Etablierung von Zebrafisch-Xenotransplantaten aus Bauchspeicheldrüsenkrebs für Chemosensitivitätstests

Zusammenfassung

Präklinische Modelle zielen darauf ab, das Wissen über die Krebsbiologie zu erweitern und die Wirksamkeit der Behandlung vorherzusagen. Diese Arbeit beschreibt die Erzeugung von zebrafischbasierten patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (zPDXs) mit Tumorgewebefragmenten. Die zPDXs wurden mit einer Chemotherapie behandelt, deren therapeutischer Effekt anhand der Zellapoptose des transplantierten Gewebes beurteilt wurde.

Zusammenfassung

Krebs ist weltweit eine der häufigsten Todesursachen, und die Inzidenz vieler Krebsarten nimmt weiter zu. In Bezug auf Screening, Prävention und Behandlung wurden große Fortschritte erzielt. Präklinische Modelle, die das Chemosensitivitätsprofil von Krebspatienten vorhersagen, fehlen jedoch noch. Um diese Lücke zu schließen, wurde ein in vivo patientenabgeleitetes Xenograft-Modell entwickelt und validiert. Das Modell basierte auf Zebrafischembryonen (Danio rerio) 2 Tage nach der Befruchtung, die als Empfänger von Xenotransplantatfragmenten von Tumorgewebe verwendet wurden, die aus einer chirurgischen Probe einer Patientin entnommen wurden.

Es ist auch erwähnenswert, dass bioptische Proben nicht verdaut oder disaggregiert wurden, um die Tumormikroumgebung aufrechtzuerhalten, was für die Analyse des Tumorverhaltens und des Ansprechens auf die Therapie von entscheidender Bedeutung ist. Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Herstellung von zebrafischbasierten patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (zPDXs) aus der chirurgischen Resektion eines primären soliden Tumors. Nach dem Screening durch einen Anatomopathen wird die Probe mit einer Skalpellklinge präpariert. Nekrotisches Gewebe, Gefäße oder Fettgewebe werden entfernt und dann in 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm große Stücke geschnitten.

Die Stücke werden dann fluoreszenzmarkiert und in den perivitellinen Raum von Zebrafischembryonen xenotransplantiert. Eine große Anzahl von Embryonen kann kostengünstig verarbeitet werden, was Hochdurchsatz-In-vivo-Analysen der Chemosensitivität von zPDXs gegenüber mehreren Krebsmedikamenten ermöglicht. Konfokale Bilder werden routinemäßig aufgenommen, um die durch die Chemotherapie induzierten apoptotischen Konzentrationen im Vergleich zur Kontrollgruppe zu erkennen und zu quantifizieren. Das Xenotransplantat-Verfahren hat einen erheblichen Zeitvorteil, da es an einem einzigen Tag abgeschlossen werden kann, was ein angemessenes Zeitfenster für die Durchführung eines therapeutischen Screenings für koklinische Studien bietet.

Einleitung

Eines der Probleme der klinischen Krebsforschung besteht darin, dass Krebs nicht eine einzelne Krankheit ist, sondern eine Vielzahl verschiedener Krankheiten, die sich im Laufe der Zeit entwickeln können und je nach den Eigenschaften des Tumors selbst und des Patienten spezifische Behandlungen erfordern¹. Folglich besteht die Herausforderung darin, sich in Richtung einer patientenorientierten Krebsforschung zu bewegen, um neue personalisierte Strategien für die frühe Vorhersage von Krebsbehandlungsergebnissen zu identifizieren². Dies ist besonders relevant für das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC), da es mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 11 % als schwer zu behandelnder Krebs ^gilt3.

Die späte Diagnose, das schnelle Fortschreiten und das Fehlen wirksamer Therapien sind nach wie vor die drängendsten klinischen Probleme der PDAC. Die größte Herausforderung besteht daher darin, den Patienten zu modellieren und Biomarker zu identifizieren, die in der Klinik angewendet werden können, um die wirksamste Therapie im Einklang mit der personalisierten Medizin auszuwählen ^4,5,6. Im Laufe der Zeit wurden neue Ansätze zur Modellierung von Krebserkrankungen vorgeschlagen: Patienten-abgeleitete Organoide (PDOs) und von Maus-Patienten abgeleitete Xenotransplantate (mPDXs) stammen aus einer Quelle menschlichen Tumorgewebes. Sie wurden verwendet, um die Krankheit zu reproduzieren, um das Ansprechen und die Resistenz gegen die Therapie sowie das Wiederauftreten der Krankheit zu untersuchen ^7,8,9.

In ähnlicher Weise hat das Interesse an zebrafischbasierten patientenabgeleiteten Xenotransplantat-Modellen (zPDX) zugenommen, dank ihrer einzigartigen und vielversprechenden Eigenschaften¹⁰, die ein schnelles und kostengünstiges Werkzeug für die Krebsforschung darstellen^11,12. zPDX-Modelle benötigen nur eine kleine Tumorstichprobengröße, was ein Hochdurchsatz-Screening der Chemotherapie möglich macht¹³. Die gebräuchlichste Technik, die für zPDX-Modelle verwendet wird, basiert auf einem vollständigen Probenverdau und der Implantation der primären Zellpopulationen, die den Tumor teilweise reproduziert, aber die Nachteile einer fehlenden Tumormikroumgebung und einer Wechselwirkung zwischen bösartigen und gesunden Zellen hat¹⁴.

Diese Arbeit zeigt, wie zPDXs als präklinisches Modell verwendet werden können, um das Chemosensitivitätsprofil von Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs zu identifizieren. Die wertvolle Strategie erleichtert den Xenotransplantat-Prozess, da keine Zellexpansion erforderlich ist, was eine Beschleunigung des Chemotherapie-Screenings ermöglicht. Die Stärke des Modells besteht darin, dass alle Komponenten der Mikroumgebung so erhalten bleiben, wie sie im Krebsgewebe des Patienten sind, denn das Verhalten des Tumors hängt bekanntlich von ihrem Zusammenspiel ab^15,16. Dies ist gegenüber alternativen Methoden in der Literatur sehr günstig, da es möglich ist, die Tumorheterogenität zu erhalten und patientenspezifisch zur Verbesserung der Vorhersagbarkeit des Behandlungsergebnisses und des Rezidivs beizutragen, so dass das zPDX-Modell in koklinischen Studien eingesetzt werden kann. Dieses Manuskript beschreibt die Schritte, die zur Erstellung des zPDX-Modells erforderlich sind, beginnend mit einer Tumorresektion des Patienten und deren Behandlung, um das Ansprechen auf die Chemotherapie zu analysieren.

Protokoll

Das italienische Gesundheitsministerium genehmigte alle beschriebenen Tierversuche in Übereinstimmung mit der Richtlinie 2010/63/EU über die Verwendung und Pflege von Tieren. Die lokale Ethikkommission genehmigte die Studie unter der Registrierungsnummer 70213. Von allen beteiligten Probanden wurde eine informierte Einwilligung eingeholt. Vor dem Start sollten alle Lösungen und die Ausrüstung vorbereitet werden (Abschnitt 1) und die Fische gekreuzt werden (Abschnitt 2).

1. Vorbereitung von Lösungen und Geräten

HINWEIS: In Tabelle 1 finden Sie die Lösungen und Medien, die vorbereitet werden müssen.

1. Unterstützung von Agarose-Gel
   1. Wiegen Sie das Agarosepulver in einem mikrowellengeeigneten Kolben ab und lösen Sie es in einem bestimmten Volumen E3-Zebrafischmedium auf, um ein 1%iges Gel herzustellen. In der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat.
      Anmerkungen: Überkochen Sie die Lösung nicht.
   2. Gießen Sie die geschmolzene Agarose in eine Petrischale und warten Sie, bis das Gel vollständig erstarrt ist.
   3. Machen Sie kleine Agarosezylinder (~5 mm hoch) mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff mit abgeschnittener Spitze. Nach der Zubereitung in einer in Alufolie gewickelten Petrischale bei 4 °C lagern.
2. Mikronadeln aus Glas
   1. Ziehen Sie die Kapillaren aus Borosilikatglas mit einem Abzieher, um feine Nadeln zu erhalten (Einstellungen: HEAT 990, PULL 550).
      HINWEIS: Aus einer Kapillare können zwei feine Nadeln mit einem Spitzendurchmesser von 10 μm gewonnen werden.

2. Fischkreuzung und Eiersammlung

1. Übertragen Sie erwachsene Fische 3 Tage vor der Gewebeimplantation in Aufzuchtbecken, wie von Avdesh et ^al.17 beschrieben.
2. HINWEIS: Ein Verhältnis von 1:1 oder 2:3 von Männern zu Frauen wird empfohlen. Die Fischdichte sollte maximal fünf Fische pro Liter Wasser betragen. Halten Sie Männchen und Weibchen über Nacht mit einer Barriere getrennt.
3. Entfernen Sie am nächsten Tag die Barriere und lassen Sie die Fische sich paaren.
4. Entfernen Sie die Fische aus den Zuchtbecken und bringen Sie sie in ihre Haltungsbecken zurück.
5. Gießen Sie das Wasser aus dem Aufzuchtbecken durch ein feinmaschiges Netz. Übertragen Sie die befruchteten Eier in eine Petrischale mit E3-Zebrafischmedium.
6. Überprüfen Sie die Petrischale mit einem Stereomikroskop und entsorgen Sie die trüben Eier. Bewahren Sie die befruchteten Eier in frischem E3-Zebrafischmedium bei 28 °C auf.

3. Probensammlung

Anmerkungen: Autoklavenzange und Skalpellgriff.

1. Sofortige Bearbeitung
   1. Die chirurgische Probe des Tumors wird in 10 ml Tumormedium bei 4 °C (Tumorprobe mit einem Durchmesser von 5 mm bis 10 mm) entnommen. Übertragen Sie die Probe bei 4 °C von der gewünschten Stelle zur sofortigen Verarbeitung.
2. Lagerung über Nacht (optional)
   1. Sammeln Sie die chirurgische Tumorprobe in 10 ml Tumormedium und lagern Sie die Probe über Nacht bei 4 °C.
3. Lagerung bei -80 °C (optional, am wenigsten empfohlen)
   1. Lagern Sie die Probe bei -80 °C in einem kryogenen Fläschchen mit Tumormedium, das mit 5 % Dimethylsulfoxid (DMSO) angereichert ist.

4. Probenverarbeitung

Anmerkungen: Führen Sie die Schritte unter einer sterilen Gewebekultur-Laminar-Flow-Haube durch.

1. Waschen Sie das gesamte Tumorgewebe mit 5 ml frischem Tumormedium und pipettieren Sie 10x mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff auf und ab. Saugen Sie das Waschmedium ab und entsorgen Sie es. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
   Anmerkungen: Vermeiden Sie eine Aspiration des Tumorgewebes, da es an der Pasteurpipette aus Kunststoff haften bleiben könnte.
2. Die Probe wird in eine Petrischale überführt und in 1-2 ml frisches Tumormedium getaucht. Schneiden Sie die Tumorprobe mit einer Skalpellklinge in kleine Stücke (1-2 mm³) und legen Sie sie in ein steriles 5-ml-Kunststoffröhrchen mit Tumormedium.
3. Stellen Sie den McIlwain-Taschenhäcksler auf eine Dicke von 100 μm ein. Legen Sie die Probenfragmente auf den runden Plastiktisch des Häckslers und hacken Sie sie. Drehen Sie den Tisch um 90° und wiederholen Sie das Hacken.
4. Zentrifugieren Sie die Fragmente bei 300 × g für 3 Minuten. Saugen Sie dann den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn.
5. Inkubieren Sie die Fragmente mit einem fluoreszierenden Zelltracker, CM-DiI (Endkonzentration von 10 μg/ml in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung [DPBS]), Deep Red (Endkonzentration von 1 μl/ml in DPBS) oder CellTrace (Endkonzentration von 5 μM in DPBS) für 30 Minuten und legen Sie das Röhrchen in ein 37 °C warmes Wasserbad.
6. Resuspendieren Sie die Fragmente, indem Sie alle 10 Minuten vorsichtig auf und ab pipettieren.
   HINWEIS: Im Falle von CellTrace fügen Sie am Ende der Inkubation gemäß den Anweisungen des Herstellers ein Medium hinzu, das mindestens 1 % Protein enthält.
7. Bei 300 x g 3 min zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x mit 1 ml DPBS, um nicht eingearbeiteten Farbstoff zu entfernen.
8. Suspendieren Sie die Fragmente in 5 ml DPBS in einer 60-mm-Petrischale.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, dass das Gewebe nicht austrocknet.

5. Etablierung von zPDX

Anmerkungen: Führen Sie die Schritte unter einer sterilen Gewebekultur-Laminar-Flow-Haube durch.

1. Betäuben Sie die Embryonen 2 Tage nach der Befruchtung (dpf) mit 0,16 mg/ml Tricain in E3-Zebrafischmedium.
2. Legen Sie drei Agarosezylinder (Schritt 1.1.3) in eine Petrischale und legen Sie einen Zebrafischembryo auf einen Zylinder, wobei Sie eine Seite freilegen. Entfernen Sie die überschüssige Lösung, um den Embryo in einem dünnen Film zu halten.
3. Übertragen Sie das gefärbte Gewebestück mit einer sterilen Pinzette aus der Petrischale auf den 1%igen Agaroseträger, auf dem der Embryo liegt. Nehmen Sie das Gewebe auf, legen Sie es auf das Embryonalgelb und schieben Sie es dann mit der wärmegezogenen Glasmikronadel in den perivitellinen Raum (Schritt 1.2.1).
4. Geben Sie vorsichtig einige Tropfen E3 1% Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptokokken) in den Embryo, um ihn wieder in die Flüssigkeit zu bringen.
5. Wiederholen Sie die Schritte 5.2-5.4 für alle Embryonen, entfernen Sie schließlich die Agarosestützen aus der Petrischale und inkubieren Sie die Embryonen bei 35 °C.
6. Kontrollieren Sie die Embryonen 2 h nach der Implantation mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop auf die richtigen Xenotransplantate (positive Färbung). Verwerfen Sie die Embryonen mit Tumorfragmenten, die sich nicht vollständig im perivitellinen Raum befinden, sowie die toten Embryonen. Verteilen Sie die Embryonen nach dem Zufallsprinzip auf sechs Multi-Well-Platten (maximal n = 20 Embryonen/Well), die gemäß dem Versuchsplan gleichmäßig in Gruppen aufgeteilt werden (z. B. Kontrolle und FOLFOXIRI).

6. Behandlung

1. Verdünnen Sie das Arzneimittel (z. B. 5-Fluorouracil, Oxaliplatin, Irinotecan) in E3 1% Pen-Streptokokken und mischen Sie es gründlich, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Wie von Usai et ^al.12 vorgeschlagen, verwenden Sie eine fünffache Verdünnung des Arzneimittels im Fischwasser in Bezug auf die äquivalente Plasmakonzentration (EPC).
2. Mischen Sie die Drogen, um den Cocktail zuzubereiten (z. B. FOLFOXIRI).
3. Entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie den Medikamentencocktail 2 Stunden nach der Implantation hinzu.
4. Behandeln Sie die Embryonen 3 Tage lang. Erneuern Sie den Drogencocktail jeden Tag.

7. Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung

Anmerkungen: Bevor Sie beginnen, stellen Sie Aceton auf -20 °C ein und bereiten Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Lösungen vor.

1. Tag 1:
   1. Fixieren Sie die Larven mit 1 ml 4%igem Paraformaldehyd in Glasfläschchen bei 4 °C über Nacht.
2. Tag 2:
   1. Waschen Sie die Larven 3 x 5 min mit 1 ml PBS unter leichtem Rühren auf einer Laborplattformwippe (400 U/min).
   2. In 1 ml 100%igem Methanol bei -20 °C über Nacht lagern (oder zur Langzeitlagerung).
   3. Rehydrieren Sie 3 x 10 min mit 1 ml PTw (0,1 % Tween in PBS) unter leichtem Rühren auf einer Laborplattformwippe (400 U/min).
   4. Permeabilisieren Sie mit 1 ml 150 mM Tris-HCl bei pH 8,8 für 5 min bei RT, gefolgt von einer Erhitzung für 15 min bei 70 °C.
   5. 2 x 10 min mit 1 ml PTw unter leichtem Rühren auf einer Laborpodestwippe (400 U/min) waschen.
   6. 2 x 5 min mit 1 ml dH₂O unter leichtem Rühren auf einer Labortischwippe (400 U/min) waschen.
   7. Mit 1 ml eiskaltem Aceton für 20 min bei -20 °C permeabilieren.
   8. 2 x 5 min mit 1 ml dH₂O unter leichtem Rühren auf einer Labortischwippe (400 U/min) waschen.
   9. 2 x 5 min mit 1 ml PTw unter leichtem Rühren auf einer Laborpodestwippe (400 U/min) waschen.
   10. Inkubieren Sie die Larven in 1 ml Blockierpuffer für 3 h bei 4 °C unter leichtem Rühren auf einer Laborplattformwippe (400 U/min).
   11. Platzieren Sie die Larven in Vertiefungsplatten, die nach Gruppen wie folgt unterteilt sind: 10 Larven in 50 μl Volumen/Vertiefung in einer 96-Well-Platte oder 20 Larven in 100 μl Volumen/Vertiefung in einer 48-Well-Platte.
   12. Verwerfen Sie den Blockierungspuffer, inkubieren Sie die Larven mit einer primären Antikörperlösung (z. B. Kaninchen-Anti-Human-Caspase-3, 1:250), die in Inkubationspuffer über Nacht bei 4 °C im Dunkeln verdünnt ist, und schaukeln Sie vorsichtig auf einer Schüttelplatte (400 U/min). In Schritt 7.2.11 finden Sie die empfohlenen Volumes.
3. Tag 3:
   1. Waschen Sie die Larven nacheinander 3 x 1 h mit 1 mL PBS-TS (10% Ziegenserum, 1% Triton X-100 in PBS) und dann mit 2 x 10 min mit 1 mL PBS-T (1% Triton X-100 in PBS) und 2 x 1 h mit 1 mL PBS-TS. Rühren Sie bei jedem Waschgang die Platten mit den Larven vorsichtig auf einer Schüttelplatte (400 U/min).
   2. Inkubation der Larven mit Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Sekundärantikörpern (z. B. Goat anti-Rabbit IgG [H+L] cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647, 1:500) und 100 μg/ml Hoechst 33258 verdünnt in Inkubationspuffer über Nacht bei 4 °C unter leichtem Rühren auf einer Schüttelplatte (400 U/min). In Schritt 7.2.11 finden Sie die empfohlenen Volumina der sekundären Antikörperlösung.
4. Tag 4:
   1. Waschen Sie 3 x 1 h mit 1 mL PBS-TS und 2 x 1 h mit 1 mL PTw, unter leichtem Rühren auf einer Schüttelplatte (400 U/min).
   2. Erzeugen Sie mit dem Zahnschmelz eine kreisförmige Schicht (Dicke von ~0,5-1 mm) auf Objektträgern. Lassen Sie den Zahnschmelz austrocknen und legen Sie die Larven in die Mitte der kreisförmigen Schicht, wobei die Seite des Xenotransplantats freigelegt wird.
   3. Trocknen Sie die überschüssige Lösung und montieren Sie das Glasdeckglas mit einem wasserlöslichen, nicht fluoreszierenden Eindeckmedium.

8. Bildgebung

1. Nehmen Sie Bilder unter konfokaler Mikroskopie mit einem 40-fachen Objektiv auf. Verwenden Sie die folgenden Erfassungsparameter: eine Auflösung von 1024 x 512 Pixeln mit einem Z-Abstand von 5 μm.

9. Analyse der Apoptose durch ImageJ

1. Laden Sie (Fiji Is Just) ImageJ-Software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) und öffnen Sie das Z-Stack-Dateiimage (klicken Sie auf Datei | Offen). Wählen Sie im Popup-Fenster Stack-Ansicht/Hyperstack aus und klicken Sie auf OK.
2. Überlagern Sie die verschiedenen Kanäle, indem Sie Bild | Farbe | Komposit erstellen.
3. Ziehen Sie den Z-Balken am unteren Rand des Bildes, um durch das Z-Stapelbild zu blättern und den Xenotransplantatbereich zu identifizieren (Zellen, die Fluoreszenzzell-Tracker-positiv sind. Siehe Schritt 4.5) im perivitellinen Raum des Zebrafisches.
4. Wählen Sie das Punktwerkzeug aus, und zählen Sie die Anzahl der apoptotischen menschlichen Zellen (positiver bis fluoreszierender Zelltracker und gespaltene Caspase-3), wie im ergänzenden Video S1 gezeigt.
5. Doppelklicken Sie auf das Symbol des Punktwerkzeugs , ändern Sie den Zähler und zählen Sie die Gesamtzahl der menschlichen Zellkerne (Kerne von CM-DiI-positiven Zellen).

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt den experimentellen Ansatz zur Etablierung von zPDXs aus dem primären humanen Pankreas-Adenokarzinom. Eine Tumorprobe wurde entnommen, zerkleinert und mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbt, wie in Protokollabschnitt 4 beschrieben. Die zPDXs wurden dann erfolgreich durch Implantation eines Tumorstücks in den perivitellinen Raum von 2 dpf-Zebrafischembryonen etabliert, wie in Protokollabschnitt 5 beschrieben. Wie in Protokollabschnitt 6 beschrieben, wurden die zPDXs weiter gescreent, um die Chemot...

Diskussion

In-vivo-Modelle in der Krebsforschung bieten unschätzbare Werkzeuge, um die Krebsbiologie zu verstehen und das Ansprechen auf die Krebsbehandlung vorherzusagen. Aktuell stehen verschiedene In-vivo-Modelle zur Verfügung, zum Beispiel gentechnisch veränderte Tiere (transgene und Knockout-Mäuse) oder patienteneigene Xenotransplantate aus menschlichen Primärzellen. Trotz vieler optimaler Funktionen hat jede von ihnen verschiedene Einschränkungen. Insbesondere fehlt den oben genannten Modellen eine zuv...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Teva Pharma AG	SMP 1532755
48 multiwell plate	Sarstedt	83 3923
96 multiwell plate	Sarstedt	82.1581.001
Acetone	Merck	179124
Agarose powder	Merck	A9539
Amphotericin	Thermo Fisher Scientific	15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Merck	MAB1281	1:200 dilution
Aquarium net QN6	Penn-plax	0-30172-23006-6
BSA	Merck	A9418
CellTrace	Thermo Fisher Scientific	C34567
CellTracker CM-DiI	Thermo Fisher Scientific	C7001
CellTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	9661S	1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	PanReac AppliChem ITW Reagents	A3672,0250
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	501985
Folinic acid -  Lederfolin	Pfizer
Glass capillaries, 3.5"	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.
Glass vials	VWR International	WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244	1:500 dilution
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	31872
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Irinotecan	Hospira
Low Temperature Freezer Vials	VWR International	479-1220
McIlwain Tissue Chopper	World Precision Instruments
Microplate Mixer	SCILOGEX	822000049999
Oxaliplatin	Teva
Paraformaldehyde	Merck	P6148-500G
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190094
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish 100 mm	Sarstedt	83 3902500
Petri dish 60 mm	Sarstedt	83 3901
Plastic Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171.010
Poly-Mount	Tebu-bio	18606-5
Propidium iodide	Merck	P4170
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel	VWR International	SWAN3001
Scalpel handle #3	World Precision Instruments	500236
Tricaine	Merck	E10521
Triton X-100	Merck	T8787
Tween 20	Merck	P9416
Vertical Micropipette Puller	Shutter instrument	P-30