Weiterentwicklung der hochauflösenden Bildgebung von Virusanordnungen in Flüssigkeit und Eis

Zusammenfassung

Hier werden Protokolle beschrieben, um Virusanordnungen herzustellen, die für die Flüssig-EM- und Kryo-EM-Analyse auf der Nanoskala mittels Transmissionselektronenmikroskopie geeignet sind.

Zusammenfassung

Das Interesse an der Flüssigelektronenmikroskopie (Flüssig-EM) ist in den letzten Jahren sprunghaft angestiegen, da Wissenschaftler nun Echtzeitprozesse auf der Nanoskala beobachten können. Es ist äußerst wünschenswert, hochauflösende Kryo-EM-Informationen mit dynamischen Beobachtungen zu koppeln, da viele Ereignisse auf schnellen Zeitskalen auftreten - im Millisekundenbereich oder schneller. Verbesserte Kenntnisse über flexible Strukturen können auch bei der Entwicklung neuartiger Reagenzien zur Bekämpfung neu auftretender Krankheitserreger wie SARS-CoV-2 helfen. Noch wichtiger ist, dass die Betrachtung biologischer Materialien in einer flüssigen Umgebung einen einzigartigen Einblick in ihre Leistung im menschlichen Körper bietet. Hier werden neu entwickelte Methoden vorgestellt, um die nanoskaligen Eigenschaften von Virusanordnungen in flüssigem und glasigem Eis zu untersuchen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden gut definierte Stichproben als Modellsysteme verwendet. Direkte Vergleiche von Probenvorbereitungsmethoden und repräsentativen Strukturinformationen werden vorgestellt. Sub-Nanometer-Merkmale werden für Strukturen gezeigt, die im Bereich von ~3,5-Å-10 Å aufgelöst sind. Andere aktuelle Ergebnisse, die diesen komplementären Rahmen unterstützen, umfassen dynamische Einblicke in Impfstoffkandidaten und Antikörper-basierte Therapien, die in Flüssigkeit abgebildet sind. Insgesamt verbessern diese korrelativen Anwendungen unsere Fähigkeit, molekulare Dynamik zu visualisieren, und bieten einen einzigartigen Kontext für ihre Verwendung in der menschlichen Gesundheit und Krankheit.

Einleitung

Biomedizinische Forschung verbessert unser Verständnis von menschlicher Gesundheit und Krankheit durch die Entwicklung neuer Technologien. Hochauflösende Bildgebung verändert unseren Blick auf die Nanowelt - und ermöglicht es uns, Zellen und Moleküle in exquisiten Details zu untersuchen 1,2,3,4,5. Statische Informationen dynamischer Komponenten wie weicher Polymere, Proteinanordnungen oder menschlicher Viren zeigen nur eine begrenzte Momentaufnahme ihrer komplexen Erzählung. Um besser zu verstehen, wie mole....

Protokoll

1. Beladung des Probenhalters für Flüssig-EM

1. Reinigen Sie die Siliziumnitrid (SiN)-Mikrochips, indem Sie jeden Chip in 150 ml Aceton für 2 min inkubieren, gefolgt von einer Inkubation in 150 ml Methanol für 2 min. Lassen Sie die Späne im laminaren Luftstrom trocknen.
2. Plasmareinigung der getrockneten Späne mit einem Glimmentladungsinstrument, das unter Standardbedingungen von 30 W, 15 mA für 45 s mit Argongas betrieben wird.
3. Legen Sie einen Mikrochip mit trockener Basis in die Spitze des Probenhalters. Fügen Sie ~0,2 μL Probe (0,2-1 mg/ml Virusanordnungen in 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl₂; 10 mM C....

Ergebnisse

Ein Liquid-TEM mit 200 kV wurde für alle Liquid-EM-Bildgebungsexperimente und ein Kryo-TEM mit 300 kV für die gesamte Kryo-EM-Datenerfassung verwendet. Repräsentative Bilder und Strukturen mehrerer Viren werden präsentiert, um den Nutzen der Methoden bei verschiedenen Testpersonen zu demonstrieren. Dazu gehören rekombinante adeno-assoziierte Virus-Subtyp 3 (AAV), SARS-CoV-2-subvirale Anordnungen, die aus dem Patientenserum abgeleitet sind, und Affenrotavirus-Doppelschichtpartikel (DLPs), SA11-Stamm. Zunächst werden.......

Diskussion

Es werden neue Möglichkeiten zur Optimierung der aktuellen Liquid-EM-Arbeitsabläufe durch den Einsatz neuer automatisierter Tools und Technologien aus dem Kryo-EM-Bereich eröffnet. Anwendungen mit der neuen Mikrochip-Sandwichtechnik sind im Vergleich zu anderen Methoden von Bedeutung, da sie eine hochauflösende bildgebende Analyse in flüssigem oder glasigem Eis ermöglichen. Einer der kritischsten Schritte im Protokoll ist die Herstellung von Proben mit der idealen Flüssigkeitsdicke, um exquisite Details auf Nanoeb.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Scientific	A11-1	1 Liter
Autoloader clipping tool	ThermoFisher Scientific	N/A	Also SubAngstrom supplier
Autoloader grid clips	ThermoFisher Scientific	N/A	top and bottom clips
Carbon-coated gold EM grids	Electron Microcopy Sciences	CF400-AU-50	400-mesh, 5-nm thickness
COVID-19 patient serum	RayBiotech	CoV-Pos-S-500	500 microliters of PCR+ serum
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	1 Liter
Microwell-integrad microchips	Protochips, Inc.	EPB-42A1-10	10x10-mm window arrays
TEMWindows microchips	Simpore Inc.	SN100-A10Q33B	9 large windows, 10-nn thick
TEMWindows microchips	Simpore, Inc.	SN100-A05Q33A	9 small windows, 5-nm thick
Top microchips	Protochips, Inc.	EPT-50W	500 mm x 100 mm window
Whatman #1 filter paper	Whatman	1001 090	100 pieces, 90 mm
Equipment
DirectView direct electron detector	Direct Electron		6-micron pixel spacing
Falcon 3 EC direct electron detector	ThermoFisher Scientific		14-micron pixel spacing
Gatan 655 Dry pump station	Gatan, Inc.		Pump holder tip to 10-6 range
Mark IV Vitrobot	ThermoFisher Scientific		state-of-the-art specimen preparation unit
PELCO easiGlow, glow discharge unit	Ted Pella, Inc.		Negative polarity mode
Poseidon Select specimen holder	Protochips, Inc.		FEI compatible;specimen holder
Talos F200C TEM	ThermoFisher Scientific		200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3	ThermoFisher Scientific		300 kV; Cryo-TEM
Freely available software	Website link		Comments (optional)
cryoSPARC	https://cryosparc.com/		other image processing software
CTFFIND4	https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4		CTF finding program
MotionCorr2	https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELION	https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEM	https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimera	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/		molecular structure analysis software package