Zonular Liflerin Viskoelastik Özelliklerinin Belirlenmesinde Biyolojik Hazırlık ve Mekanik Teknik

Özet

Protokol, hücre dışı matris viskoelastisitesinin incelenmesi ve protein bileşimine veya çevresel faktörlere bağımlılığı için bir yöntem tanımlamaktadır. Hedeflenen matris sistemi fare zonule'sidir. Yöntemin performansı, vahşi tip zonular liflerin viskoelastik davranışı ile mikrofibril ilişkili glikoprotein-1'den yoksun olanlar karşılaştırılarak gösterilmiştir.

Özet

Elastikiyet kan damarları, kaslar ve akciğerler gibi dokuların işlevi için gereklidir. Bu özellik çoğunlukla hücre ve dokuları birbirine bağlayan protein meshwork olan hücre dışı matristen (ECM) türetilmiştir. Bir ECM ağının elastik özelliklerinin bileşimiyle nasıl ilişkili olduğu ve ECM'nin gevşeme özelliklerinin fizyolojik bir rol oynayıp oynamadığı, henüz tam olarak ele alınmamış sorulardır. Zorluğun bir kısmı, çoğu ECM sisteminin karmaşık mimarisinde ve ECM bileşenlerinin yapılarından ödün vermeden izole edilmesindeki zorlukta yatmaktadır. Bunun bir istisnası, omurgalıların gözünde bulunan bir ECM sistemi olan zonule'dir. Zonule, lens ve göz duvarı arasındaki hücresiz boşluğu kapsayan yüzlerce ila binlerce mikrometre uzunluğunda liflerden oluşur. Bu raporda, viskoelastik özelliklerini ölçmek ve bireysel protein bileşenlerinin katkısını belirlemek için zonulün son derece organize yapısından yararlanan mekanik bir tekniği açıklıyoruz. Yöntem, lensi ve zonuleyi açığa çıkarmak için sabit bir gözün diseksiyonu içerir ve gerginlikleri izlenirken zonular lifleri eşit olarak uzatan bir barfiks tekniği kullanır. Teknik nispeten ucuzdur, ancak belirli zonular proteinlerden yoksun veya yaşlanmaya sahip farelerde zonular liflerin viskoelastik özelliklerindeki değişiklikleri tespit edecek kadar hassastır. Burada sunulan yöntem öncelikle oküler gelişim ve hastalığı incelemek için tasarlanmış olsa da, elastik ECM'lerin viskoelastik özellikleri ve iyonik konsantrasyon, sıcaklık ve sinyal molekülleriyle etkileşimler gibi dış faktörlerin rolü ile ilgili daha geniş soruları keşfetmek için deneysel bir model olarak da hizmet edebilir.

Giriş

Bir omurgalının gözü, görüntüleri retinaya odaklamaya yardımcı olan canlı bir optik lens ^içerir1. Lens, Şekil 1A'da gösterildiği gibi hassas, radyal yönelimli fiberlerden oluşan bir sistem tarafından optik eksende askıya alınmıştır. Bir uçta, lifler lens ekvatoru ve diğer ucunda siliary gövdenin yüzeyine bağlanır. Uzunlukları farelerde 150 μm ile insanlarda 1 mm arasında değişen mesafelere yayılır. Toplu olarak, bu lifler Zinn2 zonule, siliary zonule veya sadece zonule olarak bilinir. Oküler travma, hastalık ve bazı genetik bozukluklar zonular liflerin bütünlüğünü ^{etkileyebilir3}, bu da nihai başarısızlıklarına ve eşlik eden görme kaybına neden olabilir. Farelerde, lifler çoğunlukla fibrilin-2 proteini içeren bir çekirdeğe sahiptir ve fibrilin-14 bakımından zengin bir mantle ile çevrilidir. Zonular lifler göze özgü olmasına rağmen, vücudun başka yerlerinde bulunan elastin bazlı ECM lifleri ile birçok benzerlik taşırlar. İkincisi bir fibrilin-1 mantle5 ile kaplıdır ve zonular liflerle benzer boyutlara ^sahiptir6. Gizli dönüştürücü büyüme faktörü β bağlayıcı proteinler (LTBP'ler) ve mikrofibril ilişkili glikoprotein-1 (MAGP-1) gibi diğer proteinler, her iki lif türüyle de ilişkili olarak bulunur7,8,9,10,11. Zonular liflerin elastik modülü 0.18-1.50 MPa12,13,14,15,16 aralığındadır, elastin bazlı liflerinkiyle karşılaştırılabilir (0.3-1.2 MPa)¹⁷. Bu mimari ve mekanik benzerlikler, zonule ilişkili proteinlerin rollerine ilişkin herhangi bir içgörünün diğer ECM elastik liflerdeki rollerini aydınlatabileceğine inanmamıza neden olur.

Burada açıklanan yöntemi geliştirmenin temel amacı, kalıtsal göz hastalığının ilerlemesinde spesifik zonular proteinlerin rolü hakkında fikir edinmektir. Genel yaklaşım, vahşi tip farelerdeki zonular liflerin viskoelastik özelliklerini, zonular proteinleri kodlayan genlerde hedeflenen mutasyonları taşıyan farelerinkilerle karşılaştırmaktır. Zonular liflerin elasto-mekanik özelliklerini ölçmek için daha önce çeşitli yöntemler kullanılmış olsa da, hepsi çok daha büyük hayvanların gözleri için tasarlanmıştır12,13,14,15,16. Bu modeller genetik olarak çekişli olmadığı için; farelerin küçük ve narin gözlerine daha uygun deneysel bir yöntem geliştirmeye çalıştık.

Fare zonular liflerinin viskoelastisitesini değerlendirmek için geliştirdiğimiz yöntem, Şekil 1'de görsel olarak özetlenen barfiks tahlil4,18 olarak adlandırdığımız bir tekniktir. Barfiks yönteminin ayrıntılı bir açıklaması ve sonuçların analizi aşağıda verilmiştir. Projede kullanılan üç boyutlu (3D) baskılı parçalar da dahil olmak üzere cihazın yapımını anlatarak başlıyoruz. Daha sonra, gözleri deney için elde etmek ve hazırlamak için kullanılan protokolü detaylandırıyoruz. Son olarak, zonular liflerin viskoelastik özelliklerinin belirlenmesi için veri elde etme konusunda adım adım talimatlar sunuyoruz. Temsili Sonuçlar bölümünde, MAGP-119'dan yoksun farelerden zonular liflerin viskoelastik özellikleri ve yaşla eşleşen vahşi tip hayvanlardan elde edilen bir kontrol seti ile ilgili yöntemimizle daha önce yayınlanmamış verileri paylaşıyoruz. Son olarak, yöntemin avantajları ve sınırlamaları hakkında genel açıklamalar ve çevresel ve biyokimyasal faktörlerin ECM liflerinin viskoelastik özelliklerini nasıl etkilediğini ortaya çıkarabilecek potansiyel deneyler için önerilerle sonlandırıyoruz.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Washington Üniversitesi Hayvan Çalışmaları Komitesi tarafından onaylandı ve OFTALMIK ve Vizyon Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO Bildirimi'ne bağlı kalındı.

1. Özel parçaların imalatı ve aparatların yapımı

1. Özel parçaların imalatı
   1. Sonda imalatı. Şekil 2A'nın sol panelinde gösterildiği gibi bir açıyla cam kılcal damar tutun. Bir ucundan yaklaşık 2 cm uzaklıktaki bir çakmağın alevini yerleştirin ve Şekil 2A'nın sağ panelinde gösterildiği gibi, uç 90 ° bükülene kadar orada tutun.
   2. Örnek platform imalatı. 3B çizim yazılımını kullanarak, Şekil 2B'de gösterildiği gibi 30 x 30 x 5 mm ölçülerinde ve 2,0, 2,5 ve 3,0 mm çapında yarım küre girintiler içeren bir platform tasarlayın.
   3. Prob tutucu imalatı. 3B çizim yazılımını kullanarak, kılcal probu tutan bir montaj tasarlayın ve bir mikromanipülatöre takın (bkz. Şekil 2C).
      NOT: Platform imalatı ve STL formatında prob tutucu imalatı için örnek bir 3D dosya, ilgili yazardan talep üzerine temin edilebilir.
   4. Negatif lens montajı. Petri kabına sıvı eklenmesinin neden olduğu bozulmayı düzeltmek için Şekil 1C ve Şekil 1D'de gösterildiği gibi negatif silindirik bir lens (odak uzaklığında -75 mm ve yaklaşık 50 mm yükseklik ve uzunluk) yerleştirin (sıvı ilavesi, yandan görüntülendiğinde parçalanmış gözün görünümünü bozulur).
   5. Negatif lensi 2 yuvalı tabanlardan birine yapıştırın (lensin tabana yerleştirilmesi için Bkz. Şekil 2D ).
   6. Kalan parçaları Şekil 2D'de gösterildiği gibi birleştirin.
   7. Direğin yüksekliğini, lensin kantarın üzerinde zar zor gezinmesi için ayarlayın ve post tutucudaki vidayı sıkın.
2. Aparat yapımı
   1. Bir bilgisayara ölçek, mikroskop kamera yazılımı ve motorlu mikrometre denetleyicisi uygulaması ile birlikte verilen günlük programını yükleyin.
   2. Motorlu mikrometreyi servo motor denetleyicisine ve ikincisini bilgisayara bağlayın. Motor kontrolör uygulamasını başlatın ve motor ayarlarını düzenleyin.
      NOT: Aşağıda listelenen motor ayarları, streslerin 10-20 s zaman ölçeğinde gevşediğini ortaya çıkaran ön deneylerin ardından seçildi. Bu belirlemeye dayanarak, motorun gevşeme süresinden daha küçük bir sürede 50 μm'lik bir yer değiştirme işlemini tamamlamasına izin veren bir hız ve ivme seçtik, ancak numuneyi sarsmaktan kaçınmak için çok kısa değil. Burada yaklaşık 5-10 sn'lik bir yer değiştirme süresi seçtik.
   3. Maksimum hızı 0,01 mm/sn ve ivmeyi 0,005 mm/^s2 olarak ayarlayın.
   4. Kamerayı muayene mikroskobuna takın ve kamera görüntüleme yazılımını test edin.
   5. Teraziyi aparatlara ayrılmış tezgah alanına yerleştirin.
   6. 3D baskılı bir platformu (adım 1.1.2'den) petri kabına yapıştırın ve kuyulardan birine 2-3 mm'lik bir cam boncuk ekleyin. Petri kabını, boncuk tava merkezinin yakınında yer olacak şekilde tartıya yerleştirin.
   7. Mikromanipülatörden manuel mikrometreyi motorlu olanla değiştirin.
   8. İki 4-40 vidayı prob tutucusuna vidala. Prob tutucuyu Şekil 1C'de gösterildiği gibi manipülatöre takın.
   9. Şekil 2A'da gösterildiği gibi bir prob hazırlayın, bükülmüş kısmı aşağı bakacak şekilde prob tutucusuna yerleştirin ve vidaları sıkın.
   10. Mikromanipülatörü, probun ucu platformdaki boncuk üzerinde olacak şekilde masaya yerleştirin. Deney sırasında yanlışlıkla hareketi önlemek için mikromanipülatörü masaya yapıştırın.
   11. Yan mikroskobu masaya yerleştirin, böylece boncuk görüş alanının merkezinde ve odaktadır.

2. Örnek hazırlama ve veri toplama

1. Göz fiksasyonu ve diseksiyonu
   1. Aynı C57/BL6J arka plan üzerinde vahşi tip fareleri ve Magp1-null hayvanları koruyun. 1 aylık veya 1 yaşındaki fareleri _CO2 soluma ile ötenazi.
   2. Gözleri ince torptiklerle çıkarın ve enükle edilmiş küreleri gece boyunca %4 paraformaldehit/fosfat tamponlu salinle sabitlayın (PBS, pH 7.4). Tarif ettiği gibi, fiksasyon işlemi sırasında gözde 15-20 mmHg pozitif basınç ^sağlayın6.
      NOT: Oküler kürenin boyutunda cinsiyetle ilgili olası farklılıkları kontrol etmek için erkek fareler üzerinde deneyler yapılır. Pozitif basınç, lens ile göz duvarı arasındaki boşluğu zonular lifler tarafından yayılan koruyarak dünyanın şişirilmiş kalmasını sağlar.
   3. PBS'de gözleri 10 dakika yıkayın. Oftalmik cerrahi makas kullanarak ve stereomikroskop altında çalışarak, optik sinir kafasının yakınındaki göz duvarında tam kalınlıkta bir kesi yapın.
   4. Kesiği ekvatora doğru uzatın ve ardından gözün ekvatoral çevresinin etrafına doğru uzatın. Hassas silier işlemleri ve ilişkili zonular lifleri ayırmaya özenin.
   5. Lensin arka yüzeyini açığa çıkararak kürenin arkasını çıkarın.
   6. Parçalanmış bir gözü tampon çözeltisinden çıkarmak için forsepsleri kullanın ve kornea aşağı bakacak şekilde kuru bir görev mendiline yerleştirin. Korneayı kurutmak için silecek yüzeyinin üzerine hafifçe sürükleyin.
   7. Petri kabına gözü yerleştirilecek platform kuyularına 3 μL anında tutkal ekleyin.
   8. Kabı stereomikroskopun sahne plakasına yerleştirin, böylece tutkallı kuyu görüntülenir.
   9. Gözü mendilden tutkal içeren kuyunun kenarına aktarın. Ardından, gözü dikkatlice kuyuya sürükleyin ve lensin arkası en üst olacak şekilde yönünü hızla ayarlayın.
   10. Lensin açıkta kalan tarafını kuru bir silmenin köşesiyle hafifçe şişirerek kurulayın.
   11. 50 mm Petri kabının dibine bir dab anında tutkal uygulayın ve platformu ona çimentolayın.
2. Zonular viskoelastik yanıtın ölçümü
   1. Ölçeği açın, ölçek günlüğü programını ve kamera yazılımını başlatın. Bazı denemeler bu kadar uzun sürebileceği için günlük programının 30 dakika boyunca veri alabildiğine emin olun.
   2. Servo motor kumandasını çalıştırın ve bilgisayarda denetleyici uygulamasını başlatın. 1.2.2 adımında NOT'ta belirtilenlere benzer hareket parametreleri kullanılarak denetleyicinin 50 μm'lik artışlarla hareket etmeye ayarlı olduğundan emin olun.
   3. 1.1.1 adımında açıklandığı gibi kılcal çubukta 90° büküm oluşturun.
   4. Bükülmüş kılcal damarı kılcal prob tutucusuna kaydırın ve sabitleme vidalarını sıkın.
      NOT: Numune dehidrasyonunu en aza indirmek için, 1-4 arası adımların göz diseksiyonu öncesinde veya sırasında tamamlanmasını öneririz.
   5. Kılcal damarın ucuna küçük (~1 mm) UV kürleme tutkallı bir boncuk ekleyin.
   6. Manipülatördeki manuel ayarlamaları kullanarak, kılcal probun ucunu doğrudan lensin ortasında olacak şekilde hareket ettirİn. UV tutkalının alt kısmının önden (görsel incelemeyle) ve yandan (mikroskop kamerasıyla) bakıldığında lensin üstünde ortalanmış görünüp görünmediğini kontrol edin.
   7. Kameradan bakarken, UV tutkal lensle temas edene ve üst yüzeyinin üçte birini veya yarısını kaplayana kadar prob ucunu küt küt küt atlayın.
   8. Tutkalını iyileştirmek için düşük yoğunluklu (~ 1 mW), yönlü, görünüre yakın UV (380-400 nm) ışık kaynağı kullanın.
      NOT: Bu özellikler, protein çapraz bağlamayı teşvik etme potansiyelini en aza indirirken tutkalın birkaç saniye içinde tedavisi için yeterlidir. Ticari UV tutkal kalemleri ile birlikte verilen UV ışık kaynakları bu özellikleri karşılar.
   9. Göz sıvı ile kaplanana kadar yemeğe en az 2 mm derinliğe kadar PBS çözeltisi ekleyin.
   10. Silindirik lensi muayene mikroskobu önüne ve petri kabına dokunmadan mümkün olduğunca yakın yerleştirin.
   11. Aynı anda günlük programını ve bir zamanlayıcı programını başlatın. Kamerayı kullanarak gözün/probun fotoğrafını çekin.
   12. 60 s'den sonra, 50 μm daha yer değiştirme başlatın ve deney tamamlanana kadar, yani tüm lifler kırılana kadar her 60 s.'de bir. Deneme sırasında arabellek buharlaşması nedeniyle sinyalin taban çizgisi düzeylerine dönmeyeceğini unutmayın. 2.2.14 adımında örneklenerek, veri analizi sırasında okumalarda meydana gelen sürüklenmeyi düzeltin.
   13. Bir çalıştırma tamamlandıktan sonra, ölçek günlüğü verilerini kaydedin ve elektronik tabloyla uyumlu bir biçime(örneğin, .csv bir biçime dışa aktarın. Çalıştırma sırasında toplanan lens resimlerini kaydedin.
   14. Verileri elektronik tabloya alma. Buharlaşma nedeniyle zaman içinde arka plan okumasında sürüklenmeyi enterpolasyona tabi etmek için ilk ve son ölçek okumasını kullanın (bkz. Şekil 3). Enterpolasyonlu okumayı her zaman noktasında okumadan çıkarın.
       NOT: Elektronik tablo kullanıyorsanız, enterpolasyon, = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B)))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 ilk ölçek okumasının sağındaki hücrede, daha sonra imleci hücrenin sağ-alt köşesine taşıyarak ve son veri değerine sürükleyerek otomatik olarak gerçekleştirilebilir. Formül, verilerin B2 hücresinde görünen ilk veri noktasıyla bir sütunda düzenlendiğini varsayar. İstenirse, 2.2.14 adımında işlenen veriler, ortak yazarlardan biri olan Dr. Matthew ^Riley4 tarafından geliştirilen yarı elastik viskoelastik modelle analiz edilebilir.

Sonuçlar

Burada açıklanan barfiks tekniği, farelerdeki zonular liflerin viskoelastik özelliklerini belirlemek için basit bir yaklaşım sağlar. Kısacası, fare gözü ilk olarak fizyolojik göz içi basıncında bir fiksatif enjeksiyonu ile korunur. Bu yaklaşım gözün doğal enflasyonuni korur ve lifleri düzgün bir şekilde önceden gergin tutar (ön deneyler liflerin elastikiyetini veya gücünü önemli ölçüde değiştirmediğini gösterdikten sonra fiksasyon kabul edilebilir görülmüştür). Fare gözünün ar...

Tartışmalar

Zonule, liflerin simetrik olarak düzenlendiği ve optik eksen boyunca göz merceği yerinden edilerek aynı şekilde manipüle edilebilen alışılmadık bir ECM sistemidir. Alan ayrıca hücresel bozulma olmadan kolayca erişilebilir ve liflerin kendi yerel durumlarına yakın bir ortamda incelenmesini sağlar. Barfiks tekniği, genetik olarak çekişli bir sistem olan farelerden gelen hassas lifleri manipüle etmek ve mekanik özelliklerini doğru bir şekilde ölçmek için bu ECM sunumundan yararlanır. Bu, anahtar ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4-20 hex screws 3/4 inch long	Thorlabs	SH25S075
1/4-20 nut	Hardware store
3D SLA printer	Anycubic	Photon
4-40 screws 3/8 inch long, 2	Hardware store
Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament	WPI	1B120-3
Cyanoacrylate (super) glue	Loctite
Digital Scale accurate to 0.01 g	Vernier	OHAUS Scout 220
Excel	Microsoft		Spreadsheet
Gas cigarette lighter
Inspection/dissection microscope	Amscope	SKU: SM-4NTP	Working distance ~ 15 cm
Micromanipulator, Economy 4-axis	WPI	Kite-L
Motorized micrometer	Thorlabs	Z812B
Negative cylindrical lens	Thorlabs	LK1431L1	-75 mm focal length
Petri dishes, 50 mm
Post holder, 3 inches	Thorlabs	PH3
Post, 4 inches	Thorlabs	TR4
Scale logging software	Vernier	LoggePro
Servo motor controller	Thorlabs	KDC101
Servo motor controller software	Thorlabs	APT
Slotted base, 1	Thorlabs	BA1S
Slotted bases, 2	Thorlabs	BA2
Stand for micromanipular	WPI	M-10
USB-camera for microscope	Amscope	SKU: MD500
UV activated glue with UV source	Amazon