilizzando soluzione di ketamina 100 mg/mL e soluzione di xilazina 20 mg/mL, combinare 0,35 mL di soluzione di ketamina, 0,25 mL di soluzione di xilazina e 0,4 mL di soluzione salina sterile allo 0,9%. Somministrare la soluzione anestetica ad un volume finale di 2 ml/kg.
      NOTA: La ketamina insieme alla xilazina può produrre sedazione per 60-80 minuti. Se l'animale ha ancora riflessi (ad esempio, beccheggio della zampa posteriore e/o riflesso lampeggiante), somministrare un ulteriore 10% della dose individuale.
2. Imipramina
   NOTA: La dose individuale di imipramina utilizzata è di 20 mg/kg.
   1. Per preparare 1 mL di soluzione di imipramina 20 mg/mL, combinare 20 mg di imipramina e 1 mL di soluzione salina sterile allo 0,9%. Somministrare la soluzione di imipramina ad un volume finale di 1 ml/kg.
3. Meloxicam
   NOTA: La dose individuale di meloxicam utilizzata è di 1 mg/kg.
   1. Per preparare 1 mL di soluzione di meloxicam 1 mg/mL, combinare 0,05 mL di meloxicam al 2% e 0,95 mL di soluzione salina sterile allo 0,9%. Somministrare la soluzione di meloxicam ad un volume finale di 1 ml/kg una volta al giorno per due giorni.
4. Acido ascorbico 0,1%
   1. Per preparare 1 mL di acido ascorbico allo 0,1%, combinare 1 mg di acido ascorbico e 1 mL di soluzione salina sterile allo 0,9%.
5. 6-idrossidopamina (6-OHDA)
   NOTA: 6-OHDA è una neurotossina utilizzata per distruggere selettivamente i neuroni dopaminergici e noradrenergici nel cervello. Evitare il contatto diretto con la pelle e le mucose degli occhi, del naso e della bocca. Quando si maneggia 6-OHDA, indossare doppi guanti in nitrile, camice da laboratorio, camice monouso, protezione per gli occhi e maschera chirurgica o visiera. Il volume totale di infusione della tossina è di 4 μL/animale e la quantità individuale è di 10 μg di 6-OHDA/animale.
   1. Per preparare 1 mL di 6-OHDA ad una concentrazione finale di 2,5 mg/mL, mescolare 2,5 mg di 6-OHDA e 1 mL di soluzione salina allo 0,9% contenente acido ascorbico allo 0,1% (descritto sopra).
      NOTA: 6-OHDA è sensibile alla luce e si degrada più velocemente se esposto a luce intensa. Deve essere opportunamente maneggiato e conservato in un ambiente protetto dalla luce. Se il colore della soluzione è rossastro, scartarlo.
6. Lidocaina cloridrato (2%)
   1. Preparare la soluzione di lidocaina al 2% per l'applicazione locale all'animale.
      NOTA: La dose massima che può essere applicata è di 7 mg/kg.
7. Sospensione poli-antibiotica
   NOTA: La sospensione poli-antibiotica con streptomicine e penicilline (vedi Tabella dei Materiali) deve essere preparata al momento dell'applicazione con l'intero volume di diluente, la cui fiala accompagna il flaconcino con la polvere.
   1. Rimuovere il disco metallico sul tappo di gomma. Disinfettare il tappo di gomma con alcool.
   2. Utilizzando una siringa con un ago da 23 G, iniettare il diluente nel flaconcino. Rimuovere l'ago e agitare vigorosamente il flaconcino fino a quando la sospensione non sarà completamente omogeneizzata. Iniettare un po' d'aria nel flaconcino e prelevare il volume desiderato di sospensione.
   3. Somministrare un'iniezione intramuscolare profonda, tirando lo stantuffo prima di iniettare il farmaco per assicurarsi che non venga raggiunto alcun vaso sanguigno.
      NOTA: il volume finale della sospensione da applicare è di 0,5 ml/kg.

2. Preparazione dei materiali

NOTA: seguire sempre le istruzioni fornite con la scheda di dati di sicurezza del materiale durante la manipolazione di sostanze chimiche.

1. Apparecchi stereotassici
   1. Posizionare il dispositivo stereotassico su una panca stabile e pulita con un'illuminazione adeguata per eseguire l'intervento chirurgico. Disinfettare l'apparecchio con il 70% di etanolo.
   2. Controllare se le barre auricolari e incisive del dispositivo sono allineate correttamente. Posizionare una coperta termica in cui l'animale verrà posizionato durante l'intervento chirurgico per rimanere al caldo durante la procedura. Monitora la temperatura dell'animale con una sonda rettale accurata.
      NOTA: La coperta termica deve essere a 37,5 °C in modo che l'animale mantenga una temperatura corporea di 37 °C corporea.
2. Sistema di microinfusione
   1. Riempire (70-80%) una siringa Hamilton (50 μL o come desiderato) attaccata a un microtubing in polietilene di grado medico e un ago con acqua doppia distillata (_ddH2O) e verificare la presenza di perdite attraverso il sistema.
   2. Aspirare l'aria attraverso il sistema in modo che una singola bolla d'aria separi il _ddH2O nella siringa dalla soluzione 6-OHDA nel microtubo.
      NOTA: Questa procedura evita di contaminare la siringa hamilton con 6-OHDA e consente l'uso di più ratti nello stesso giorno sperimentale.
   3. Posizionare la siringa Hamilton sulla pompa di infusione in modo che sia saldamente fissata e che lo stantuffo della siringa sia parallelo al telaio che si muoverà per spingerlo. Impostare la pompa di infusione a una velocità di 0,5 μL/min in modo che l'applicazione totale di 4 μL di 6-OHDA duri per 8 min. Testare il sistema di infusione confermando che non ci sono perdite e che l'infusione avviene in base al tempo e al volume precedentemente impostati.
   4. Fissare l'ago per infusione attaccato al microtubo all'apparecchio all'estremità del braccio stereotassico e controllare che l'ago sia posizionato con un angolo di 180° rispetto alla superficie. Assicurarsi che l'ago sia dritto e non piegato.
      NOTA: Controllare attentamente tutte le procedure descritte perché se uno qualsiasi degli elementi nel sistema di infusione non funziona correttamente, potrebbe compromettere il successo dell'intervento chirurgico.
3. Sutura
   1. Utilizzare una sutura sterile in nylon non assorbibile con un ago a 3/8 cerchi per suturare l'incisione dopo l'intervento chirurgico.
4. Sito di recupero postchirurgico
   1. Posizionare una scatola di alloggiamento pulita e sterilizzata in cui gli animali possono essere monitorati fino a completo recupero (reattivo al tatto e alla manipolazione). Metti una coperta termica nella scatola per la termoregolazione.
      NOTA: poiché la termoregolazione è importante, includere una fonte di calore supplementare per mantenere la temperatura corporea, se necessario.

3. Procedura chirurgica

NOTA: In questo protocollo, i ratti maschi adulti Sprague-Dawley (200-250 g) sono stati tenuti in condizioni controllate di temperatura (22 ± 2 °C), ricambio d'aria (15-20 scambi/ora) e cicli luce-buio (12 h/12 h), raggruppati in scatole con 3 o 4 animali, con libero accesso a cibo e acqua.

1. Pesare gli animali per monitorare le variazioni di peso nei giorni successivi all'intervento. Calcolare la dose di farmaci da somministrare.
2. Somministrare imipramina per via intraperitoneale 30 minuti prima dell'intervento chirurgico (~ 10-15 minuti prima di somministrare l'anestesia), utilizzando un ago da 27 G e una siringa da 1 mL.
   NOTA: L'imipramina bloccherà il trasportatore della noradrenalina (NAT) e impedirà l'assorbimento di 6-OHDA da parte dei neuroni noradrenergici, rendendo la lesione più selettiva per i neuroni dopaminergici40.
3. Dopo 10-15 minuti dalla somministrazione di imipramina, somministrare l'anestesia intraperitoneale ketamina/xilazina utilizzando un ago da 27 G e una siringa da 1 mL. Attendere che l'animale sia completamente anestetizzato. Verificare che l'animale sia in anestesia profonda quando l'animale non risponde al pizzicamento della zampa posteriore e non mostra un riflesso lampeggiante.
4. Radere la pelliccia del ratto nella regione della testa in cui si verificherà l'incisione.
5. Posizionare il ratto nell'apparato stereotassico.
   1. Posizionare la testa sopra la barra incisiva e fissare la barra 3,3 mm sotto la linea interaurale.
   2. Posizionare le barre auricolari, un lato alla volta. Posizionare la barra incisiva e le barre auricolari in modo che la parte superiore del cranio sia diritta e parallela alla superficie.
   3. Regolare il morsetto del naso e verificare che la testa sia ferma e non si muova su entrambi i lati.
6. Applicare un unguento oftalmico sterile agli occhi del ratto per evitare che le cornee si secchino.
7. Applicare povidone-iodio sulla zona da incidere per disinfettare il sito.
8. Applicare lidocaina locale per l'analgesia della regione di incisione; non superare i 7 mg/kg.
9. Somministrare il meloxicam per via sottocutanea utilizzando un ago da 27 G e una siringa da 1 mL.
   NOTA: Meloxicam è un analgesico antinfiammatorio non steroideo che aiuterà l'animale a recuperare dopo l'intervento chirurgico.
10. Somministrare la sospensione poli-antibiotica per via intramuscolare utilizzando un ago da 23 G e una siringa da 1 mL.
    NOTA: La sospensione poli-antibiotica viene somministrata come trattamento profilattico per evitare possibili infezioni batteriche nel recupero post-operatorio.
11. Controllare che l'animale sia in uno stato di anestesia profonda controllando i riflessi lampeggianti o i riflessi degli arti posteriori pizzicando la zampa posteriore con una pinzetta.
12. Con un bisturi, fare un'incisione di ~ 1,5 cm nella regione in cui si verificherà la microiniezione.
    NOTA: da questo punto vengono applicate tecniche sterili fino alla chiusura della ferita.
13. Pulire la regione del cranio con tamponi di cotone e cotton fioc fino a quando bregma e Lambda possono essere visti. Contrassegna il Bregma e il Lambda con una penna fine sterilizzata.
14. Verificare che le coordinate dorsale-ventrali (DV) di Bregma e Lambda siano simili. Se sono diversi, riadattare il ratto nell'apparato stereotassico poiché la testa del ratto non è posizionata correttamente.
15. Annotare le coordinate anteroposteriore (AP) e mediolaterale (ML) del Bregma.
16. Passare alle coordinate AP e ML dell'MFB destro secondo ⁴¹: AP: -4,3 mm, ML: 1,6 mm da Bregma.
17. Segna la regione della trapanazione con una penna fine sterilizzata.
18. Con un trapano sterilizzato, perforare lentamente il cranio dell'animale, facendo attenzione a non ferire la dura madre.
19. Posizionare l'ago di microiniezione sulla dura madre e annotare le coordinate DV. Prendi un ago sottile e rompi delicatamente la dura madre. Inserire l'ago nella coordinata DV (8,3 mm ventrale) dell'MFB, dove avverrà la microiniezione.
20. Azionare la pompa di microiniezione per rilasciare la soluzione 6-OHDA nell'MFB. Al termine della microiniezione, controllare la siringa Hamilton per vedere se sono stati iniettati 4 μL di 6-OHDA.
    NOTA: La microiniezione dovrebbe durare 8 minuti.
21. Dopo la somministrazione del 6-OHDA, attendere 10 minuti prima di rimuovere l'ago per evitare il riflusso del farmaco. Rimuovere lentamente l'ago per microiniezione dal cervello dell'animale.
22. Disinfettare nuovamente la regione di incisione con povidone-iodio.
23. Suturare l'area dell'incisione con ~ 3-4 nodi chirurgici.
    NOTA: Il nodo non deve essere troppo forte o troppo allentato.
24. Rimuovere il ratto dall'apparato stereotassico e metterlo in una scatola pulita per il recupero sulla coperta termica fino a quando l'animale non si è completamente ripreso dall'anestesia. Osservare l'animale ogni 15 minuti fino a quando non è completamente sveglio dall'anestesia.

4. Procedure postoperatorie

1. Monitorare il peso degli animali nei prossimi quattro giorni dopo l'intervento chirurgico. Trattarli con meloxicam per via sottocutanea una volta al giorno per due giorni dopo l'intervento chirurgico, regolando la dose per il peso di ogni giorno.
   NOTA: Tutti gli animali devono essere valutati per la necessità di analgesici il terzo giorno dopo l'intervento chirurgico.
2. Controllare le incisioni ogni giorno per almeno quattro giorni per assicurarsi che non siano infette. Cerca calore, gonfiore, dolore, secrezione e arrossamento fino a quando le incisioni non guariscono.
3. Controlla l'appetito e il consumo di acqua monitorando il peso corporeo dell'animale. Dare mangime umido per incoraggiare gli animali a mangiare. Osservare le condizioni generali del corpo, l'atteggiamento e la mobilità ogni giorno per almeno quattro giorni dopo l'intervento chirurgico. Rimuovere le suture 7-10 giorni dopo l'intervento chirurgico.
   NOTA: gli animali dovrebbero essere sottoposti a eutanasia se vengono raggiunti gli endpoint definiti nelle procedure etiche.

5. Test di stepping

1. Formazione
   NOTA: Gli animali devono essere addestrati per tre giorni prima del test. Secondo il protocollo descritto di seguito, l'allenamento dovrebbe avvenire due volte al giorno, una volta al mattino e una volta al pomeriggio, o con un intervallo di almeno 2 ore tra le sessioni. Tieni traccia del tempo utilizzando un timer.
   1. Giorno 1
      1. Nella prima sessione, maneggiare il ratto tenendolo in guanti per ~ 1-2 minuti per consentire al ratto di familiarizzare con il conduttore / sperimentatore.
      2. Nella seconda sessione, alternare tra tenere il ratto per 20 s e metterlo sul tavolo del protocollo per 20 s. Ripeti questa fase di allenamento per 3 minuti per familiarizzare il ratto con la configurazione sperimentale per il test di stepping.
   2. Giorno 2
      1. Nella prima sessione, posizionare entrambe le zampe anteriori del ratto sul tavolo del protocollo tenendo le zampe posteriori e la schiena con una mano. Inclinare il ratto verso il basso a testa in giù con un angolo di 45° rispetto alla superficie piana della tabella di protocollo. Muoviti orizzontalmente sul tavolo da un capo all'altro, permettendo al topo di calpestare il tavolo con entrambe le zampe (coprire 90 cm in 4 s). Tenere il topo in guanti per 10 s, permettendogli di riposare; ripetere questo schema per 3 minuti.
      2. Nella seconda sessione, posizionare una zampa anteriore del ratto sul tavolo del protocollo tenendo indietro l'altra zampa anteriore con una mano e tenere la schiena e le zampe posteriori del ratto con l'altra mano (vedere il punto 5.1.2.1). Muoviti orizzontalmente sul tavolo da un capo all'altro in 4 s, permettendo al topo di camminare con la sua zampa libera. Tenere il topo in guanti per 10 s, lasciandolo riposare, e ripetere con un'altra zampa anteriore, seguita dal periodo di riposo. Ripeti questo schema, alternando tra le due zampe anteriori e riposa per 3 minuti.
      3. Ripeti la fase di allenamento 3 volte per 1 minuto ciascuna.
   3. Giorno 3
      1. Nella prima sessione, seguire la procedura descritta nel passaggio 5.1.2.2 per una zampa anteriore. Ripetere con un'altra zampa anteriore, seguita dal periodo di riposo. Ripeti questo schema, alternando tra le due zampe anteriori e riposa per 3 minuti.
      2. Nella seconda sessione, seguire la procedura descritta al punto 5.1.2.2.
2. Test
   NOTA: Il test di stepping viene eseguito prima dell'intervento chirurgico, 2 e 4 settimane dopo l'intervento stereotassico, per valutare l'acinesia dell'arto anteriore controlaterale e la possibile lesione causata da 6-OHDA.
   1. Tenere il ratto ad un angolo di 45° rispetto alla superficie, immobilizzando gli arti posteriori e permettendo a uno solo degli arti anteriori di appoggiarsi sulla piattaforma, come spiegato sopra, per il giorno 3 di allenamento.
   2. Trascina il topo in avanti su una distanza di 90 cm in 4 s, con la zampa destra o sinistra appoggiata sulla superficie.
   3. Prendi appunti e quantifica il numero di passi di regolazione del dritto fatti con ogni zampa in ogni direzione.

Risultati

Valutazione della lesione dopaminergica
Il test di stepping consente la valutazione dell'acinesia dell'arto anteriore controlaterale alla lesione e la selezione di animali con una possibile lesione della via nigrostriatale indotta dall'infusione di 6-OHDA (Figura 1). Il confronto delle prestazioni del test di stepping dell'arto anteriore controlaterale pre-chirurgia e 2 settimane e 4 settimane dopo l'intervento ha rivelato un'interazione (_F2,74 = 93,63; p < 0,0...

Discussione

Questo documento descrive un protocollo per l'esecuzione di interventi chirurgici per microinfusione unilaterale di 6-OHDA nel MFB, in grado di causare lesioni robuste nei neuroni della via nigrostriatale e generare acinesia nell'animale. Viene inoltre descritto il protocollo per l'esecuzione del test di stepping, un test facilmente applicabile e non invasivo che può essere utilizzato per dimostrare il successo delle lesioni e valutare l'acinesia degli arti anteriori. Come presentato nei risultati rappresentativi, gli a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-OHDA	Sigma Aldrich	H4381	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt&region=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel _6-ohda-_-srpRecs3-1
70% Alcohol
Ascorbic acid	Sigma Aldrich	795437	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt&region=BR&gclid= Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09 _kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO 6yicaAot6EALw_wcB
Cotton
Drill or tap
Gauze
Hamilton syringe 50 uL	Hamilton	80539	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539
Imipramine	Alfa Aeser	J63723	https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/
Infusion pump	Insight	EFF-311	https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/
Ketamine (Dopalen)	Ceva		https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN
Machine for trichotomy
Meloxicam (Maxicam 2%  Ourofino)	Ourofino		https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/
Metal Disposal
Paper towels
Pentabiotic	Zoetis		https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx
Plastic waste garbage can
Poly-antibiotic	Pentabiotic (Wealth)
Povidone-iodine
Scalpel and blades
Scissors
Scraper
Stereotaxic apparatus	Insight	EFF-331	https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/
Sterile saline solution
Swabs
Temperature probe
Timer
Tweezers
Xylazine (Anasedan)	Ceva		https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN