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Resumen

Introducimos tres métodos de cultivo directo, cultivo de exposición directa y cultivo de exposición para evaluar la citocompatibilidad in vitro de materiales de implantes biodegradables. Estos métodos in vitro imitan diferentes interacciones célula-implante in vivo y se pueden aplicar para estudiar diversos materiales biodegradables.

Resumen

En las últimas décadas, los materiales biodegradables se han explorado ampliamente para aplicaciones biomédicas como implantes ortopédicos, dentales y craneomaxilofaciales. Para detectar materiales biodegradables para aplicaciones biomédicas, es necesario evaluar estos materiales en términos de respuestas celulares in vitro , citocompatibilidad y citotoxicidad. Las normas de la Organización Internacional de Normalización (ISO) se han utilizado ampliamente en la evaluación de biomateriales. Sin embargo, la mayoría de las normas ISO se establecieron originalmente para evaluar la citotoxicidad de los materiales no degradables, proporcionando así un valor limitado para el cribado de materiales biodegradables.

Este artículo presenta y discute tres métodos de cultivo diferentes, a saber, el método de cultivo directo, el método de cultivo de exposición directa y el método de cultivo de exposición para evaluar la citocompatibilidad in vitro de materiales de implantes biodegradables, incluidos polímeros biodegradables, cerámicas, metales y sus compuestos, con diferentes tipos de células. La investigación ha demostrado que los métodos de cultivo influyen en las respuestas celulares a los materiales biodegradables porque su degradación dinámica induce diferencias espaciotemporales en la interfaz y en el entorno local. Específicamente, el método de cultivo directo revela las respuestas de las células sembradas directamente sobre los implantes; el método de cultivo de exposición directa aclara las respuestas de las células huésped establecidas que entran en contacto con los implantes; y el método de cultivo de exposición evalúa las células huésped establecidas que no están en contacto directo con los implantes, pero están influenciadas por los cambios en el entorno local debido a la degradación del implante.

Este artículo proporciona ejemplos de estos tres métodos de cultivo para estudiar la citocompatibilidad in vitro de materiales de implantes biodegradables y sus interacciones con células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea (BMSC). También describe cómo cosechar, pasar, cultivar, sembrar, fijar, teñir, caracterizar las células y analizar los medios y materiales posteriores al cultivo. Los métodos in vitro descritos en este artículo imitan diferentes escenarios del entorno in vivo , ampliando la aplicabilidad y relevancia de las pruebas de citocompatibilidad in vitro de diferentes biomateriales para diversas aplicaciones biomédicas.

Introducción

Durante décadas, los materiales biodegradables han sido ampliamente estudiados y utilizados en aplicaciones biomédicas como aplicaciones ortopédicas1,2, dentales3,4 y craneomaxilofaciales5. A diferencia de los implantes y materiales permanentes, los metales biodegradables, la cerámica, los polímeros y sus compuestos se degradan gradualmente en el cuerpo con el tiempo a través de diferentes reacciones químicas en el entorno fisiológico. Por ejemplo, los metales biodegradables como las aleaciones de magnesio (Mg)1,6,7 y las aleaciones de zinc (Zn)8,9 son materiales prometedores para dispositivos de fijación ósea. Su biodegradabilidad podría eliminar la necesidad de cirugías secundarias para retirar los implantes después de la curación ósea. Las cerámicas biodegradables como los cementos de fosfato de calcio (CPC) han mostrado un potencial emocionante para el tratamiento de fracturas por compresión vertebral osteoporótica en la cifoplastia percutánea10. Los CPC proporcionan soporte mecánico para el cuerpo vertebral fracturado y se degradan gradualmente después de que la fractura se ha curado.

Los polímeros biodegradables, como algunos polisacáridos y poliésteres, también se han explorado ampliamente para aplicaciones biomédicas. Por ejemplo, el hidrogel de quitosano como polisacárido biodegradable ha demostrado sus capacidades para prevenir infecciones y regenerar el tejido de la piel11. El ácido poli-L-láctico (PLLA), el poli(ácido glicólico) (PGA) y el poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) son poliésteres ampliamente estudiados para la fabricación de andamios porosos 2D o 3D para aplicaciones de ingeniería de tejidos12,13,14. Además, los materiales compuestos integran dos o más fases de metales, cerámicas y polímeros para proporcionar funciones avanzadas para una amplia gama de aplicaciones biomédicas15,16,17. Por ejemplo, los compuestos de PLGA y fosfato de calcio se pueden utilizar para fabricar andamios biodegradables para aplicaciones como la reparación de defectos óseos del cráneo18. Estos andamios e implantes biodegradables podrían apoyar y promover el crecimiento de células y tejidos y luego degradarse gradualmente en el cuerpo con el tiempo.

Como se muestra en la Tabla Suplementaria 1, los diferentes materiales biodegradables pueden tener diversos mecanismos, productos y tasas de degradación. Por ejemplo, las aleaciones de magnesio, como Mg-2 % en peso de Zn-0,5 % en peso de Ca (ZC21)1, Mg-4 en peso de Zn-1 % en peso de Sr (ZSr41)19 y Mg-9 en peso de Al-1 % en peso de zinc (AZ91)20, se degradan al reaccionar con el agua, y sus productos de degradación incluyen principalmente iones Mg2+, iones OH, gas H2 y deposiciones minerales. La tasa de degradación de los metales biodegradables varía en función de sus diferentes composiciones, geometrías y entornos de degradación. Por ejemplo, Cipriano et al.19 informaron que los cables ZSr41 (Ø1,1 × 15 mm) perdieron un 85% de masa, mientras que los cables mg puros con la misma geometría perdieron un 40% de masa después de ser implantados en las tibias de rata durante 47 días. Los materiales cerámicos biodegradables como la hidroxiapatita (HA) y el fosfato β-tricálcico (β-TCP) pueden degradarse a través de la disolución líquida extracelular impulsada por la solución o descomponerse en pequeñas partículas y luego degradarse a través de la disolución líquida extracelular y los procesos de reabsorción mediados por células. Los productos de degradación de estas cerámicas a base de fosfato de calcio pueden incluir iones Ca2+, iones (PO4)3-, iones OH- y deposiciones minerales21. La tasa de degradación de las cerámicas de fosfato de calcio se ve afectada significativamente por sus estructuras cristalinas. Por ejemplo, Van Blitterswijk et al.22 informaron que la HA con 40 vol.% de microporos no perdió masa, mientras que β-TCP con 40 vol.% de microporos perdió 30 ± 4% de masa después de ser implantado en las tibias de conejos durante 3 meses. Los polímeros como PLGA14,23 pueden degradarse debido a la hidrólisis de los enlaces éster en presencia de agua, y los productos de degradación incluyen principalmente ácidos láctico y glicólico. El EGLP 50/50 puede tardar un mes y varios meses en lograr la degradación completa24.

La respuesta celular y las pruebas de citocompatibilidad son fundamentales para evaluar y examinar estos materiales de implantes biodegradables para aplicaciones biomédicas. Sin embargo, las normas actuales de la Organización Internacional de Normalización (ISO), como ISO 10993-5:2009 "Evaluación biológica de dispositivos médicos-Parte 5 Pruebas para la citotoxicidad in vitro", se diseñaron inicialmente para evaluar la citotoxicidad de biomateriales no degradables como aleaciones Ti y aleaciones Cr-Co in vitro25. Específicamente, ISO 10993-5: 2009 solo cubre las pruebas de citotoxicidad in vitro del extracto, las pruebas de contacto directo y las pruebas de contacto indirecto. En la prueba de extracto, el extracto se prepara sumergiendo muestras en fluidos de extracción como medios de cultivo con soluciones salinas séricas y fisiológicas bajo una de las condiciones estándar de tiempo y temperatura. El extracto o dilución recolectado se agrega al cultivo celular para estudiar la citotoxicidad. Para la prueba de contacto directo, el contacto directo entre la muestra y las células se logra colocando la muestra de prueba en la capa celular establecida (adherida). En la prueba de contacto indirecto, el medio de cultivo que contiene suero y agar derretido se pipetea para cubrir las células establecidas. La muestra se coloca sobre la capa de agar solidificado con o sin filtro.

Las normas ISO han mostrado algunas limitaciones cuando se aplican para evaluar materiales biodegradables in vitro. A diferencia de los materiales no degradables, los comportamientos de degradación de los materiales biodegradables son dinámicos y pueden cambiar en un momento diferente o en condiciones ambientales variadas (por ejemplo, temperatura, humedad, composición de medios y tipo de célula). La prueba de extracto solo evalúa la citotoxicidad de los productos de degradación del material y no refleja el proceso dinámico de degradación de la muestra. Tanto las pruebas de contacto directo como las indirectas de la norma ISO solo caracterizan las interacciones entre las células y muestras establecidas. Además, en la prueba de contacto indirecto, los materiales y las células se encuentran en diferentes microambientes que no reflejan el entorno in vivo y no capturan la degradación dinámica de los materiales biodegradables.

El objetivo de este artículo es introducir y discutir los métodos de prueba de citocompatibilidad para diversos materiales de implantes biodegradables para abordar las limitaciones mencionadas anteriormente de los métodos descritos en las normas ISO actuales. Los métodos presentados en este artículo consideran el comportamiento dinámico de degradación de los materiales de implante y las diferentes circunstancias de las interacciones célula-material in vivo. Específicamente, este artículo proporciona tres métodos de prueba de citocompatibilidad, a saber, cultivo directo, cultivo de exposición directa y cultivo de exposición para diversos materiales biodegradables, incluidos polímeros biodegradables, cerámicas, metales y sus compuestos para aplicaciones de implantes médicos.

En el método de cultivo directo, las células suspendidas en los medios de cultivo se siembran directamente en las muestras, evaluando así las interacciones entre las células recién sembradas y los implantes. En el cultivo de exposición directa, las muestras se colocan directamente sobre la capa celular establecida para imitar las interacciones de los implantes con las células huésped establecidas en el cuerpo. En el cultivo de exposición, las muestras se colocan en sus respectivos insertos de pozo y luego se introducen en los pozos de cultivo con células establecidas, lo que caracteriza las respuestas de las células establecidas a los cambios en el entorno local inducidos por la degradación del implante cuando no tienen contacto directo con los implantes. Los métodos de cultivo directo y cultivo de exposición directa evalúan las células directa o indirectamente en contacto con los materiales del implante en el mismo pozo de cultivo. El cultivo de exposición caracteriza las células indirectamente en contacto con los materiales del implante dentro de una distancia prescrita en el mismo pozo de cultivo.

Este artículo presenta una descripción detallada de las pruebas de citocompatibilidad para diferentes materiales biodegradables y sus interacciones con células modelo, es decir, células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea (BMSC). Los protocolos incluyen la cosecha, el cultivo, la siembra, la fijación, la tinción y la obtención de imágenes de las células, junto con análisis de materiales y medios de postcultivo, que se aplican a una variedad de materiales de implantes biodegradables y una amplia gama de tipos de células. Estos métodos son útiles para el cribado de materiales biodegradables para diferentes aplicaciones biomédicas en términos de respuestas celulares y citocompatibilidad in vitro.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California en Riverside (UCR) para la recolección de células y tejidos. Una rata Sprague-Dawley (SD) hembra de 12 semanas de edad se muestra como ejemplo en el video. Se prefieren las ratas hembras y machos más jóvenes.

1. Preparación del cultivo celular

NOTA: Los tres métodos de cultivo descritos en este artículo son generalmente aplicables para diferentes tipos de células que son adherentes. Aquí, los BMSC cosechados de destetes de rata se introducirán como ejemplo para la preparación de cultivos celulares. Dependiendo de su relevancia para aplicaciones médicas específicas, se pueden utilizar diferentes tipos de células, incluidas las células primarias cosechadas de animales o donantes humanos y las líneas celulares de un banco de células / tejidos.

  1. Cosecha de BMSCs de destetes de ratas
    NOTA: El diagrama esquemático de la Figura 1 muestra los pasos para cosechar BMSC de destetes de ratas.
    1. Sacrificar a la rata Sprague Dawley (SD) por inhalación de CO2 .
    2. Retire la piel, los músculos y los tejidos conectivos para diseccionar el fémur de la rata sacrificada. Coloque los huesos femorales en un tubo cónico de 15 ml (polipropileno) que contenga un medio de cultivo celular. Coloque los tubos cónicos sobre hielo hasta el momento de realizar la extracción celular.
      NOTA: La tibia también se puede utilizar para cosechar BMSC. El medio de cultivo celular es el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S).
    3. Transfiera los huesos a una placa de Petri en el gabinete de seguridad biológica. Cortar los extremos del hueso con una cuchilla quirúrgica y enjuagar la médula ósea en un tubo cónico de 50 ml (polipropileno) lavando la cavidad de la médula ósea con medios de cultivo celular con una jeringa con una aguja de 251/2 G.
      NOTA: Inserte una jeringa con una aguja de 18 G en el medio con médula ósea. Lenta y suavemente, tome y dispense los medios para romper el gran trozo de médula hasta que no haya aglomerados visibles de células / tejidos.
    4. Filtre la suspensión de la celda utilizando un filtro de 70 μm, seguido de centrifugación a 126 × g (1.000 rpm) durante 5 minutos para obtener los gránulos de la celda.
    5. Aspirar los medios sobrenadantes y reponer con 10 ml de medios frescos. Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspendir las células usando una pipeta serológica de 10 ml.
    6. Pipetee la suspensión directamente en la parte inferior interior de un matraz T-75 y agregue medios para llevar el volumen hasta 25 ml. Cultive las células en una incubadora en un entorno de cultivo celular estéril estándar (es decir, 37 °C, atmósfera humidificada con 5% de CO2 y 95% de aire).
    7. Después de 3-7 días, enjuague las células no adherentes aspirando el medio viejo y reabasteciendo con medio fresco. Continúe cultivando y alimentando las células con medio fresco hasta que estén listas para el paso celular, la congelación o el uso en un experimento.
  2. Mantenimiento celular
    1. Cambie el medio de cultivo celular regularmente para eliminar los productos de desecho celular y reponer los nutrientes aproximadamente cada dos días hasta que las células sean 90% -100% confluentes. Al 90% de confluencia, paso, congelación o uso de las células en un experimento.
    2. Células de paso
      NOTA: El pasaje, también conocido como subcultivo, es un término que se aplica siempre que las células se transfieren de un cultivo a otro. Las células recién cosechadas se encuentran en la etapa de paso 0 (P0). Las cantidades de solución de ácido tripsina-etilendiaminatetraacético (tripsina-EDTA) y los medios descritos en este artículo son para un matraz T-75.
      1. Revise las células bajo un microscopio óptico para confirmar que las células son 90% confluentes.
      2. Aspire el medio desde el matraz celular.
      3. Dispense 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en el matraz utilizando una pipeta serológica. Mecer suavemente el matraz para enjuagar las células con PBS; aspirar todo el PBS.
        NOTA: Este paso sirve como un enjuague adicional para garantizar que no se transfieran células muertas o desechos celulares durante el pasaje.
      4. Dispensar 3 ml de tripsina-EDTA en el matraz celular directamente sobre la superficie de las células. Balancee suavemente el matraz para asegurarse de que toda la superficie con las células esté cubierta por la tripsina-EDTA.
      5. Coloque el matraz celular con tripsina-EDTA en la incubadora durante 5 minutos para permitir que las células se separen.
      6. Después de 5 minutos en la incubadora, revise las células bajo un microscopio óptico para confirmar que las células están separadas. Si algunas células no se han desprendido, golpee suavemente el lado del matraz celular y vuelva a revisar el matraz.
      7. Añadir 9 ml de medio fresco al matraz celular para diluir la tripsina-EDTA. Esto proporciona proteínas más accesibles para que la tripsina-EDTA se una a las células en lugar de lisarlas.
      8. Pipetear las células en medios y tripsina-EDTA y dispensarlas en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células a 126 × g (1.000 rpm) durante 5 min.
      9. Sin perturbar el pellet celular, aspire el medio con tripsina-EDTA.
      10. Agregue 5-10 ml de medios frescos al tubo de la centrífuga y resuspenda suavemente las células en el medio utilizando una pipeta serológica de 10 ml.
      11. Pipetear las células suspendidas en medio fuera del tubo de la centrífuga y dividir el volumen en 2-3 matraces de cultivo fresco. Agregue suficiente medio para llevar el volumen medio total a 25 ml para cada matraz.
        NOTA: La proporción de división durante el subcultivo puede variar según los tipos de células y las características específicas de crecimiento.
      12. Revise las células bajo un microscopio óptico y colóquelas de nuevo en la incubadora.
    3. Congelar células
      1. Revise las células bajo un microscopio óptico para confirmar que las células son 90% confluentes.
      2. Repita los pasos 1.2.2.2 a 1.2.2.9.
      3. Añadir 900 μL de medio fresco al tubo de la centrífuga con una micropipeta de 100-1000 μL. Resuspend lenta y suavemente las células en medio utilizando la misma micropipeta.
      4. Transfiera la suspensión celular de 900 μL a un criovial. Añadir 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO).
      5. Tan pronto como sea posible, coloque el criovial en un recipiente de espuma cilíndrico diseñado para regular la disminución de la temperatura (consulte la Tabla de materiales). Coloque el recipiente de espuma en el congelador de -80 °C.
    4. Células de descongelación
      1. Descongele las células congeladas en el baño de agua. Tome un tubo cónico estéril de 15 ml lleno de 5 ml de medio fresco, coloque las células en el tubo cónico y centrífuga a 126 × g (1,000 rpm) durante 5 min.
      2. Aspire el medio que contiene DMSO.
      3. Agregue 5-10 ml de medio fresco al tubo cónico de células de 15 ml. Pipetear lenta y suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspendir las células.
      4. Pipetear las células suspendidas en medio del tubo cónico de 15 ml y dispensar en un nuevo matraz T-75. Al dispensar células, use un movimiento de barrido para distribuir las células de la manera más uniforme posible en la parte inferior del matraz celular.
      5. Agregue suficiente medio fresco para llevar el volumen medio total a 25 ml para cada matraz T-75.
      6. Revise las células bajo un microscopio óptico y vuelva a colocar el matraz celular en la incubadora.

2. Preparación y esterilización de muestras

  1. Preparación de muestras
    1. Use placas tratadas con cultivo de tejidos como placas de 6, 12, 24, 48 o 96 pocillos para los experimentos de cultivo celular descritos en este artículo. Seleccione el tipo de placas de cultivo de tejidos y el volumen de medio en cada pozo en función de diferentes diseños experimentales, como la dimensión de la muestra.
  2. Esterilizar o desinfectar todas las muestras biodegradables antes del cultivo celular.
    NOTA: La desinfección es aceptable para in vitro estudios cuando las muestras son propensas a cambios químicos y/o superficiales bajo algunas condiciones de esterilización que involucran altas temperaturas, oxidantes y/o radicales. Los métodos de esterilización o desinfección para diferentes tipos de muestras varían según las diferentes propiedades de los materiales, como polímeros, metales y cerámicas. El proceso de esterilización o desinfección podría involucrar calor, gas, radiación, productos químicos, alta presión o una combinación de estos.
    1. Metales biodegradables
      1. En general, utilice radiación ultravioleta (UV) para desinfectar metales biodegradables para estudios in vitro .
        NOTA: Por ejemplo, Zhang et al. informaron que las muestras de aleación de magnesio puro (Mg) y ZC21 Mg se desinfectaron bajo radiación UV durante 4 h antes de ser utilizadas en los estudios celulares1. Para los estudios in vivo , generalmente se requiere que las muestras sean esterilizadas. Para muchos metales biodegradables como el magnesio o las aleaciones de magnesio, se debe evitar el autoclave con vapor porque estas muestras podrían oxidarse o corroerse en agua6. Se recomienda un plato de cuarzo para la desinfección UV porque proporciona una mejor transparencia UV que la mayoría de los vasos y plásticos.
      2. Esterilizar muestras de aleación de Mg a fuego seco en un horno o autoclave en el rango de temperatura de 100-200 °C.
        NOTA: Como algunas aleaciones metálicas aún podrían oxidarse en la superficie a altas temperaturas en el aire, la radiación de alta intensidad puede usarse como alternativa en algunos casos. Sin embargo, la radiación de alta intensidad, como la radiación alfa o gamma, debe evitarse al esterilizar láminas metálicas delgadas. Puede causar desplazamiento del átomo dentro de los materiales, cambiando la microestructura de los materiales.
      3. Utilice la esterilización por gas de óxido de etileno (EtO) como método alternativo para metales biodegradables sensibles al calor y la radiación26.
    2. Cerámica biodegradable
      1. Generalmente, desinfecte las cerámicas biodegradables utilizando radiación UV o solución de etanol al 70% antes de los estudios in vitro .
        NOTA: Por ejemplo, Liu et al. informaron que las muestras de fosfato de calcio fueron desinfectadas mediante inmersión en etanol al 70% durante 1 h y exposición a luz UV durante 12 h en cada lado antes de ser utilizadas en pruebas de citocompatibilidad in vitro27.
      2. Utilice autoclaves para esterilizar cerámicas biodegradables si la alta temperatura y el vapor de agua no dañan sus compostajes y microestructuras.
        NOTA: Algunas cerámicas pueden verse afectadas por el autoclave. Por ejemplo, se encontró cambio de fase y rugosidad superficial cuando las cerámicas de zirconia estabilizadas en itria se esterilizaron en autoclave a 121 ° C durante 15 min. Además, los CPC no se pueden esterilizar mediante autoclave con vapor porque las muestras reaccionarán con el agua.
      3. Utilice métodos de esterilización alternativos como la radiación cobalto-60 para las cerámicas de zirconia estabilizadas con itrias antes mencionadas y muestras de CPC28.
    3. Polímeros biodegradables
      1. En general, desinfectar polímeros biodegradables utilizando radiación UV o etanol al 70% antes de utilizarlos en estudios celulares in vitro.
        NOTA: Algunos polímeros pueden sufrir cambios químicos bajo la radiación UV. Para la esterilización, se puede utilizar un tratamiento de rayos gamma como la radiación de cobalto-60. Por ejemplo, los polvos de almidón fueron esterilizados bajo radiación de Cobalto-60 antes de ser utilizados en estudios celulares in vitro29.
      2. Materiales poliméricos en autoclave que pueden soportar altas temperaturas y humedad.
        NOTA: Por ejemplo, los polímeros como el polipropileno se pueden esterilizar en autoclave, ya que pueden tolerar temperaturas de autoclave (es decir, 121-134 ° C). Algunos polímeros como la policaprolactona (PCL) no se pueden esterilizar en autoclave debido a sus puntos de fusión relativamente bajos (es decir, alrededor de 60 °C)30.
      3. Utilice gas EtO para esterilizar materiales poliméricos sensibles a la esterilización por calor o radiación.

3. Métodos de cultivo celular

  1. Métodos de cultivo directo
    Nota : el diagrama esquemático de la figura 2A muestra los pasos del método de referencia cultural directa. En este artículo, los BMSC se cultivaron en una placa derivada de Mg colocada dentro de los pocillos de una placa tratada con cultivo de tejidos de 12 pocillos como ejemplo para ilustrar el método de cultivo.
    1. Siga los pasos descritos en los pasos 1.2.2.1-1.2.2.10 para obtener la suspensión celular.
    2. Utilice un matraz confluente al 90% para determinar la concentración celular en la suspensión celular utilizando un hemocitómetro. Diluir la suspensión celular utilizando medio fresco a una concentración celular prescrita necesaria para el estudio celular in vitro.
      NOTA: La densidad de siembra de las células está determinada por el diseño experimental. Por ejemplo, se han utilizado densidades celulares de 2.000-40.000 células/cm2 en diferentes estudios celulares con materiales biodegradables.
    3. Coloque las muestras (placa de Mg) en el centro de las placas de cultivo de tejidos tratados con 12 pocillos. Secuencialmente, enjuague las placas de cultivo con 2 ml de PBS y 2 ml de DMEM para calibrar la presión osmótica en condiciones estériles. Agregue 3 ml de la suspensión celular diluida en cada pozo sobre las muestras de interés.
    4. Cultive las células en una incubadora en condiciones estándar de cultivo celular durante 24 h.
      NOTA: El tiempo de cultivo puede ser mayor o menor de 24 h dependiendo del diseño experimental.
  2. Cultivos de exposición directa
    NOTA: El diagrama esquemático de la Figura 2B muestra los pasos de la cultura de exposición directa.
    1. Como se describe en los pasos 3.1.1 y 3.1.2, prepare la suspensión celular con las concentraciones requeridas de células basadas en el diseño experimental para diferentes tipos de células y aplicaciones previstas.
    2. Enjuague las placas de cultivo con 2 ml de PBS y 2 ml de DMEM secuencialmente para calibrar la presión osmótica en condiciones estériles. Agregue 3 ml de la suspensión celular diluida en cada pocillo. Cultive las células en la incubadora humidificada en condiciones estándar de cultivo celular durante 24 h o hasta que las células alcancen el 50-80% de confluencia.
      NOTA: El nivel de confluencia celular puede variar para diferentes tipos de células y diseño experimental.
    3. Después de 24 h, enjuague las células en la placa del pozo con PBS usando una pipeta para eliminar las células muertas flotantes.
    4. Coloque las muestras desinfectadas o esterilizadas directamente sobre las células adheridas. Agregue 3 ml de medio fresco en cada pozo.
    5. Cultive las células en condiciones estándar de cultivo celular durante otras 24 h.
      NOTA: El tiempo de cultivo puede ser mayor o menor de 24 h dependiendo del diseño experimental.
  3. Cultivos de exposición
    NOTA: El diagrama esquemático de la figura 2C muestra los pasos del método de cultivo de exposición.
    1. Los pasos iniciales para la preparación celular son los mismos que el cultivo de exposición. Como se describe en los pasos 3.1.1 y 3.1.2, prepare la suspensión celular con las células deseadas. De manera similar a los pasos 3.2.1 y 3.2.2, sembrar las células en la placa del pozo a la densidad deseada y cultivarlas en una incubadora en condiciones estándar de cultivo celular durante 24 h.
    2. Después de 24 h, enjuague las células adherentes con PBS para eliminar las células muertas flotantes, seguido de la adición de 3 ml de medio fresco en cada pozo.
    3. Después, coloque las muestras en los insertos de pozo con un tamaño de poro de membrana de 0,4 μm y coloque los insertos de pozo con las muestras en cada pozo con las células.
    4. Cultive las células en condiciones estándar de cultivo celular durante otras 24 h.
      NOTA: El tiempo de cultivo puede ser mayor o menor de 24 h dependiendo del diseño experimental.

4. Caracterización postcultivo de células

NOTA: Para el cultivo directo y el cultivo de exposición directa, fije, manche, visualice y analice las células adheridas tanto en las placas de pozos como en las muestras. Para el cultivo de exposición, analice las células adheridas a las placas de pozo.

  1. Fijación celular
    1. Recolecte el medio de postcultivo de cada pozo en un tubo cónico correspondiente de 15 ml para su posterior análisis. Recoger todas las muestras después del cultivo para su posterior análisis.
    2. Enjuague las células adheridas tanto en muestras como en placas de pozos 3 veces usando PBS.
    3. Agregue 1 ml de paraformaldehído al 4% (PFA, formalina tamponada neutra al 10%) en cada placa del pozo. Vuelva a colocar la tapa en la placa del pozo y permita que el PFA reaccione durante 20 minutos.
    4. Después de 20 min, aspire el PFA y dispensarlo en una botella de desecho. Enjuague la placa del pozo 3 veces usando PBS para eliminar el PFA y transfiera los desechos a la botella de desechos.
  2. Tinción celular
    1. Prepare las existencias de trabajo de los agentes de tinción siguiendo las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Por ejemplo, Alexa Fluor 488 Phalloidin se usa para teñir F-actina, y 4′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se usa para teñir núcleos celulares. El tiempo de tinción puede reducirse si las muestras se degradan rápidamente en las soluciones de tinción.
    2. Agregue 200-400 μL de agente de tinción de faloidina Alexa Fluor 488 diluido a cada pocillo para cubrir las células en la placa del pozo y la muestra. Envuelva la placa del pozo en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz y permita que la alexa Fluor 488 Phalloidin reaccione durante 20 minutos a temperatura ambiente.
    3. Recoge el agente de tinción Alexa Fluor 488 Faloidina y dispensalo en la botella de residuos correspondiente. Enjuague la placa del pozo 3 veces usando PBS para eliminar el exceso de Alexa Fluor 488 Phalloidin, y dispense el PBS usado en la botella de desecho correspondiente.
    4. Agregue 200-400 μL de DAPI diluido a cada pozo para cubrir las células en el pozo y en la muestra. Envuelva la placa del pozo en papel de aluminio y permita que el DAPI reaccione durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    5. Recoge el DAPI y dispensalo en la botella de residuos correspondiente. Enjuague la placa del pozo 3 veces usando PBS para eliminar el DAPI y dispense el PBS usado en la botella de desecho correspondiente.
  3. Imágenes celulares
    1. Después de la tinción, tome imágenes de las células con un microscopio de fluorescencia. Siempre que sea posible, tome imágenes de contraste de fase de las células además de imágenes de fluorescencia. Tome imágenes de las células en las muestras biodegradables tan pronto como sea posible o inmediatamente después de la tinción para evitar o reducir los posibles cambios causados por la degradación continua de las muestras. Almacene las células en las placas del pozo en una solución tampón a 2-8 ° C después de la fijación, y tome imágenes de las células tan pronto como sea posible después de la tinción para evitar la pérdida de señales de fluorescencia.
    2. Para el cultivo directo y el cultivo de exposición directa, tome imágenes y evalúe dos tipos de células: (1) las células de las muestras (en contacto directo con las muestras) y (2) las células adheridas a la placa del pozo que rodea las muestras (contacto indirecto con las muestras), como se muestra en la Figura 3A.
    3. Para el cultivo de exposición, como se muestra en la Figura 3B, use una guía de imágenes al tomar las imágenes de fluorescencia de las células para determinar si la respuesta celular sería diferente en respuesta al gradiente de degradación dinámica de las muestras. Tome imágenes y analice las células ubicadas en el área dentro del anillo interior (a 3,5 mm del centro) y el anillo exterior (a 7 mm del centro) por separado.
      NOTA: La guía de imágenes se utiliza para definir la distancia entre las celdas y las muestras.
    4. Para cada muestra y pozo en las placas de cultivo, tome aleatoriamente al menos cinco imágenes de cada área de interés donde las células estén en contacto directo o indirecto con las muestras a una distancia predefinida.
  4. Análisis de imágenes
    1. Para todas las imágenes celulares obtenidas del paso 4.3, cuantifique la morfología celular midiendo el área de propagación celular y la relación de aspecto utilizando un software como ImageJ para el análisis de imágenes.
    2. Cuente el número de celdas en cada área de la imagen. Calcule la densidad de adhesión celular en condiciones de contacto directo e indirecto como el número de células por unidad de área.

5. Análisis postcultivo de medios y muestras

  1. Medir el pH del medio postcultivo.
    NOTA: Algunas muestras cambian el valor de pH del medio durante su degradación. Por ejemplo, los metales biodegradables como las aleaciones de magnesio suelen aumentar el valor de pH del medio debido a su degradación31. Por el contrario, los polímeros biodegradables como el PLGA a menudo disminuyen el valor de pH del medio cuando se degradan32. La medición del valor de pH del medio de postcultivo puede indicar la degradación de estas muestras in vitro.
    1. Antes de la fijación celular, recoja el medio de postcultivo como en el paso 4.1.1.
    2. Mida los valores de pH del medio de postcultivo en cada pozo inmediatamente después de la recolección, utilizando un medidor de pH precalibrado.
      NOTA: El pH del medio puede desviarse con el tiempo debido a condiciones ambientales como el nivel de CO2 y la temperatura, que deben tenerse en cuenta.
  2. Analizar las composiciones de los medios para el comportamiento de degradación de muestras biodegradables. Para algunas muestras que causan un cambio de color del medio, mida el valor de densidad óptica (O.D.) del medio de postcultivo utilizando un espectrofotómetro o un lector de microplacas para determinar el comportamiento de degradación. Alternativamente, utilice la espectroscopia ultravioleta-visible (UV-VIS) y la reflectancia total atenuada por espectroscopia infrarroja de la transformada de Fourier (FTIR-ATR) para analizar los productos de degradación en el medio de postcultivo.
    NOTA: La medición de los productos de degradación en el medio post-cultivo es valiosa para comprender el comportamiento de degradación de las muestras. Uno de los enfoques más comunes es medir los iones de interés en el medio de postcultivo utilizando un espectrómetro de emisión plasma-óptica acoplado inductivamente (ICP-OES). El ICP-OES se puede utilizar para medir las composiciones del medio de postcultivo de metales y cerámicas, pero puede no ser adecuado para polímeros. Los polímeros generalmente consisten en carbono, hidrógeno y oxígeno, y la cuantificación precisa de estos elementos es difícil para ICP-OES.
    1. Siguiendo el paso 5.1.2 para la medición del pH, recoger y diluir el medio utilizando un factor de dilución deseable para mediciones óptimas de las concentraciones de iones.
    2. Medir las concentraciones de los iones de interés en el medio de postcultivo utilizando un ICP-OES.
  3. Análisis postcultivo de muestras
    NOTA: Después del estudio celular in vitro , las muestras biodegradables pueden cambiar en dimensión, masa, morfología de la superficie, microestructura y composición. El análisis posterior al cultivo de muestras ayuda a comprender el mecanismo de degradación de las muestras.
    1. Después del cultivo celular, tome las fotografías de las muestras para mostrar posibles cambios en la dimensión de la muestra, el color, la morfología y otras características visibles.
    2. Secar o deshidratar las muestras posteriores al cultivo y medir la masa, dimensión y volumen de la muestra para cuantificar cualquier cambio en la masa, dimensión y volumen.
    3. Utilice un microscopio electrónico de barrido (SEM) para caracterizar la microestructura y la morfología de las muestras. Utilice espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDX) y difracción de rayos X (XRD) para caracterizar la composición y la fase de los productos de degradación en las muestras. Utilice FTIR-ATR para detectar el enlace químico en las superficies de la muestra.

Resultados

La Figura 4 muestra las imágenes representativas de fluorescencia de BMSC en condiciones de contacto directo e indirecto utilizando diferentes métodos de cultivo. La Figura 4A,B muestra las BMSC en condiciones de contacto directo e indirecto después del mismo cultivo directo de 24 h con aleaciones de magnesio ZC2111. Las aleaciones ZC21 consisten en 97.5% en peso de magnesio, 2 en peso de zinc y 0.5 en peso de calcio. ...

Discusión

Se pueden utilizar diferentes métodos de cultivo celular para evaluar la citocompatibilidad in vitro de biomateriales de interés para diversos aspectos de aplicaciones in vivo. Este artículo demuestra tres métodos de cultivo in vitro , es decir, cultivo directo, cultivo de exposición directa y cultivo de exposición, para imitar diferentes escenarios in vivo donde se utilizan materiales de implantes biodegradables dentro del cuerpo humano. El método de cultivo directo se utiliza ...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores aprecian el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias de los Estados Unidos (premio NSF CBET 1512764 y NSF PIRE 1545852), los Institutos Nacionales de Salud (NIH NIDCR 1R03DE028631), la Beca de Desarrollo Docente de Regentes de la Universidad de California (UC) y la Beca de Investigación de Semillas del Comité de Investigación (Huinan Liu) y la Beca de Investigación de Disertación UC-Riverside (Jiajia Lin). Los autores aprecian la Instalación Central de Microscopía y Microanálisis Avanzados (CFAMM) en la UC-Riverside por el uso de SEM / EDS y el Dr. Perry Cheung por el uso de instrumentos XRD. Los autores también aprecian a Thanh Vy Nguyen y Queenie Xu por su edición parcial. Los autores también desean agradecer a Cindy Lee por grabar la narración del video. Cualquier opinión, hallazgo y conclusión, o recomendación expresada en este artículo son las de los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la Fundación Nacional de Ciencias o los Institutos Nacionales de Salud.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL serological pipetteVWR490019-704
12-well tissue-culture-treated platesThermo Fisher Scientific353043
15 mL conical tube (Polypropylene)VWR89039-666
18 G needleBD305196
25½ G needleBD305122
4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI)InvitrogenD3571
50 mL conical tube (Polypropylene)VWR89039-658
70 μm nylon strainerFisher Scientific50-105-0135
Alexa Flour 488-phalloidinLife technologiesA12379
Biological safety cabinetLABCONCOClass II, Type A2
CentrifugeEppendorfRotor F-35-6-30, Centrifuge5430
Clear Fused Quartz Round DishAdValue TechnologyFQ-4085
CO2 incubatorSANYOMCO-19AIC
CoolCell Freezer ContainerCorning432000foam container designed to regulate temperature decrease
CryovialThermo Fisher Scientific5000-1020
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5648
EDX analysis softwareOxford InstrumentsAztecSynergy
Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX)FEI50mm2 X-Max50 SDD
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.SH30910
Fluorescence microscopeNikonEclipse Ti
FormaldehydeVWR100496-496
HemacytometerHausser Scientific3520
ImageJ softwareNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)
Inductively coupled plasma
optical emission spectrometry (ICP-OES)		PerkinElmerOptima 8000
Optical microscopeVWRVistaVision
Penicillin/streptomycin (P/S)Thermo Fisher Scientific, Inc.,15070063
pH meterVWRmodel SB70P
Phosphate Buffered Saline (PBS)VWR97062-730
Scanning electronic microscope (SEM)FEINova NanoSEM 450
surgical bladeVWR76353-728
Tissue Culture FlasksVWRT-75, MSPP-90076
Transwell insertsCorning3460
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA)Sigma-AldrichT4049
X-ray diffraction instrument (XRD)PANalyticalEmpyrean Series 2

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