Etablierung von Zebrafisch-Xenotransplantaten aus Bauchspeicheldrüsenkrebs für Chemosensitivitätstests

Summary

Präklinische Modelle zielen darauf ab, das Wissen über die Krebsbiologie zu erweitern und die Wirksamkeit der Behandlung vorherzusagen. Diese Arbeit beschreibt die Erzeugung von zebrafischbasierten patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (zPDXs) mit Tumorgewebefragmenten. Die zPDXs wurden mit einer Chemotherapie behandelt, deren therapeutischer Effekt anhand der Zellapoptose des transplantierten Gewebes beurteilt wurde.

Abstract

Krebs ist weltweit eine der häufigsten Todesursachen, und die Inzidenz vieler Krebsarten nimmt weiter zu. In Bezug auf Screening, Prävention und Behandlung wurden große Fortschritte erzielt. Präklinische Modelle, die das Chemosensitivitätsprofil von Krebspatienten vorhersagen, fehlen jedoch noch. Um diese Lücke zu schließen, wurde ein in vivo patientenabgeleitetes Xenograft-Modell entwickelt und validiert. Das Modell basierte auf Zebrafischembryonen (Danio rerio) 2 Tage nach der Befruchtung, die als Empfänger von Xenotransplantatfragmenten von Tumorgewebe verwendet wurden, die aus einer chirurgischen Probe einer Patientin entnommen wurden.

Es ist auch erwähnenswert, dass bioptische Proben nicht verdaut oder disaggregiert wurden, um die Tumormikroumgebung aufrechtzuerhalten, was für die Analyse des Tumorverhaltens und des Ansprechens auf die Therapie von entscheidender Bedeutung ist. Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Herstellung von zebrafischbasierten patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (zPDXs) aus der chirurgischen Resektion eines primären soliden Tumors. Nach dem Screening durch einen Anatomopathen wird die Probe mit einer Skalpellklinge präpariert. Nekrotisches Gewebe, Gefäße oder Fettgewebe werden entfernt und dann in 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm große Stücke geschnitten.

Die Stücke werden dann fluoreszenzmarkiert und in den perivitellinen Raum von Zebrafischembryonen xenotransplantiert. Eine große Anzahl von Embryonen kann kostengünstig verarbeitet werden, was Hochdurchsatz-In-vivo-Analysen der Chemosensitivität von zPDXs gegenüber mehreren Krebsmedikamenten ermöglicht. Konfokale Bilder werden routinemäßig aufgenommen, um die durch die Chemotherapie induzierten apoptotischen Konzentrationen im Vergleich zur Kontrollgruppe zu erkennen und zu quantifizieren. Das Xenotransplantat-Verfahren hat einen erheblichen Zeitvorteil, da es an einem einzigen Tag abgeschlossen werden kann, was ein angemessenes Zeitfenster für die Durchführung eines therapeutischen Screenings für koklinische Studien bietet.

Introduction

Eines der Probleme der klinischen Krebsforschung besteht darin, dass Krebs nicht eine einzelne Krankheit ist, sondern eine Vielzahl verschiedener Krankheiten, die sich im Laufe der Zeit entwickeln können und je nach den Eigenschaften des Tumors selbst und des Patienten spezifische Behandlungen erfordern¹. Folglich besteht die Herausforderung darin, sich in Richtung einer patientenorientierten Krebsforschung zu bewegen, um neue personalisierte Strategien für die frühe Vorhersage von Krebsbehandlungsergebnissen zu identifizieren². Dies ist besonders relevant für das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC), da e....

Protocol

Das italienische Gesundheitsministerium genehmigte alle beschriebenen Tierversuche in Übereinstimmung mit der Richtlinie 2010/63/EU über die Verwendung und Pflege von Tieren. Die lokale Ethikkommission genehmigte die Studie unter der Registrierungsnummer 70213. Von allen beteiligten Probanden wurde eine informierte Einwilligung eingeholt. Vor dem Start sollten alle Lösungen und die Ausrüstung vorbereitet werden (Abschnitt 1) und die Fische gekreuzt werden (Abschnitt 2).

1. Vorbereitu.......

Discussion

In-vivo-Modelle in der Krebsforschung bieten unschätzbare Werkzeuge, um die Krebsbiologie zu verstehen und das Ansprechen auf die Krebsbehandlung vorherzusagen. Aktuell stehen verschiedene In-vivo-Modelle zur Verfügung, zum Beispiel gentechnisch veränderte Tiere (transgene und Knockout-Mäuse) oder patienteneigene Xenotransplantate aus menschlichen Primärzellen. Trotz vieler optimaler Funktionen hat jede von ihnen verschiedene Einschränkungen. Insbesondere fehlt den oben genannten Modellen eine zuv.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Teva Pharma AG	SMP 1532755
48 multiwell plate	Sarstedt	83 3923
96 multiwell plate	Sarstedt	82.1581.001
Acetone	Merck	179124
Agarose powder	Merck	A9539
Amphotericin	Thermo Fisher Scientific	15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Merck	MAB1281	1:200 dilution
Aquarium net QN6	Penn-plax	0-30172-23006-6
BSA	Merck	A9418
CellTrace	Thermo Fisher Scientific	C34567
CellTracker CM-DiI	Thermo Fisher Scientific	C7001
CellTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	9661S	1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	PanReac AppliChem ITW Reagents	A3672,0250
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	501985
Folinic acid -  Lederfolin	Pfizer
Glass capillaries, 3.5"	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.
Glass vials	VWR International	WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244	1:500 dilution
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	31872
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Irinotecan	Hospira
Low Temperature Freezer Vials	VWR International	479-1220
McIlwain Tissue Chopper	World Precision Instruments
Microplate Mixer	SCILOGEX	822000049999
Oxaliplatin	Teva
Paraformaldehyde	Merck	P6148-500G
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190094
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish 100 mm	Sarstedt	83 3902500
Petri dish 60 mm	Sarstedt	83 3901
Plastic Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171.010
Poly-Mount	Tebu-bio	18606-5
Propidium iodide	Merck	P4170
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel	VWR International	SWAN3001
Scalpel handle #3	World Precision Instruments	500236
Tricaine	Merck	E10521
Triton X-100	Merck	T8787
Tween 20	Merck	P9416
Vertical Micropipette Puller	Shutter instrument	P-30