Etablering af zebrafisk patientafledte xenotransplantater fra kræft i bugspytkirtlen til kemosensitivitetstest

Summary

Prækliniske modeller sigter mod at fremme viden om kræftbiologi og forudsige behandlingseffektivitet. Dette papir beskriver dannelsen af zebrafiskbaserede patientafledte xenotransplantater (zPDX'er) med tumorvævsfragmenter. zPDX'erne blev behandlet med kemoterapi, hvis terapeutiske virkning blev vurderet med hensyn til celleapoptose i det transplanterede væv.

Abstract

Kræft er en af de vigtigste dødsårsager på verdensplan, og forekomsten af mange typer kræft fortsætter med at stige. Der er gjort store fremskridt med hensyn til screening, forebyggelse og behandling; Der mangler dog stadig prækliniske modeller, der forudsiger kræftpatienters kemosensitivitetsprofil. For at udfylde dette hul blev der udviklet og valideret en in vivo patientafledt xenograftmodel. Modellen var baseret på zebrafisk (Danio rerio) embryoner 2 dage efter befrugtning, som blev brugt som modtagere af xenograft fragmenter af tumorvæv taget fra en patients kirurgiske prøve.

Det er også værd at bemærke, at bioptiske prøver ikke blev fordøjet eller disaggregeret for at opretholde tumormikromiljøet, hvilket er afgørende med hensyn til analyse af tumoradfærd og respons på terapi. Protokollen beskriver en metode til etablering af zebrafiskbaserede patientafledte xenotransplantater (zPDX'er) fra primær solid tumorkirurgisk resektion. Efter screening af en anatomiopatog dissekeres prøven ved hjælp af et skalpelblad. Nekrotisk væv, kar eller fedtvæv fjernes og hakkes derefter i stykker på 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm.

Stykkerne mærkes derefter fluorescerende og xenotransplanteres i perivitellinerummet hos zebrafiskembryoner. Et stort antal embryoner kan behandles til en lav pris, hvilket muliggør in vivo-analyser med høj kapacitet af zPDX'ers kemofølsomhed over for flere kræftlægemidler. Konfokale billeder erhverves rutinemæssigt for at detektere og kvantificere de apoptotiske niveauer induceret af kemoterapibehandling sammenlignet med kontrolgruppen. Xenograftproceduren har en betydelig tidsfordel, da den kan gennemføres på en enkelt dag, hvilket giver et rimeligt tidsvindue til at udføre en terapeutisk screening for cokliniske forsøg.

Introduction

Et af problemerne med klinisk kræftforskning er, at kræft ikke er en enkelt sygdom, men en række forskellige sygdomme, der kan udvikle sig over tid, hvilket kræver specifikke behandlinger afhængigt af selve tumorens egenskaber og patienten¹. Derfor er udfordringen at bevæge sig mod patientorienteret kræftforskning for at identificere nye personaliserede strategier til tidlig forudsigelse af kræftbehandlingsresultater². Dette er især relevant for pancreas ductal adenocarcinom (PDAC), da det betragtes som en svær at behandle kræft med en 5-årig overlevelsesrate på 11%³.

D....

Protocol

Det italienske ministerium for folkesundhed godkendte alle de beskrevne dyreforsøg i overensstemmelse med direktiv 2010/63/EU om brug og pasning af dyr. Den lokale etiske komité godkendte undersøgelsen under registreringsnummer 70213. Der blev indhentet informeret samtykke fra alle involverede forsøgspersoner. Før start skal alle opløsninger og udstyr forberedes (afsnit 1), og fisken skal krydses (afsnit 2).

1. Fremstilling af opløsninger og udstyr

Discussion

In vivo-modeller i kræftforskning giver uvurderlige værktøjer til at forstå kræftbiologi og forudsige kræftbehandlingsresponsen. I øjeblikket findes der forskellige in vivo-modeller , f.eks. genetisk modificerede dyr (transgene mus og knockout-mus) eller patientafledte xenotransplantater fra humane primære celler. På trods af mange optimale funktioner har hver enkelt forskellige begrænsninger. Især mangler de ovennævnte modeller en pålidelig måde at efterligne patientens tumorvævsmikromil.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Teva Pharma AG	SMP 1532755
48 multiwell plate	Sarstedt	83 3923
96 multiwell plate	Sarstedt	82.1581.001
Acetone	Merck	179124
Agarose powder	Merck	A9539
Amphotericin	Thermo Fisher Scientific	15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Merck	MAB1281	1:200 dilution
Aquarium net QN6	Penn-plax	0-30172-23006-6
BSA	Merck	A9418
CellTrace	Thermo Fisher Scientific	C34567
CellTracker CM-DiI	Thermo Fisher Scientific	C7001
CellTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	9661S	1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	PanReac AppliChem ITW Reagents	A3672,0250
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	501985
Folinic acid -  Lederfolin	Pfizer
Glass capillaries, 3.5"	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.
Glass vials	VWR International	WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244	1:500 dilution
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	31872
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Irinotecan	Hospira
Low Temperature Freezer Vials	VWR International	479-1220
McIlwain Tissue Chopper	World Precision Instruments
Microplate Mixer	SCILOGEX	822000049999
Oxaliplatin	Teva
Paraformaldehyde	Merck	P6148-500G
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190094
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish 100 mm	Sarstedt	83 3902500
Petri dish 60 mm	Sarstedt	83 3901
Plastic Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171.010
Poly-Mount	Tebu-bio	18606-5
Propidium iodide	Merck	P4170
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel	VWR International	SWAN3001
Scalpel handle #3	World Precision Instruments	500236
Tricaine	Merck	E10521
Triton X-100	Merck	T8787
Tween 20	Merck	P9416
Vertical Micropipette Puller	Shutter instrument	P-30