אפיון אקוקרדיוגרפי של מבנה החדר השמאלי, תפקודו וזרימה כלילית בעכברים ילודים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הערכה אקוקרדיוגרפית של מורפולוגיה של חדר שמאל, תפקוד וזרימת דם כלילית בעכברים בני 7 ימים.

Abstract

אקוקרדיוגרפיה היא הליך לא פולשני המאפשר הערכה של פרמטרים מבניים ותפקודיים במודלים של מחלות לב וכלי דם בבעלי חיים ומשמש להערכת ההשפעה של טיפולים פוטנציאליים במחקרים פרה-קליניים. מחקרי אקו-לב נערכים בדרך כלל בעכברים בוגרים צעירים (כלומר, בני 4-6 שבועות). ההערכה של תפקוד הלב וכלי הדם של ילודים מוקדמים אינה מבוצעת בדרך כלל בגלל גודלם הקטן של גורי העכברים והקשיים הטכניים הנלווים. אחד האתגרים החשובים ביותר הוא שהאורך הקצר של איברי הגורים מונע מהם להגיע לאלקטרודות בפלטפורמת האקו-קרדיוגרפיה. טמפרטורת הגוף היא האתגר השני, שכן גורים רגישים מאוד לשינויים בטמפרטורה. לכן, חשוב לקבוע מדריך מעשי לביצוע מחקרי אקו-לב בגורי עכברים קטנים כדי לסייע לחוקרים לזהות שינויים פתולוגיים מוקדמים ולחקור את התקדמות מחלות לב וכלי דם לאורך זמן. העבודה הנוכחית מתארת פרוטוקול לביצוע אקוקרדיוגרפיה בגורי עכברים בגיל צעיר של 7 ימים. כמו כן מתואר אפיון אקוקרדיוגרפי של מורפולוגיה לבבית, תפקוד וזרימה כלילית בעכברים ילודים.

Introduction

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבחון את המורפולוגיה של הלב, תפקודו וזרימת העורקים הכליליים בגורי עכברים ילודים בני 7 ימים באמצעות אקוקרדיוגרפיה. הרציונל מאחורי פיתוח טכניקה זו הוא לקבוע שינויים מוקדמים בזרימה הכלילית ובתפקוד הלב במודלים של עכברים של מחלות לב¹. האופי הלא פולשני של אקוקרדיוגרפיה הוא יתרון משום שהוא מאפשר לחוקרים להעריך את תפקוד הלב וכלי הדם בתנאים פיזיולוגיים ומספק לחוקרים כלי סינון לחקר טיפולים ממוקדים לטיפול במחלות לב וכלי דם ^2,3. באופן מסורתי, מחקרים אקוקרדיוגרפיים נערכים עם עכברים בוגרים צעירים (4-6 שבועות); עם זאת, חלק מדגמי העכברים (כלומר, מודלים מהונדסים גנטית) כבר מציגים שינויים פתולוגיים ותפקוד לקוי של הלב בגיל זה. לכן, מחקרי לב באמצעות מודלים של בעלי חיים התמקדו בעיקר בחומרים טיפוליים המשפרים או מטפלים בתפקוד לקוי של הלב. לעומת זאת, לאחרונה, מאמצי המחקר הופנו להתמקד באמצעי מניעה והתערבויות מוקדמות במחלות לב⁴.

מחקרים קודמים תיארו את השימוש באקוקרדיוגרפיה למדידת תפקוד הלב במודלים של אוטם שריר הלב בעכברים ילודים ^5,6; עם זאת, מחקרים אלה נכשלו במדידת הזרימה הכלילית, והכי חשוב, לא הצליחו לרשום נתוני אלקטרוקרדיוגרמה (א.ק.ג.) ודופק (HR) במהלך ההליך, ככל הנראה בשל גודלן הקטן של איברי הגורים, שלא הצליחו להגיע לרפידות האלקטרודה. אנו מתגברים על בעיה זו בפרוטוקול זה על ידי הצמדת רדיד אלומיניום לגפיים כדי לאפשר להן להגיע לרפידות האלקטרודה וליצור מעגל א.ק.ג. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר ומאפיין את זרימת העורקים הכליליים בעכברים ילודים.

מחקר זה השיג תמונות במצב B ובמצב M בתצוגות פאראסטרנליות ארוכות וקצרות למדידת פרמטרים מבניים ופונקציונליים ^2,3. הפרמטרים המורפולוגיים כללו מידות פרוזדורים שמאליים, מידות חדר שמאל (LV), עובי דופן LV, מסת LV ועובי דופן יחסי (RWT). הפרמטרים הפונקציונליים כללו שבר פליטה (EF), קיצור שברים (FS), תפוקת לב (CO) ומהירות קיצור סיבים היקפיים (Vcf). דופלר גל דופק (PW) שימש למדידת זרימה אבי העורקים בראייה פאראסטרנלית קצרת צירים (PSAX) ולמדידת זרימת דם מיטרלית בראייה אפית בעלת ארבעה תאים. התצוגה האפיקלית בעלת ארבעת התאים שימשה גם לביצוע דופלר רקמה בחלק המחיצות של טבעת המסתם המיטרלי. זרימה כלילית בעורק הכלילי הקדמי השמאלי (LAD) נבדקה גם באמצעות תצוגה פרסטרנלית ארוכת ציר (PLAX). עתודת זרימה כלילית (CFR) חושבה לאחר אתגר לחץ שנגרם על ידי ריכוז איזופלורן מוגבר.

הפרוטוקול הנוכחי מדגים כי מחקרי אקו-לב יכולים להתבצע בגיל צעיר מאוד בעכברים ילודים, ובכך לאפשר זיהוי מוקדם של פתולוגיות לב ומחקרי מעקב אורכיים של המודינמיקה LV ופרמטרים של זרימה כלילית במודלים שונים של עכברים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי ללמוד את התפקיד של שינויים גנטיים או התערבויות פרמקולוגיות בתפקוד הלב בגילאים מוקדמים לאחר הלידה. יתר על כן, הפרוטוקול מספק כלי רב ערך לקביעת הופעת מחלות לב בשלב מוקדם בחיים, ובכך מאפשר לחוקרים לפתוח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס השלבים הראשונים של מחלות לב במודלים שונים של עכברים.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אילינוי בשיקגו. לצורך הניסויים נעשה שימוש בעכברי FVB/N בני 7 ימים. הפרוטוקול מחולק להכנת עכברים, רכישת תמונת אקוקרדיוגרפיה וטיפול בבעלי חיים לאחר הדמיה.

1. הכנת עכבר

1. השיגו את העכברים בני 7 הימים מכלוב הרבייה.
   הערה: בגיל צעיר זה, קשה לקבוע את מין החיה על ידי בדיקה גופנית.
2. הניחו ג'ל א.ק.ג. (ראו טבלת חומרים) על רפידות האלקטרודה המחוממות. הניחו פסי רדיד אלומיניום (~1.5 אינץ' x 0.25 אינץ') על גבי רפידות האלקטרודות כדי להרחיב את טווח האלקטרודות ולאבטח באמצעות סרט הדבקה (איור 1A). לאחר מכן, מניחים את ג'ל האק"ג על גבי רצועות רדיד האלומיניום.
   הערה: ודא שהג'ל שמתחת לרצועות רדיד האלומיניום אינו מתייבש במהלך ההליך. במקרה כזה, הוסיפו עוד ג'ל כדי לשמור על המוליכות.
3. גזרו אצבע מכפפת ניטריל והתאימו אותה כך שתכסה גם את חרוט האף איזופלורן/חמצן בצד אחד וגם את אף העכבר בצד השני (איור 1B).
4. הכניסו את גור העכבר לתא האינדוקציה של האיזופלוראן והתחילו בהעברת איזופלוראן בריכוז של 2.5% המונע על-ידי 100% חמצן (איור 1C).
5. הניחו את הגור המרדים בתנוחת שכיבה על משטח ההדמיה עם הכפות על גבי רפידות רדיד האלומיניום ואבטחו באמצעות סרט הדבקה. ודא שהמעגל החשמלי הושלם ושהאק"ג מקליט.
6. הפחיתו את אספקת האיזופלוראן ל-1.5% המונעים על ידי 100% חמצן. הדקו את האצבע החתוכה מהכפפה סביב אפו של הגור באמצעות סרט הדבקה. אשרו את עומק ההרדמה על ידי צביטה בכפותיו של הגור.
7. הניחו שכבה עבה של ג'ל אולטרסאונד שחומם מראש על פלג גופו העליון של הגור. השתמשו בשני גלילי גזה כדי לשמור על ג'ל האולטרסאונד במקומו (איור 1D).
8. השתמשו במנורת חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף הרגילה של הגור (איור 1E).
   הערה: בדיקה רקטלית לא שימשה לניטור טמפרטורת הגוף במחקר הנוכחי בשל גודלו הקטן של הגור.

2. רכישת תמונה אקו-קרדיוגרפית וניתוחה

1. בצע אקוקרדיוגרפיה טרנסתוראקית באמצעות מכשיר אקוקרדיוגרפיה המצויד במתמר מערך ליניארי במהירות 40 MHz עבור מצב B וב- 32 MHz עבור דופלר (קצב פריימים 233) (ראה טבלת חומרים), בהתאם לפרוטוקולי אקוקרדיוגרפיה של עכברים בוגרים ^7,8,9.
2. הימנעו מהפעלת לחץ מוגזם על חלל החזה של הגור בעת הנחת מתמר ההד במהלך רכישת תמונה אקוקרדיוגרפית.
   הערה: בשל גודלו הקטן של הגור, משקל המתמר עצמו עלול לגרום לשינוי בתפקוד הלב או למוות.
3. צלם את תצוגת ה- PLAX של מערכת היציאה של החדר השמאלי והאטריום השמאלי.
   1. הניחו את המתמר במחזיק, עם סימן האינדקס לכיוון הכתף הימנית של הגור.
   2. הנמיכו את המתמר עד שהוא בא במגע עם הג'ל ודמיינו את מערכת היציאה של החדר השמאלי במצב B (איור 2A).
   3. השתמשו במצב M בעלוני אבי העורקים כדי למדוד את הקוטר המרבי של אטריום שמאל (LA) בסוף סיסטולה (איור 2B, טבלה 1). לחץ על הלחצן Cine Store כדי להקליט את הנתונים.
4. צלם את תצוגת PSAX של החדר השמאלי כדי למדוד את מידות התא, עובי הדופן, זרימת אבי העורקים וזרימת הריאה.
   1. סובב את המתמר ~ 90° בכיוון השעון של PLAX כדי לקבל את תצוגת PSAX.
   2. מקם את הבדיקה ברמה של השרירים הפפילריים והשתמש במצב M כדי למדוד את הקטרים הפנימיים של החדר השמאלי (LVID), עובי המחיצה הבין-חדרית (IVS) ו- PW במהלך סיסטולה ודיאסטולה (איור 3A, טבלה 1). לחץ על הלחצן Cine Store כדי להקליט את הנתונים.
   3. חשב את RWT, אינדקס של היפרטרופיה, באמצעות ממדי התא הדיאסטולי כדלקמן ^3,10:
      (PW + IVS בסוף הדיאסטולה) / (LVID בסוף הדיאסטולה)
   4. הזז את המתמר לכיוון בסיס הלב והשתמש בצבע דופלר כדי לדמיין את עורק הריאה. לחץ על PW Doppler כדי לכמת את מהירות זרימת השיא הריאתי, פרופילי זרימה ריאתית, זמן פליטה ריאתית (PET) וזמן האצה ריאתית (PAT)^11,12 (איור 3B). לחץ על הלחצן Cine Store כדי להקליט את הנתונים.
   5. הזיזו את המתמר עוד יותר לכיוון הבסיס והשתמשו בדופלר צבע כדי לדמיין את זרימת אבי העורקים (איור 3C). השתמש בדופלר PW כדי לדמיין את זרימת הדם ולמדוד את זמן הפליטה של אבי העורקים (AET). לחץ על הלחצן Cine Store כדי להקליט את הנתונים.
   6. חשב את ה- Vcf (circ/sec)^13,14, אינדיקטור לביצועי שריר הלב^, באמצעות דיאסטולה סופית של LVID (LVIDd), LVID end-systole (LVIDs) ו- AET באופן הבא (טבלה 1):
      (LVIDd - LVIDs) / (LVIDd x AET)
5. צלם את התצוגה האפית בעלת ארבעת התאים.
   1. הניחו את הפלטפורמה בתנוחת טרנדלנבורג, הטו אותה שמאלה והתאימו את הגשושית כדי לדמיין את ארבעת התאים (איור 4A).
   2. השתמש בדופלר צבע כדי לדמיין את זרימת הדם וב- PW דופלר בקצה עלוני המסתם המיטרלי במרכז פתח המסתם המיטרלי כדי לרשום את הזרימה המיטרלית. לחץ על חנות Cine כדי להקליט את הנתונים.
   3. בתצוגה זו, חשב את הפרמטרים הבאים ^2,3,10 (איור 4B וטבלה 1):
      1. חישוב יחס E/A, שהוא המהירות המרבית של זרימת הדם בשלב המוקדם של הדיאסטולה (E) על פני המהירות המרבית של זרימת הדם בשלב המאוחר של הדיאסטולה (A).
      2. קבע את זמן ההאטה של גל E (DT), שהוא הזמן משיא E ועד סוף הדיאסטולה המוקדמת.
      3. חישוב זמן הרפיה איזובולומי LV (IVRT), שהוא הזמן מסגירת מסתם אבי העורקים ועד לפתיחת המסתם המיטרלי.
      4. חישוב זמן התכווצות איזובולומי LV (IVCT), שהוא הזמן מסגירת המסתם המיטרלי ועד לפתיחת המסתם האאורטלי.
   4. השתמש בדופלר רקמה בצד המחיצות של טבעת המסתם המיטרלי בתצוגה של ארבעה תאים כדי למדוד את מהירות ההרפיה הגבוהה של שריר הלב במילוי הדיאסטולי המוקדם (e') ובמילוי הדיאסטולי המאוחר (a'), כמו גם את שיא מהירות ההתכווצות הסיסטולית של שריר הלב (s') (איור 4C וטבלה 1). לחץ על הלחצן Cine Store כדי להקליט את הנתונים.
6. צלם את תצוגת ה- PLAX המתוקנת כדי לבחון את העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי.
   1. השתמשו בתצוגת PLAX¹⁵ שונה, הזיזו את המתמר לרוחב והטו את הקרן לכיוון החלק הקדמי (איור 5A).
   2. הזז את הבדיקה והשתמש בדופלר צבע כדי לדמיין את מקור העורק הכלילי הראשי השמאלי (LCA) שנוצר מאבי העורקים. זהה את עורק ה- LAD שנוצר מה- LCA ועובר בין דופן החדר השמאלי הקדמי לבין מערכת היציאה של החדר הימני^16,17. בעמדה זו, הפעילו את PW Doppler כדי למדוד את זרימת ה-LAD (איור 5B). לחץ על הלחצן Cine Store כדי להקליט את הנתונים.
   3. חשב את הפרמטרים הבאים של זרימת עורקים כליליים LAD (איור 5C וטבלה 2): מהירות זרימה כלילית שיא (CFV), CFV ממוצע ואינטגרל מהירות-זמן (VTI).
      הערה: כל הפרמטרים הללו נמדדים בריכוז איזופלוראן בסיסי של 1.5% (בסיס).
   4. העלו את ריכוז האיזופלוראן ל-2.5% והמתינו 5 דקות כדי להשיג זרימה מקסימלית (איור 5C). לחץ על הלחצן Cine Store כדי להקליט את הנתונים. חישוב CFR כיחס בין CFV שיא דיאסטולי בזרימה מקסימלית לשיא דיאסטולי CFV בבסיס^18,19,20 (טבלה 2):
      CFR = שיא דיאסטולי CFV (2.5%) / שיא דיאסטולי CFV (1.5%)

3. ניטור וטיפול בבעלי חיים לאחר הדמיה

1. לאחר השלמת ההדמיה האקו-קרדיוגרפית, נקו בזהירות את הגור ואפשרו לו להתאושש מההרדמה למשך כ-2 דקות.
2. לפני החזרת הגור לכלוב שלו, מרחו את הגור במצעים של אם הכלוב כדי למנוע דחייה או קניבליזציה.
3. שימו לב להתנהגות האם במשך כ -30 דקות לאחר ההליך. אם נצפתה התנהגות אגרסיבית, הרדימו את הגור בהתאם להנחיות הנוהל של בעלי החיים.

תוצאות

במחקר זה נעשה שימוש בגורי עכברים בני 7 ימים כדי לאפיין את המורפולוגיה של הלב, תפקודו וזרימת העורקים הכליליים. הטיפול בעכבר צריך להיעשות בזהירות, ופלטפורמת העכבר חייבת להיות מותאמת לגודל הקטן של הגורים, כפי שמתואר באיור 1. תמונה מייצגת של תצוגת PLAX מוצגת באיור 2A

Discussion

בעידן הרפואה המונעת, נדרשת הערכה מוקדמת של שינויים בתפקוד הלב וכלי הדם כדי לקבוע את הופעת המחלה ולתכנן טיפולים התערבותיים מתאימים. עכברים משמשים יותר ויותר כמודלים פרה-קליניים במחקרי לב, ומחקרים אקוקרדיוגרפיים נערכים בדרך כלל עם עכברים בוגרים צעירים. עם זאת, כדי ללמוד את התפקיד של שינויי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Depilating agent	Nair Hair Remover
Electrode gel	Parker Laboratories	15-60
High Frequency Ultrasound	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100
Isoflurane	MedVet	RXISO-250
Linear array high frequency transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS550D
Mice breeding pair	Charles River Laboratories	FVB/N	Strain Code 207
Ultrasound Gel	Parker Laboratories	11-08
Vevo Lab Software	FUJIFILM VisualSonics, Inc.		Verison 5.5.1