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  • Divulgaciones
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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí se describen los protocolos para preparar conjuntos de virus adecuados para el análisis de EM líquido y crio-EM a nanoescala utilizando microscopía electrónica de transmisión.

Resumen

El interés en la microscopía de electrones líquidos (EM líquido) se ha disparado en los últimos años, ya que los científicos ahora pueden observar procesos en tiempo real a nanoescala. Es extremadamente deseable combinar la información crio-EM de alta resolución con observaciones dinámicas, ya que muchos eventos ocurren en escalas de tiempo rápidas, en el rango de milisegundos o más rápido. Un mejor conocimiento de las estructuras flexibles también puede ayudar en el diseño de nuevos reactivos para combatir patógenos emergentes, como el SARS-CoV-2. Más importante aún, ver materiales biológicos en un ambiente fluido proporciona una visión única de su rendimiento en el cuerpo humano. Aquí se presentan métodos recientemente desarrollados para investigar las propiedades a nanoescala de los ensamblajes de virus en hielo líquido y vítreo. Para lograr este objetivo, se utilizaron muestras bien definidas como sistemas modelo. Se presentan comparaciones lado a lado de los métodos de preparación de muestras e información estructural representativa. Las características subnanométricas se muestran para estructuras resueltas en el rango de ~ 3.5-Å-10 Å. Otros resultados recientes que respaldan este marco complementario incluyen información dinámica de candidatos a vacunas y terapias basadas en anticuerpos fotografiadas en líquido. En general, estas aplicaciones correlativas mejoran nuestra capacidad de visualizar la dinámica molecular, proporcionando un contexto único para su uso en la salud y la enfermedad humanas.

Introducción

La investigación biomédica mejora nuestra comprensión de la salud humana y la enfermedad a través del desarrollo de nuevas tecnologías. Las imágenes de alta resolución están transformando nuestra visión del nanomundo, permitiéndonos estudiar células y moléculas con exquisito detalle 1,2,3,4,5. La información estática de componentes dinámicos como polímeros blandos, ensamblajes de proteínas o virus humanos revela solo una instantánea limitada de su compleja narrativa. Para comprender mejor cómo operan las entidades moleculares, su estructura y función deben investigarse conjuntamente.

Los avances recientes en la producción de materiales como el grafeno atómicamente delgado o los microchips basados en silicio brindan nuevas oportunidades para el análisis estructura-función en tiempo real utilizando microscopios electrónicos de transmisión (TEM). Estos materiales pueden crear cámaras herméticamente selladas para imágenes EM en vivo 6,7,8,9,10,11. El nuevo campo de EM líquido, la temperatura ambiente correlacionada con la crio-EM, proporciona vistas sin precedentes de materiales duros o blandos en solución, lo que permite a los científicos estudiar simultáneamente la estructura y la dinámica de su muestra. Las aplicaciones de EM líquida incluyen registros en tiempo real de nanopartículas terapéuticas que interactúan con células madre cancerosas, así como cambios en las complejidades moleculares de los patógenos virales12,13,14.

Así como los avances metodológicos estimularon la revolución de la resolución en el campo de la crioelectroEM, se necesitan nuevas técnicas y métodos para extender el uso de la electroEM líquida como una herramienta de alto rendimiento para la comunidad científica. El objetivo general de los métodos presentados aquí es simplificar los protocolos de preparación de muestras EM líquidas. La razón detrás de las técnicas desarrolladas es emplear nuevos diseños de microchips y dispositivos de carga automática, adecuados para la recolección de datos líquidos y crioelectromagnéticos (Figura 1)7,14,15,16,17. Los conjuntos se sellan mecánicamente utilizando clips de rejilla estándar para instrumentos automatizados, como el Krios, que puede acomodar múltiples muestras por sesión o un TEM F200C (Figura 2). Esta metodología amplía el uso de imágenes de alta resolución más allá de las aplicaciones crio-EM estándar, lo que demuestra propósitos más amplios para el análisis de materiales en tiempo real.

En el artículo de video actual, se presentan protocolos para preparar ensamblajes de virus en líquido con y sin portamuestras disponibles comercialmente. Utilizando el portamuestras especializado para EM líquido, las muestras líquidas delgadas pueden proporcionar información estructural comparable a las muestras crio-EM, así como información dinámica de las muestras. También se demuestran métodos para preparar muestras líquidas utilizando herramientas de carga automática para rutinas de alto rendimiento. La principal ventaja sobre otras técnicas es que la producción automatizada de muestras permite al usuario evaluar rápidamente sus muestras para el grosor óptimo y la dosificación de electrones antes de la recopilación de datos. Esta técnica de cribado identifica rápidamente las zonas ideales para grabaciones en tiempo real en líquido o hielo12,14,18,19. A efectos de la determinación de la estructura 3D, la EM líquida puede complementar los métodos crioelectromagnéticos establecidos desde hace mucho tiempo implementados en la crioelectroemia. Los lectores que emplean tecnologías TEM o crio-EM convencionales pueden considerar el uso de flujos de trabajo de EM líquida para proporcionar observaciones nuevas y dinámicas de sus muestras de una manera que complemente sus estrategias actuales.

Las muestras de virus utilizadas en este protocolo incluyen el virus adenoasociado purificado subtipo 3 (AAV) obtenido como regalo y cultivado en condiciones estándar12. También se utilizaron ensamblajes subvirales no infecciosos del SARS CoV-2 derivados del suero de pacientes con COVID-1912 y obtenidos de una fuente comercial. Finalmente, se obtuvieron partículas de doble capa (DLP) purificadas del rotavirus simio (cepa SA11) del laboratorio de la Dra. Sarah M. McDonald Esstman de la Universidad de Wake Forest y se cultivaron utilizando condiciones estándar 6,17. Los paquetes de software descritos aquí están disponibles gratuitamente y los enlaces se han proporcionado en la sección Tabla de materiales.

Protocolo

1. Carga del portamuestras para líquido-EM

  1. Limpie los microchips de nitruro de silicio (SiN) incubando cada chip en 150 ml de acetona durante 2 minutos, seguido de la incubación en 150 ml de metanol durante 2 minutos. Deje que las virutas se sequen en el flujo de aire laminar.
  2. Limpie con plasma las virutas secas utilizando un instrumento de descarga incandescente que funcione en condiciones estándar de 30 W, 15 mA durante 45 s utilizando gas argón.
  3. Cargue un microchip de base seca en la punta del portamuestras. Agregue ~0.2 μL de muestra (0.2-1 mg/mL de ensamblajes de virus en 50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) al chip base. Después de un paso de incubación de 1-2 minutos, coloque el chip superior en el chip base húmedo que contiene la muestra.
  4. Sujete el conjunto para formar un recinto herméticamente sellado, mantenido en su lugar mecánicamente por tres tornillos de latón. Al sellar el conjunto, bombee la punta a 10-6 Torr utilizando una estación de bombeo en seco turbobombeada. El soporte ahora está listo para ser insertado en el TEM.
    NOTA: El soporte de selección no tiene capacidades de refrigeración y no se utiliza para crio-EM.

2. Producción de conjuntos de sándwiches de microchip

NOTA: Se pueden usar diferentes microchips de SiN o dióxido de silicio (SiO) directamente desde los paquetes de gel enviados. Las rejillas de oro recubiertas de carbono también se pueden usar directamente como se suministran.

  1. El plasma limpia los microchips y las rejillas de carbono utilizando un instrumento de descarga incandescente que funciona en condiciones estándar de 30 W, 15 mA durante 45 s utilizando gas argón.
  2. Añadir ~2 μL de muestra contenida en 50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM de CaCl2 a un microchip descargado con brillo colocado en un paquete de gel. Retire el exceso de solución (~50%) con un papel de filtro o una pipeta. Después de un paso de incubación de 1-2 minutos, agregue la rejilla de carbono descargada de brillo al microchip húmedo que contiene la muestra.
  3. Sujete el conjunto con un portamuestras de inclinación simple o clips de rejilla de cargador automático a temperatura ambiente para formar una carcasa herméticamente sellada. Para las abrazaderas del cargador automático, coloque el conjunto sándwich en el clip C inferior, coloque el clip superior en la parte superior del conjunto y utilice la herramienta de sujeción estándar para sellar el conjunto.
    NOTA: El procedimiento de sujeción realizado aquí utiliza los mismos pasos que para la sujeción de rejilla crio-EM, pero a temperatura ambiente. Las muestras sujetas se pueden almacenar durante 2 meses o más antes de la obtención de imágenes mientras se mantiene el líquido en el recinto. No se utiliza ninguna comprobación de fugas con un portamuestras a temperatura ambiente o el cargador automático.
  4. La muestra ahora está lista para ser insertada en el TEM. Examine las muestras colocadas en cargadores automáticos en condiciones criogénicas o a temperatura ambiente.

3. Obtención de imágenes de muestras con un microscopio electrónico de transmisión

  1. Imágenes EM líquidas
    1. Cargue el portamuestras en el TEM equipado con una pistola de emisión de campo (FEG) y funcionando a 200 kV.
    2. Encienda la pistola y ajuste la altura eucéntrica de la platina del microscopio con respecto a la muestra utilizando la función wobbler, inclinando la muestra de -15° a +15° en la columna. Este procedimiento ajusta la etapa en la dirección Z para acomodar el grosor de la muestra. Y ayuda a garantizar un aumento preciso durante la grabación de imágenes.
    3. Grabe imágenes como vídeos de fotograma largo utilizando el paquete in situ integrado con un detector directo con un espaciado de píxeles de 6 μm (Video 1 y Video 2). Las imágenes individuales también se pueden grabar utilizando el paquete de software de recopilación de datos en serie20, implementando rutinas de imágenes automatizadas. Adquiera imágenes en condiciones de baja dosis con aumentos que van desde 28.000x-92.000x y 40 fotogramas por segundo.
    4. Ajuste los tiempos de exposición (0,25-1 s) para minimizar el daño del haz a la muestra. Utilice un rango de desenfoque de -1-4 μm con el aumento especificado. Si se encuentra una solución espesa, utilice valores de desenfoque más altos o seleccione una región de interés diferente.
    5. Asegúrese de que la solución esté presente en las muestras durante toda la sesión de imágenes enfocando el haz de electrones en un área de sacrificio que no se utiliza para la recopilación de datos, hasta que se formen burbujas (Figura complementaria 1).
  2. Imágenes crio-EM
    1. Cargue las rejillas EM recortadas o los sándwiches de microchip en el TEM equipado con un FEG y funcionando a 300 kV. Encienda la pistola y ajuste la altura eucéntrica de la platina del microscopio, utilizando un procedimiento similar descrito anteriormente para el TEM líquido (paso 3.1.2).
    2. Grabe imágenes individuales utilizando el sistema de análisis de partículas individuales integrado en el sistema de microscopio mientras implementa rutinas de imágenes automatizadas. Grabe imágenes en condiciones de baja dosis utilizando el detector de electrones directo de análisis de partículas individuales con un espaciado de píxeles de 14 μm con un aumento de 59,000x y 40 cuadros por segundo.
    3. Utilice un rango de desenfoque de 1-4 μm con el aumento especificado. Si se encuentran capas gruesas de hielo vítreo, use valores de desenfoque más altos o seleccione una región diferente para la recopilación de datos.

4. Análisis de datos y comparaciones de estructuras 3D

  1. Análisis de virus adenoasociados (AAV) en hielo líquido y vítreo
    1. Procese películas para partículas AAV en líquido y hielo utilizando el programa RELION-3.0821 u otro software de procesamiento de imágenes22. Realice la corrección de movimiento con MotionCor2 v1.2.3.
    2. Una vez corregido, extraiga las partículas utilizando la herramienta de selección automática en el paquete de software del programa. Los tamaños típicos de caja son 330 píxeles para muestras líquidas y 350 píxeles para muestras de hielo.
    3. Calcule las reconstrucciones iniciales utilizando la simetría C1 utilizando la rutina de modelo inicial 3D del programa y/o las opciones de modelo ab-initio en el paquete de software de procesamiento de datos. En el programa, utilice un parámetro de regularización de T = 4 y un tamaño de píxel de 1,01 Å para muestras líquidas y 1,13 Å para muestras de hielo.
    4. Utilice un valor de máscara de 300 Å durante los procedimientos de refinamiento. Realice protocolos de refinamiento en el software de procesamiento de datos utilizando la simetría I1 para obtener múltiples mapas EM. La resolución estructural esperada puede estar en el rango de 4 Å o mejor. Utilice la equivalencia de partículas implementando simetría icosaédrica a 16.800 para líquido y 15.240 para hielo12,14.
      NOTA: Las estimaciones de resolución se basan en los criterios de correlación de conchas de Fourier (FSC) estándar de oro.
    5. Enmascare mapas EM a ~250 Å y examine los resultados utilizando un paquete de software de análisis de estructura molecular23,24. En la Figura 3, los sectores se muestran en incrementos de ~5 nm.
    6. Extraiga las subunidades de proteína de la cápside (VP1) de los mapas EM para comparar. Cuantifique los cambios dinámicos entre las estructuras EM basándose en las mediciones del diámetro de partícula (Figura complementaria 2) y luego visualice utilizando la función de mapa de transformación en el software.
  2. Análisis de ensamblajes subvirales de SARS-CoV-2 en líquido
    1. Procese películas utilizando el programa RELION-3.08. Corrija la desviación de la imagen y el movimiento inducido por el haz con MotionCor2 v1.2.3. Corregir la función de transferencia de contraste (CTF) del microscopio.
    2. Utilice la herramienta de selección automática en el programa para seleccionar ensamblajes virales con un tamaño de caja de 800 píxeles. Para una eficiencia computacional, las partículas extraídas se pueden reescalar a 256 píxeles. Obtenga un modelo inicial utilizando simetría C1 en el programa con un parámetro de regularización de T = 2 y un tamaño de píxel de 1,66 Å.
    3. Realice el refinamiento 3D en el programa para obtener un mapa EM, un ejemplo se muestra en ~ 8.25 Å de acuerdo con los criterios estándar FSC (Figura 4). Visualice mapas EM utilizando el software de análisis de estructura molecular con cortes incrementados a 25 nm como se muestra en la Figura 4.
  3. Análisis de partículas de doble capa (DLP) de rotavirus en hielo vítreo
    1. Procese películas para DLP de rotavirus utilizando otro software de procesamiento de imágenes. Utilice MotionCor2 v1.2.3 para corregir la desviación en las imágenes. Utilice la estimación de parche CTF para corregir los efectos de la lente en las imágenes.
    2. Extraiga partículas utilizando la herramienta de selección automática en el software con un tamaño de caja de 950 píxeles. Reduzca el tamaño de la caja según sea necesario para fines informáticos.
    3. Calcule modelos iniciales utilizando opciones ab-initio y simetría C1. Utilice parámetros de refinamiento que incluyan un tamaño de píxel de 1,47 Å y un valor de máscara de 800 Å.
    4. Realice rutinas de refinamiento adicionales mientras impone la simetría I1. Los resultados de ejemplo incluyen un mapa EM de 10.15 Å, de acuerdo con los criterios FSC estándar de oro. Las partículas totales utilizadas fueron 2050, lo que equivale a 123.000 unidades de protómero debido al operador de simetría icosaédrica (Figura 5).
    5. Enmascare los mapas finales a ~750 Å y visualice los resultados en el paquete de software de análisis de estructura molecular. Los segmentos de ejemplo a través del mapa EM se muestran en la Figura 5 en incrementos de ~ 10 nm.

Resultados

Se utilizó un TEM líquido que operaba a 200 kV para todos los experimentos de imágenes de EM líquida y un TEM criogénico que funcionaba a 300 kV para toda la recopilación de datos de crioEM. Se presentan imágenes y estructuras representativas de múltiples virus para demostrar la utilidad de los métodos en varios sujetos de prueba. Estos incluyen el virus adenoasociado recombinante subtipo 3 (AAV), los conjuntos subvirales del SARS-CoV-2 derivados del suero del paciente y las partículas de doble capa (DLP) del r...

Discusión

Se presentan nuevas oportunidades para agilizar los flujos de trabajo actuales de EM líquida mediante el uso de nuevas herramientas automatizadas y tecnologías adaptadas del campo crioelectromagnético. Las aplicaciones que involucran la nueva técnica de sándwich de microchip son significativas con respecto a otros métodos porque permiten el análisis de imágenes de alta resolución en hielo líquido o vítreo. Uno de los pasos más críticos en el protocolo es producir especímenes con el espesor de líquido ideal...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos. La autora, Madeline J. Dressel-Dukes, es empleada de Protochips, Inc. y Michael Spilman es empleado de DirectElectron.

Agradecimientos

Los autores reconocen al Dr. Luk H. Vandenberghe (Escuela de Medicina de Harvard, Departamento de Oftalmología) por proporcionar AAV-3 purificado. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud y el Instituto Nacional del Cáncer (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 a D.F.K.).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneFisher Scientific A11-11 Liter
Autoloader clipping toolThermoFisher ScientificN/AAlso SubAngstrom supplier
Autoloader grid clipsThermoFisher ScientificN/Atop and bottom clips
Carbon-coated gold EM gridsElectron Microcopy SciencesCF400-AU-50400-mesh, 5-nm thickness
COVID-19 patient serumRayBiotechCoV-Pos-S-500500 microliters of PCR+ serum
MethanolFisher Scientific A412-11 Liter
Microwell-integrad microchipsProtochips, Inc.EPB-42A1-1010x10-mm window arrays
TEMWindows microchipsSimpore Inc.SN100-A10Q33B9 large windows, 10-nn thick
TEMWindows microchipsSimpore, Inc. SN100-A05Q33A9 small windows, 5-nm thick
Top microchipsProtochips, Inc.EPT-50W500 mm x 100 mm window
Whatman #1 filter paperWhatman1001 090100 pieces, 90 mm
Equipment 
DirectView direct electron detectorDirect Electron6-micron pixel spacing
Falcon 3 EC direct electron detectorThermoFisher Scientific14-micron pixel spacing
Gatan 655 Dry pump stationGatan, Inc. Pump holder tip to 10-6 range
Mark IV VitrobotThermoFisher Scientificstate-of-the-art specimen preparation unit 
PELCO easiGlow, glow discharge unitTed Pella, Inc. Negative polarity mode
Poseidon Select specimen holderProtochips, Inc. FEI compatible;specimen holder
Talos F200C TEMThermoFisher Scientific200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3ThermoFisher Scientific300 kV; Cryo-TEM
Freely available softwareWebsite linkComments (optional)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/other image processing software
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4CTF finding program
MotionCorr2https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/molecular structure analysis software package

Referencias

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