JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Растущая заболеваемость лекарственно-устойчивыми Candida albicans является серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Антимикробная фотодинамическая терапия (aPDT) может предложить стратегию борьбы с лекарственно-устойчивыми грибковыми инфекциями. Настоящий протокол описывает опосредованную розой бенгальскую эффективность aPDT на штамме C. albicans in vitro с множественной лекарственной устойчивостью.

Аннотация

Инвазивная инфекция Candida albicans является значительной оппортунистической грибковой инфекцией у людей, потому что она является одним из наиболее распространенных колонизаторов кишечника, рта, влагалища и кожи. Несмотря на доступность противогрибковых препаратов, смертность от инвазивного кандидоза остается ~50%. К сожалению, заболеваемость лекарственно-устойчивымИ C. albicans растет во всем мире. Антимикробная фотодинамическая терапия (aPDT) может предложить альтернативное или адъювантное лечение для ингибирования образования биопленки C. albicans и преодоления лекарственной устойчивости. Роза бенгальская (RB)-опосредованная aPDT показала эффективное уничтожение клеток бактерий и C. albicans. В данном исследовании описана эффективность RB-aPDT на C. albicans с множественной лекарственной устойчивостью. Самодельный зеленый светодиодный (LED) источник света предназначен для выравнивания с центром колодца 96-луночной пластины. Дрожжи инкубировали в колодцах с различными концентрациями RB и освещали различными колебаниями зеленого света. Эффекты уничтожения были проанализированы методом разбавления пластин. При оптимальном сочетании света и RB было достигнуто 3-логарифмическое торможение роста. Был сделан вывод о том, что RB-aPDT может потенциально ингибировать лекарственно-устойчивые C. albicans.

Введение

C. albicans колонизируется в желудочно-кишечном тракте и мочеполовом тракте здоровых людей и может быть обнаружен как нормальная микробиота примерно у 50 процентов лиц1. Если между хозяином и патогеном создается дисбаланс, C. albicans способен вторгаться и вызывать заболевание. Инфекция может варьироваться от локальных инфекций слизистой оболочки до полиорганной недостаточности2. В многоцентровом обсервационном исследовании в США около половины изолятов пациентов с инвазивным кандидозом в период с 2009 по 2017 год составляют C. albicans3. Кандидемия может быть связана с высокими показателями заболеваемости, смертности, длительным пребыванием в стационаре4. Центры США по контролю и профилактике заболеваний сообщили, что около 7% всех протестированных образцов крови Candida устойчивы к противогрибковому препарату флуконазол5. Появление лекарственно-устойчивых видов Candida вызывает обеспокоенность по поводу разработки альтернативной или адъювантной терапии антимикотическими средствами.

Антимикробная фотодинамическая терапия (aPDT) включает активацию определенного фотосенсибилизатора (PS) светом на пиковой длине волны поглощения PS6. После возбуждения возбужденный PS передает свою энергию или электроны соседним молекулам кислорода и возвращается в основное состояние. Во время этого процесса образуются активные формы кислорода и синглетный кислород, которые вызывают повреждение клеток. aPDT широко используется для уничтожения микроорганизмов с 1990-х годов7. Одним из преимуществ aPDT является то, что множественные органеллы повреждаются в клетке синглетным кислородом и/или активными формами кислорода (АФК) во время облучения; таким образом, устойчивость к aPDT не была обнаружена до сегодняшнего дня. Более того, недавнее исследование показало, что бактерии, которые выжили после aPDT, стали более чувствительными к антибиотикам8.

Источники света, используемые в aPDT, включают лазеры, металлические галогенные лампы с фильтрами, ближний инфракрасный свет и светодиоды (LED)9,10,11,12. Лазер обеспечивает высокую световую мощность, обычно превышающую 0,5 Вт /см2, что позволяет доставлять высокую дозу света за очень короткое время. Он широко используется в тех случаях, когда более длительное время лечения неудобно, например, aPDT для инфекций полости рта. Недостатком лазера является то, что его размер пятна освещения небольшой, от нескольких сотен микрометров до 10 мм с рассеивателем. Кроме того, лазерное оборудование стоит дорого и нуждается в специальной подготовке для работы. С другой стороны, площадь облучения металлической галогенной лампы с фильтрами относительно больше13. Однако лампа слишком здоровенная и дорогая. Светодиодные источники света стали основным направлением aPDT в дерматологической области, потому что они небольшие и менее дорогие. Площадь облучения может быть относительно большой при массивном расположении светодиодной лампочки. Все лицо может быть освещено одновременно9. Тем не менее, большинство, если не все, светодиодные источники света, доступные сегодня, предназначены для клинического использования. Он может не подходить для экспериментов в лаборатории, потому что он занимает место и дорог. Мы разработали недорогой светодиодный массив, который очень мал и может быть вырезан и собран из светодиодной ленты. Светодиоды могут быть установлены в различных компоновках для различных экспериментальных конструкций. Различные условия aPDT могут быть выполнены в 96-луночной плите или даже 384-луночной пластине в одном эксперименте.

Роза бенгальская (RB) является цветным красителем, широко используемым для улучшения визуализации повреждений роговицы в глазах человека14. RB-опосредованный aPDT показал убийственное воздействие на золотистый стафилококк, Escherichia coli и C. albicans с примерно сопоставимой эффективностью с эффективностью Toluidine blue O15. Это исследование демонстрирует метод проверки влияния RB-aPDT на C. albicans с множественной лекарственной устойчивостью.

протокол

1. Подготовка системы aPDT

  1. Вырежьте четыре зеленых светодиода (СВЕТОДИОДЫ) из светодиодной ленты (см. Таблицу материалов) и выровняйте их с четырьмя колодцами 96-луночной пластины (рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Светодиоды были расположены в массиве 4 x 3. Задняя часть светодиода была прикреплена к радиатору для рассеивания тепла во время облучения.
  2. Измерьте скорость флюенса11 светодиода при 540 нм с помощью измерителя мощности света (см. Таблицу материалов). Смотрите дополнительный рисунок 1 , чтобы убедиться, что скорость плавного звучания светодиода составляет 510-560 нм.
  3. Поставьте электрический вентилятор рядом с пластиной во время облучения для поддержания постоянной температуры (25 ± 1 °C)11. См. дополнительный рисунок 2 , чтобы убедиться, что постоянная температура среды поддерживается во время облучения.

2. Культивирование дрожжевой формы C. albicans

ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов16 используется C. albicans с множественной лекарственной устойчивостью (BCRC 21538/ATCC 10231), устойчивая к большинству противогрибковых препаратов, включая флуконазол.

  1. Определение чувствительности к антимикотическому препарату методом дисковой диффузии следует из ранее опубликованного отчета17.
  2. Выращивают C. albicans в дрожжевых, гифовых и псевдогифайных формах в зависимости от микроэкологической среды18.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гифы и псевдогифаи формы трудны для точного расчета. Форма дрожжей может быть точно рассчитана под микроскопом или с помощью проточной цитометрии. Температура во время роста клетки определяет ее морфологию. При комнатной температуре (25 °C) почти все клетки имеют дрожжевую форму. Короткая 4-часовая инкубация C. albicans при 30 °C не повлияла на его морфологию дрожжей.

3. aPDT на планктонных C. albicans

  1. Изолируйте одну колонию C. albicans из агаровой пластины стерильной петлей и добавьте ее в 3 мл дрожжевого экстракта пептон декстрозы (YPD) (см. Таблицу материалов) в стерилизованной стеклянной трубке.
    1. Инкубируют трубку при 25 ± 1 °C в течение ночи (14-16 ч) в инкубаторе со скоростью вращения 155 об/мин для расширения C. albicans и поддержания грибка в дрожжевой форме для точной количественной оценки.
  2. Разбавляют культуру на ночь со средним значением OD600 около 0,5 при 30°C и вращают со скоростью 155 об/мин в течение 4 ч для достижения фазы роста бревна C. albicans.
  3. Снова разбавьте культуру логарифмической фазы свежей средой СЛД до значения OD600 0,65 (около 1 x 107 колониеобразующих единиц, КОЕ/мл). Подтверждают конечную концентрацию методом серийного разбавления на агаровой пластине8.
  4. Приготовьте стандартный раствор (4%) розы бенгальской (RB), растворив порошок в 1x PBS. Фильтруйте и стерилизуйте фильтром 0,22 мкм и храните при температуре 4 °C в темноте. Конечная рабочая концентрация РБ составляет 0,2%.
  5. Добавьте 111 мкл 2% RB к 1 мл log-phase C. albicans в 1,5 мл микроцентрифужной трубки и кокультуру в разные моменты времени (0, 15 и 30 мин) при комнатной температуре, чтобы понять поглощение RB в клетках (рисунок 2).
  6. Промыть сокультуру три раза 1 мл 1x PBS с центрифугированием при 16 100 x g в течение 2,5 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: aPDT содержит четыре различных условия: абсолютный контроль (отсутствие воздействия света, отсутствие RB), контроль темноты (нет света, но инкубируется с RB), управление светом (подвергает свету без RB), aPDT (подвергает свету в присутствии RB).
  7. Повторно суспендируйте C. albicans в 1 мл 1x PBS и распределите их по трем различным скважинам в 96 луночной пластине для каждого условия. Выровняйте колодцы со светодиодной решеткой после промывки.
  8. В светлых группах включите электрический вентилятор и свет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различная плавность (Дж/см2) может быть достигнута путем воздействия на скважины различных периодов времени. Например, 16,7-минутная экспозиция света достигает 10 Дж /см2 с светодиодной лампочкой 10 мВт /см2 .
  9. После облучения добавляют 20 мкл раствора кокультуры из одной лунки в центрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую 180 мкл 1x PBS, чтобы получить 10-кратное разведение. Далее разбавляют десять раз, впоследствии следуя тому же методу.
  10. Нанесите три капли по 20 мкл каждого серийного разбавления на один квадрант агаровой пластины YPD, чтобы достичь счетных колоний пластины. Рассчитайте КОЕ/мл, умножив колонии на коэффициенты разбавления3.

4. Статистический анализ

  1. Анализ собранных данных с помощью графического и статистического программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
  2. Отображение данных по среднему значению ± стандартной погрешности среднего значения. Выполните двусторонний ANOVA-анализ дисперсии8 для оценки существенных различий между различными условиями тестирования.
  3. Выполните множественные сравнительные тесты Tukey для парных сравнений8. Для каждого отдельного лечения выполните не менее трех независимых экспериментов. Рассмотрим p-значение < 0,05 статистически значимым.

Результаты

На рисунке 1 показана система aPDT, используемая в настоящем исследовании. Поскольку высокие температуры могут вызвать значительную гибель клеток, светодиодная решетка охлаждается электрическим вентилятором, а во время облучения используется радиатор для поддержания п...

Обсуждение

Обнадеживающие результаты клинического применения RB-PDT при грибковом кератите были зарегистрированы недавно19. Пик поглощения RB находится на уровне 450-650 нм. Для успешного aPDT важно определить скорость флюенса источника света. Высокая флюенс (обычно >100 Дж /см2) требуетс?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа получила финансирование от Центра прикладной наномедицины, Национального университета Ченг Кунг от Программы Исследовательского центра избранных областей в рамках проекта «Ростки высшего образования» Министерства образования (MOE) и Министерства науки и технологий Тайваня [MOST 109-2327-B-006-005] до TW Wong. J.H. Hung признает финансирование от Национальной университетской больницы Чэн Кунг, Тайвань [NCKUH-11006018] и [MOST 110-2314-B-006-086-MY3].

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microfuge tubeNeptune, San Diego, USA#3745.x
5 mL round-bottom tube with cell strainer capFalcon, USA#352235
96-well plateAlpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan#16196
Aluminum foilsunmei, Tainan, Taiwan
Aluminum heat sinkNanyi electronics Co., Ltd., Tainan, TaiwanBK-T220-0051-01Disperses heat from the LED array.
CentrifugeEppendorf, UK5415R
Graph pad prism softwareGraphPad 8.0, San Diego, California, USAgraphing and statistics software
Green light emitting diode (LED) stripNanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan2835Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63
IncubatorYihder, Taipei, TaiwanLM-570D (R)
Light power meterOphir, Jerusalem, IsraelPD300-3W-V1-SENSOR,
Millex 0.22 μm filterMerck, NJ, USASLGVR33RS
Multidrug-resistant Candida albicansBioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, TaiwanBCRC 21538/ATCC 10231http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538
OD600 spectrophotometerBiochrom, London, UKUltrospec 10
Rose BengalSigma-Aldrich, MO, USA330000stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tubeSunmei Co., Ltd., Tainan, TaiwanAK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose MediumHIMEDIA, IndiaM1363

Ссылки

  1. Naglik, J. R., Challacombe, S. J., Hube, B. Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 400-428 (2003).
  2. Pappas, P. G., et al. Clinical practice guideline for the management of candidiasis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 62 (4), 1-50 (2016).
  3. Ricotta, E. E., et al. Invasive candidiasis species distribution and trends, United States, 2009-2017. Journal of Infectious Diseases. 223 (7), 1295-1302 (2021).
  4. Koehler, P., et al. Morbidity and mortality of candidaemia in Europe: an epidemiologic meta-analysis. Clinical Microbiology and Infection. 25 (10), 1200-1212 (2019).
  5. Toda, M., et al. Population-based active surveillance for culture-confirmed candidemia - four sites, United States, 2012-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries. 68 (8), 1-15 (2019).
  6. Lee, C. N., Hsu, R., Chen, H., Wong, T. W. Daylight photodynamic therapy: an update. Molecules. 25 (21), 5195 (2020).
  7. Wainwright, M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 42 (1), 13-28 (1998).
  8. Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant staphylococcus aureus drug resistance. Journal of Clinical Medicine. 8 (3), 411 (2019).
  9. Kim, M. M., Darafsheh, A. Light sources and dosimetry techniques for photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 280-294 (2020).
  10. Wong, T. W., Sheu, H. M., Lee, J. Y., Fletcher, R. J. Photodynamic therapy for Bowen's disease (squamous cell carcinoma in situ) of the digit. Dermatologic Surgery. 27 (5), 452-456 (2001).
  11. Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dermatologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
  12. Stasko, N., et al. Visible blue light inhibits infection and replication of SARS-CoV-2 at doses that are well-tolerated by human respiratory tissue. Scientific Reports. 11 (1), 20595 (2021).
  13. Crosbie, J., Winser, K., Collins, P. Mapping the light field of the Waldmann PDT 1200 lamp: potential for wide-field low light irradiance aminolevulinic acid photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 76 (2), 204-207 (2002).
  14. Feenstra, R. P., Tseng, S. C. Comparison of fluorescein and rose bengal staining. Ophthalmology. 99 (4), 605-617 (1992).
  15. Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Effect of cell-photosensitizer binding and cell density on microbial photoinactivation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (6), 2329-2335 (2005).
  16. Shahid, H., et al. Duclauxin derivatives from fungi and their biological activities. Frontiers in Microbiology. 12, 766440 (2021).
  17. Arendrup, M. C., Park, S., Brown, S., Pfaller, M., Perlin, D. S. Evaluation of CLSI M44-A2 disk diffusion and associated breakpoint testing of caspofungin and micafungin using a well-characterized panel of wild-type and fks hot spot mutant Candida isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (5), 1891-1895 (2011).
  18. Mukaremera, L., Lee, K. K., Mora-Montes, H. M., Gow, N. A. R. Candida albicans yeast, pseudohyphal, and hyphal morphogenesis differentially affects immune recognition. Frontiers in Immunology. 8, 629 (2017).
  19. Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).
  20. Martinez, J. D., et al. Rose Bengal photodynamic antimicrobial therapy: a pilot safety study. Cornea. 40 (8), 1036-1043 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены