Rosenbengalen-vermittelte photodynamische Therapie zur Hemmung von Candida albicans

Zusammenfassung

Die zunehmende Inzidenz von arzneimittelresistenten Candida albicans ist weltweit ein ernstes Gesundheitsproblem. Die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) kann eine Strategie zur Bekämpfung arzneimittelresistenter Pilzinfektionen bieten. Das vorliegende Protokoll beschreibt die bengalenvermittelte aPDT-Wirksamkeit von Rose auf einem multiresistenten C. albicans-Stamm in vitro.

Zusammenfassung

Die invasive Candida albicans-Infektion ist eine signifikante opportunistische Pilzinfektion beim Menschen, da sie einer der häufigsten Kolonisatoren von Darm, Mund, Vagina und Haut ist. Trotz der Verfügbarkeit von antimykotischen Medikamenten bleibt die Sterblichkeitsrate der invasiven Candidiasis ~ 50%. Leider nimmt die Inzidenz von arzneimittelresistenten C. albicans weltweit zu. Die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) kann eine alternative oder adjuvante Behandlung bieten, um die Bildung von C. albicans-Biofilmen zu hemmen und Arzneimittelresistenzen zu überwinden. Rose bengal (RB) vermittelte aPDT hat eine effektive Zellabtötung von Bakterien und C. albicans gezeigt. In dieser Studie wird die Wirksamkeit von RB-aPDT auf multiresistente C. albicans beschrieben. Eine hausgemachte grüne Leuchtdioden-Lichtquelle (LED) ist so konzipiert, dass sie sich an der Mitte einer Vertiefung einer 96-Well-Platte ausrichtet. Die Hefen wurden in den Brunnen mit unterschiedlichen Konzentrationen von RB inkubiert und mit unterschiedlichen Grünlichtfluanzen beleuchtet. Die Tötungseffekte wurden mit der Plattenverdünnungsmethode analysiert. Mit einer optimalen Kombination von Licht und RB wurde eine 3-log-Wachstumshemmung erreicht. Es wurde der Schluss gezogen, dass RB-aPDT möglicherweise arzneimittelresistente C. albicans hemmen könnte.

Einleitung

C. albicans besiedelt im Magen-Darm- und Urogenitaltrakt gesunder Personen und kann bei etwa 50 Prozent der Individuen als normale Mikrobiota nachgewiesen werden¹. Wenn ein Ungleichgewicht zwischen dem Wirt und dem Erreger entsteht, ist C. albicans in der Lage, einzudringen und Krankheiten zu verursachen. Die Infektion kann von lokalen Schleimhautinfektionen bis hin zu multiplem Organversagen^{reichen 2}. In einer multizentrischen Surveillance-Studie in den USA ist etwa die Hälfte der Isolate von Patienten mit invasiver Candidiasis zwischen 2009 und 2017 C. albicans³. Candidämie kann mit hohen Morbiditätsraten, Mortalität, längerem Krankenhausaufenthalt^{verbunden sein 4}. Die US-amerikanischen Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention berichteten, dass etwa 7% aller getesteten Candida-Blutproben gegen das Antimykotikum^{Fluconazol 5} resistent sind. Das Auftreten arzneimittelresistenter Candida-Spezies wirft die Sorge auf, eine alternative oder adjuvante Therapie zu Antimykotika zu entwickeln.

Bei der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (aPDT) wird ein spezifischer Photosensibilisator (PS) mit Licht auf der maximalen Absorptionswellenlänge des PS⁶ aktiviert. Nach der Anregung überträgt das angeregte PS seine Energie oder Elektronen auf die nahe gelegenen Sauerstoffmoleküle und kehrt in den Grundzustand zurück. Während dieses Prozesses bilden sich reaktive Sauerstoffspezies und Singulett-Sauerstoff, die Zellschäden verursachen. aPDT wird seit den 1990er Jahren häufig zur Abtötung von Mikroorganismen^{eingesetzt 7}. Einer der Vorteile von aPDT besteht darin, dass mehrere Organellen in einer Zelle durch Singulett-Sauerstoff und / oder reaktive Sauerstoffspezies (ROS) während der Bestrahlung beschädigt werden; Daher wurde bis heute kein Widerstand gegen aPDT gefunden. Darüber hinaus berichtete eine kürzlich durchgeführte Studie, dass die Bakterien, die nach der aPDT überlebten, empfindlicher auf Antibiotika^{reagierten 8}.

Zu den in aPDT verwendeten Lichtquellen gehören Laser, Metallhalogenlampen mit Filtern, Nahinfrarotlicht und Leuchtdioden (LED) 9,10,11,12. Der Laser liefert eine hohe Lichtleistung, in der Regel größer als 0,5 W/cm², die die Abgabe einer hohen Lichtdosis in sehr kurzer Zeit ermöglicht. Es wurde häufig in Fällen verwendet, in denen eine längere Behandlungszeit unbequem ist, wie z.B. aPDT für orale Infektionen. Der Nachteil eines Lasers ist, dass seine Spotgröße der Beleuchtung klein ist und von einigen hundert Mikrometern bis 10 mm mit einem Diffusor reicht. Darüber hinaus sind Lasergeräte teuer und erfordern eine spezielle Schulung für die Bedienung. Auf der anderen Seite ist die Bestrahlungsfläche einer Metallhalogenlampe mit Filtern relativ groß¹³. Allerdings ist die Lampe zu kräftig und teuer. LED-Lichtquellen sind im dermatologischen Bereich zum Mainstream der aPDT geworden, da sie klein und kostengünstiger sind. Die Bestrahlungsfläche kann bei einer Anordnung der LED-Glühbirne relativ groß sein. Das ganze Gesicht kann gleichzeitig beleuchtet^{werden 9}. Dennoch sind die meisten, wenn nicht alle, heute verfügbaren LED-Lichtquellen für den klinischen Einsatz konzipiert. Es ist möglicherweise nicht für Experimente in einem Labor geeignet, da es platzraubend und teuer ist. Wir haben ein preiswertes LED-Array entwickelt, das sehr klein ist und aus einem LED-Streifen geschnitten und montiert werden kann. Die LEDs können in verschiedene Anordnungen für unterschiedliche Versuchsdesigns eingebaut werden. Verschiedene Bedingungen der aPDT können in einer 96-Well-Platte oder sogar einer 384-Well-Platte in einem Experiment abgeschlossen werden.

Rose Bengal (RB) ist ein farbiger Farbstoff, der häufig verwendet wird, um die Visualisierung von Hornhautschäden in menschlichen Augen zu verbessern¹⁴. RB-vermittelte aPDT hat abtötende Wirkungen auf Staphylococcus aureus, Escherichia coli und C. albicans mit einer in etwa vergleichbaren Effizienz wie bei Toluidinblau^{O 15} gezeigt. Diese Studie zeigt eine Methode zur Validierung der Wirkung von RB-aPDT auf multiresistente C. albicans.

Protokoll

1. Vorbereitung des aPDT-Systems

1. Schneiden Sie vier grüne Leuchtdioden (LEDs) aus einem LED-Streifen (siehe Materialtabelle) und richten Sie sie mit vier Vertiefungen einer 96-Well-Platte aus (Abbildung 1).
   HINWEIS: Die LEDs wurden zu einem 4 x 3 Array angeordnet. Die Rückseite der LED wurde an einen Kühlkörper geklebt, um die Wärme während der Bestrahlung zu verteilen.
2. Messen Sie die Fluenzrate¹¹ der LED bei 540 nm mit einem Lichtleistungsmesser (siehe Materialtabelle). Siehe ergänzende Abbildung 1 , um sicherzustellen, dass die Flussrate der LED zwischen 510-560 nm liegt.
3. Stellen Sie während der Bestrahlung einen elektrischen Ventilator neben die Platte, um die konstante Temperatur (25 ± 1 °C) ^{aufrechtzuerhalten11}. Siehe ergänzende Abbildung 2 , um sicherzustellen, dass die konstante Temperatur des Mediums während der Bestrahlung aufrechterhalten wird.

2. Kultivierung der Hefeform von C. albicans

HINWEIS: Für die Experimente wird ein multiresistenter C. albicans (BCRC 21538/ATCC 10231) verwendet, der gegen die meisten Antimykotika, einschließlich Fluconazol, resistent ist¹⁶.

1. Bestimmen Sie die Empfindlichkeit des Antimykotikums mit einer Bandscheibendiffusionsmethode gemäß dem zuvor veröffentlichten Bericht¹⁷.
2. Züchten Sie C. albicans in Hefe-, Hyphen- und Pseudohyphenformen, abhängig von den mikroökologischen Umgebungen¹⁸.
   HINWEIS: Die Hyphen und Pseudohyphenformen sind für eine genaue Berechnung schwierig. Die Hefeform kann unter dem Mikroskop oder mit Durchflusszytometrie präzise berechnet werden. Die Temperatur während des Zellwachstums bestimmt ihre Morphologie. Bei Raumtemperatur (25 °C) sind fast alle Zellen hefeform. Eine 4 h kurze Inkubation von C. albicans bei 30 °C hatte keinen Einfluss auf seine Hefemorphologie.

3. aPDT auf planktonischem C. albicans

1. Isolieren Sie eine einzelne Kolonie von C. albicans aus einer Agarplatte mit einer sterilen Schleife und fügen Sie sie in einem sterilisierten Glasröhrchen zu einem 3 ml Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Medium (YPD) hinzu (siehe Materialtabelle).
   1. Inkubieren Sie das Rohr bei 25 ± 1 °C über Nacht (14-16 h) in einem Inkubator mit einer Drehzahl von 155 U / min, um C. albicans zu erweitern und den Pilz in Hefeform für eine genaue Quantifizierung zu erhalten.
2. Verdünnen Sie die Übernachtkultur mit einem mittleren bis zu einem OD_600-Wert von etwa 0,5 bei 30 ° C und drehen Sie sie mit einer Geschwindigkeit von 155 U / min für 4 h, um eine logarithmische Wachstumsphase von C. albicans zu erreichen.
3. Verdünnen Sie die Log-Phasenkultur erneut mit frischem YPD-Medium auf einen OD_{600-Wert von 0,65} (ca. 1 x 10⁷ koloniebildende Einheiten, CFU/ml). Bestätigen Sie die Endkonzentration durch serielle Verdünnungsmethode auf einer Agarplatte⁸.
4. Bereiten Sie eine Stammlösung (4%) Rose bengal (RB) vor, indem Sie das Pulver in 1x PBS auflösen. Filtern und sterilisieren Sie es mit einem 0,22 μm Filter und lagern Sie es bei 4 °C im Dunkeln. Die endgültige Arbeitskonzentration von RB beträgt 0,2%.
5. Fügen Sie 111 μL von 2% RB zu 1 ml Log-Phase C. albicans in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Kokultur zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 15 und 30 min) bei Raumtemperatur hinzu, um die Absorption von RB in den Zellen zu verstehen (Abbildung 2).
6. Waschen Sie die Co-Kultur dreimal mit 1 ml 1x PBS mit Zentrifugation bei 16.100 x g für 2,5 min bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: aPDT enthält vier verschiedene Bedingungen: absolute Kontrolle (keine Lichteinwirkung, keine RB), Dunkelsteuerung (kein Licht, sondern inkubiert mit RB), Lichtsteuerung (setzt Licht ohne RB aus), aPDT (setzt Licht in Gegenwart von RB aus).
7. Suspendieren Sie die C. albicans in 1 ml von 1x PBS und weisen Sie sie drei verschiedenen Vertiefungen in einer 96-Well-Platte für jeden Zustand zu. Richten Sie die Vertiefungen nach dem Waschen mit dem LED-Array aus.
8. Schalten Sie in lichtexponierten Gruppen den elektrischen Lüfter und das Licht ein.
   HINWEIS: Eine andere Fluenz (J/cm²) kann erreicht werden, indem die Bohrlöcher unterschiedlichen Zeiträumen ausgesetzt werden. Zum Beispiel kommt eine 16,7-minütige Lichtbelichtung auf 10 J / cm 2 mit einer 10 mW / cm² LED-Glühbirne.
9. Nach der Bestrahlung 20 μL der Co-Kulturlösung aus einer Vertiefung in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit 180 μL 1x PBS geben, um eine 10-fache Verdünnung vorzubereiten. Weiter zehnmal verdünnen, anschließend nach der gleichen Methode.
10. Lassen Sie drei Tropfen von 20 μL jeder seriellen Verdünnung auf einen Quadranten einer YPD-Agarplatte fallen, um zählbare Kolonien der Platte zu erreichen. Berechnen Sie die KBE/ml, indem Sie die Kolonien mit den Verdünnungsfaktoren³ multiplizieren.

4. Statistische Auswertung

1. Analysieren Sie die gesammelten Daten mit einer Grafik- und Statistiksoftware (siehe Materialverzeichnis).
2. Zeigen Sie Daten nach Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts an. Führen Sie eine bidirektionale ANOVA-Analyse der Varianz 8 durch, um signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Testbedingungen zu bewerten^.
3. Führen Sie Tukeys mehrere Vergleichstests für paarweise Vergleiche^{durch 8}. Führen Sie für jede verschiedene Behandlung mindestens drei unabhängige Experimente durch. Betrachten Sie den p-Wert < 0,05 statistisch signifikant.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt das aPDT-System, das in der vorliegenden Studie verwendet wird. Da hohe Temperaturen zu einem signifikanten Zelltod führen können, wird das LED-Array durch einen elektrischen Lüfter gekühlt, und während der Bestrahlung wird ein Kühlkörper verwendet, um eine konstante Temperatur bei 25 ± 1 ° C aufrechtzuerhalten. Der Hitzeeffekt kann diskontiert werden. Eine gleichmäßige Lichtverteilung ist auch ein wichtiger bestimmender Faktor für eine erfolgreiche aPDT; Daher...

Diskussion

Ermutigende Ergebnisse der klinischen Anwendungen von RB-PDT bei Pilzkeratitis wurden kürzlich^{berichtet 19}. Der Absorptionspeak von RB liegt bei 450-650 nm. Es ist wichtig, die Fluenzrate der Lichtquelle für eine erfolgreiche aPDT zu bestimmen. Eine hohe Fluenz (normalerweise >100 J / cm²) ist erforderlich, um Krebszellen zu behandeln, während eine niedrigere Fluenz zur Behandlung infizierter Läsionen^{6 erwartet wird}. Eine hohe Fluenz bedeutet eine lange Expos...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745.x
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Falcon, USA	#352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Aluminum foil	sunmei, Tainan, Taiwan
Aluminum heat sink	Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan	BK-T220-0051-01	Disperses heat from the LED array.
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
Graph pad prism software	GraphPad 8.0, San Diego, California, USA		graphing and statistics software
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan	2835	Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63
Incubator	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
Light power meter	Ophir, Jerusalem, Israel	PD300-3W-V1-SENSOR,
Millex 0.22 μm filter	Merck, NJ, USA	SLGVR33RS
Multidrug-resistant Candida albicans	Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan	BCRC 21538/ATCC 10231	http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, MO, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363