Weiterentwicklung der hochauflösenden Bildgebung von Virusanordnungen in Flüssigkeit und Eis

Zusammenfassung

Hier werden Protokolle beschrieben, um Virusanordnungen herzustellen, die für die Flüssig-EM- und Kryo-EM-Analyse auf der Nanoskala mittels Transmissionselektronenmikroskopie geeignet sind.

Zusammenfassung

Das Interesse an der Flüssigelektronenmikroskopie (Flüssig-EM) ist in den letzten Jahren sprunghaft angestiegen, da Wissenschaftler nun Echtzeitprozesse auf der Nanoskala beobachten können. Es ist äußerst wünschenswert, hochauflösende Kryo-EM-Informationen mit dynamischen Beobachtungen zu koppeln, da viele Ereignisse auf schnellen Zeitskalen auftreten - im Millisekundenbereich oder schneller. Verbesserte Kenntnisse über flexible Strukturen können auch bei der Entwicklung neuartiger Reagenzien zur Bekämpfung neu auftretender Krankheitserreger wie SARS-CoV-2 helfen. Noch wichtiger ist, dass die Betrachtung biologischer Materialien in einer flüssigen Umgebung einen einzigartigen Einblick in ihre Leistung im menschlichen Körper bietet. Hier werden neu entwickelte Methoden vorgestellt, um die nanoskaligen Eigenschaften von Virusanordnungen in flüssigem und glasigem Eis zu untersuchen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden gut definierte Stichproben als Modellsysteme verwendet. Direkte Vergleiche von Probenvorbereitungsmethoden und repräsentativen Strukturinformationen werden vorgestellt. Sub-Nanometer-Merkmale werden für Strukturen gezeigt, die im Bereich von ~3,5-Å-10 Å aufgelöst sind. Andere aktuelle Ergebnisse, die diesen komplementären Rahmen unterstützen, umfassen dynamische Einblicke in Impfstoffkandidaten und Antikörper-basierte Therapien, die in Flüssigkeit abgebildet sind. Insgesamt verbessern diese korrelativen Anwendungen unsere Fähigkeit, molekulare Dynamik zu visualisieren, und bieten einen einzigartigen Kontext für ihre Verwendung in der menschlichen Gesundheit und Krankheit.

Einleitung

Biomedizinische Forschung verbessert unser Verständnis von menschlicher Gesundheit und Krankheit durch die Entwicklung neuer Technologien. Hochauflösende Bildgebung verändert unseren Blick auf die Nanowelt - und ermöglicht es uns, Zellen und Moleküle in exquisiten Details zu untersuchen 1,2,3,4,5. Statische Informationen dynamischer Komponenten wie weicher Polymere, Proteinanordnungen oder menschlicher Viren zeigen nur eine begrenzte Momentaufnahme ihrer komplexen Erzählung. Um besser zu verstehen, wie molekulare Einheiten funktionieren, müssen ihre Struktur und Funktion gemeinsam untersucht werden.

Jüngste Fortschritte bei der Herstellung von Materialien wie atomar dünnem Graphen oder siliziumbasierten Mikrochips bieten neue Möglichkeiten für die Echtzeit-Strukturfunktionsanalyse mit Transmissionselektronenmikroskopen (TEMs). Diese Materialien können hermetisch abgeschlossene Kammern für die Live-EM-Bildgebung ^{6,7,8,9,10,11} erzeugen. Das neue Feld der Flüssig-EM, die Raumtemperatur korreliert mit Kryo-EM, bietet beispiellose Ansichten von harten oder weichen Materialien in Lösung, so dass Wissenschaftler gleichzeitig die Struktur und Dynamik ihrer Probe untersuchen können. Flüssig-EM-Anwendungen umfassen Echtzeitaufnahmen von therapeutischen Nanopartikeln, die mit Krebsstammzellen interagieren, sowie Veränderungen in den molekularen Feinheiten viraler Krankheitserreger^12,13,14.

So wie methodische Fortschritte die Auflösungsrevolution im Kryo-EM-Bereich vorangetrieben haben, sind neue Techniken und Methoden erforderlich, um den Einsatz von Flüssig-EM als Hochdurchsatzwerkzeug für die wissenschaftliche Gemeinschaft zu erweitern. Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methoden ist es, die Protokolle zur Vorbereitung von Flüssig-EM-Proben zu rationalisieren. Der Grund für die entwickelten Techniken ist der Einsatz neuer Mikrochip-Designs und Autoloader-Geräte, die sowohl für die Datenerfassung von Flüssigkeiten als auch für Kryo-EM geeignet sind (Abbildung 1)7,14,15,16,17). Die Baugruppen werden mechanisch mit Standard-Rasterclips für automatisierte Instrumente wie dem Krios versiegelt, der mehrere Proben pro Sitzung aufnehmen kann, oder einem F200C TEM (Abbildung 2). Diese Methodik erweitert den Einsatz hochauflösender Bildgebung über Standard-Kryo-EM-Anwendungen hinaus und demonstriert breitere Zwecke für die Echtzeit-Materialanalyse.

Im aktuellen Videoartikel werden Protokolle zur Herstellung von Virusbaugruppen in Flüssigkeit mit und ohne handelsübliche Probenhalter vorgestellt. Mit dem speziellen Probenhalter für Flüssig-EM können dünnflüssige Proben strukturelle Informationen liefern, die mit Kryo-EM-Proben vergleichbar sind, sowie dynamische Einblicke in die Proben. Demonstriert werden auch Methoden zur Vorbereitung flüssiger Proben mit Autoloader-Werkzeugen für Hochdurchsatzroutinen. Der große Vorteil gegenüber anderen Techniken besteht darin, dass die automatisierte Probenproduktion es dem Benutzer ermöglicht, seine Proben vor der Datenerfassung schnell auf optimale Dicke und Elektronendosierung zu beurteilen. Diese Screening-Technik identifiziert schnell ideale Bereiche für Echtzeitaufnahmen in Flüssigkeit oder Eis^12,14,18,19. Für die Zwecke der 3D-Strukturbestimmung kann Liquid-EM die seit langem etablierten Kryo-EM-Methoden ergänzen, die in Kryo-EM implementiert sind. Leser, die konventionelle TEM- oder Kryo-EM-Technologien einsetzen, können die Verwendung von Flüssig-EM-Workflows in Betracht ziehen, um neue, dynamische Beobachtungen ihrer Proben in einer Weise bereitzustellen, die ihre aktuellen Strategien ergänzt.

Zu den in diesem Protokoll verwendeten Virusproben gehören gereinigte adenoassoziierte Virussubtypen 3 (AAV), die als Geschenk gewonnen und unter Standardbedingungen kultiviert^{werden 12}. Ebenfalls verwendet wurden nicht-infektiöse subvirale SARS-CoV-2-Anordnungen, die aus dem Serum von COVID-19-Patienten¹² gewonnen und aus einer kommerziellen Quelle gewonnen wurden. Schließlich wurden gereinigte Affenrotavirus (SA11-Stamm) Doppelschichtpartikel (DLPs) aus dem Labor von Dr. Sarah M. McDonald Esstman an der Wake Forest University gewonnen und unter Standardbedingungen ^6,17 kultiviert. Die hier beschriebenen Softwarepakete sind frei verfügbar und die Links wurden im Abschnitt Materialverzeichnis bereitgestellt.

Protokoll

1. Beladung des Probenhalters für Flüssig-EM

1. Reinigen Sie die Siliziumnitrid (SiN)-Mikrochips, indem Sie jeden Chip in 150 ml Aceton für 2 min inkubieren, gefolgt von einer Inkubation in 150 ml Methanol für 2 min. Lassen Sie die Späne im laminaren Luftstrom trocknen.
2. Plasmareinigung der getrockneten Späne mit einem Glimmentladungsinstrument, das unter Standardbedingungen von 30 W, 15 mA für 45 s mit Argongas betrieben wird.
3. Legen Sie einen Mikrochip mit trockener Basis in die Spitze des Probenhalters. Fügen Sie ~0,2 μL Probe (0,2-1 mg/ml Virusanordnungen in 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl₂; 10 mM CaCl₂) zum Basischip hinzu. Nach einem 1-2-minütigen Inkubationsschritt legen Sie den oberen Chip auf den nassen Basischip, der die Probe enthält.
4. Klemmen Sie die Baugruppe zusammen, um ein hermetisch abgeschlossenes Gehäuse zu bilden, das mechanisch von drei Messingschrauben gehalten wird. Nach dem Versiegeln der Baugruppe pumpen Sie die Spitze mit einer turbogepumpten Trockenpumpstation auf ^10-6 Torr. Die Halterung ist nun bereit, in das TEM eingesetzt zu werden.
   HINWEIS: Der ausgewählte Halter hat keine Kühlfunktionen und wird nicht für Kryo-EM verwendet.

2. Herstellung von Mikrochip-Sandwichbaugruppen

HINWEIS: Verschiedene SiN- oder Siliziumdioxid (SiO)-Mikrochips können direkt aus den mitgelieferten Gelpacks verwendet werden. Kohlenstoffbeschichtete Goldgitter können auch direkt im Lieferumfang verwendet werden.

1. Plasma reinigt die Mikrochips und Kohlenstoffgitter mit einem Glimmentladungsinstrument, das unter Standardbedingungen von 30 W, 15 mA für 45 s mit Argongas arbeitet.
2. Fügen Sie ~ 2 μL der Probe hinzu, die in 50 mM HEPES enthalten ist, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl₂; 10 mM CaCl₂ zu einem Glim-entladenen Mikrochip auf einer Gelpackung. Entfernen Sie überschüssige Lösung (~ 50%) mit einem Filterpapier oder einer Pipette. Nach einem 1-2-minütigen Inkubationsschritt fügen Sie das Glimment-entladene Kohlenstoffgitter zu dem nassen Mikrochip hinzu, der die Probe enthält.
3. Klemmen Sie die Baugruppe mit einem Einzelneigeprobenhalter oder Autoloader-Gitterclips bei Raumtemperatur zusammen, um ein hermetisch dichtes Gehäuse zu bilden. Legen Sie bei den automatischen Ladeklemmen die Sandwichbaugruppe auf den unteren C-Clip, legen Sie den oberen Clip auf die Baugruppe und verwenden Sie das Standardspannwerkzeug, um die Baugruppe zusammen zu versiegeln.
   HINWEIS: Der hier durchgeführte Klemmvorgang verwendet die gleichen Schritte wie beim Kryo-EM-Gitterspannen, jedoch bei Raumtemperatur. Geklemmte Proben können vor der Bildgebung 2 Monate oder länger gelagert werden, während Flüssigkeit im Gehäuse gehalten wird. Mit einem Probenhalter bei Raumtemperatur oder dem Autoloader wird keine Dichtheitsprüfung durchgeführt.
4. Die Probe ist nun bereit, in das TEM eingesetzt zu werden. Untersuchen Sie Proben, die in Autoloadern unter Kryobedingungen oder bei Raumtemperatur platziert werden.

3. Bildgebende Proben mit einem Transmissionselektronenmikroskop

1. Flüssig-EM-Bildgebung
   1. Legen Sie den Probenhalter in das TEM, das mit einer Feldemissionspistole (FEG) ausgestattet ist und mit 200 kV arbeitet.
   2. Schalten Sie die Pistole ein und stellen Sie die euzentrische Höhe des Mikroskoptisches in Bezug auf die Probe ein, indem Sie die Wobbler-Funktion verwenden, wobei die Probe in der Säule von -15° auf +15° geneigt wird. Bei diesem Verfahren wird der Tisch in Z-Richtung angepasst, um die Probendicke aufzunehmen. Und sorgt für eine genaue Vergrößerung während der Bildaufnahme.
   3. Nehmen Sie Bilder als Langfilme auf, indem Sie das In-situ-Paket verwenden, das mit einem direkten Detektor mit einem Pixelabstand von 6 μm (Video 1 und Video 2) integriert ist. Einzelne Bilder können auch unter Verwendung des seriellen Datenerfassungssoftwarepakets²⁰ aufgezeichnet werden, wobei automatisierte Bildgebungsroutinen implementiert werden. Nehmen Sie Bilder unter niedrig dosierten Bedingungen mit Vergrößerungen von 28.000x bis 92.000x und 40 Bildern pro Sekunde auf.
   4. Stellen Sie die Belichtungszeiten (0,25-1 s) ein, um Strahlschäden an der Probe zu minimieren. Verwenden Sie einen Defokussierungsbereich von -1-4 μm bei der angegebenen Vergrößerung. Wenn eine dicke Lösung gefunden wird, verwenden Sie höhere Defokussierungswerte oder wählen Sie einen anderen Bereich von Interesse aus.
   5. Stellen Sie sicher, dass die Lösung während der gesamten Bildgebungssitzung in den Proben vorhanden ist, indem Sie den Elektronenstrahl auf einen Opferbereich fokussieren, der nicht für die Datenerfassung verwendet wird, bis Blasen gebildet werden (ergänzende Abbildung 1).
2. Kryo-EM-Bildgebung
   1. Laden Sie die abgeschnittenen EM-Gitter oder Mikrochip-Sandwiches in das TEM, das mit einem FEG ausgestattet ist und mit 300 kV arbeitet. Schalten Sie die Pistole ein und stellen Sie die euzentrische Höhe des Mikroskoptisches mit einem ähnlichen Verfahren ein, das oben für das Flüssigkeits-TEM beschrieben wurde (Schritt 3.1.2).
   2. Zeichnen Sie einzelne Bilder mit dem im Mikroskopsystem integrierten Einzelpartikelanalysesystem auf und implementieren Sie automatisierte Bildgebungsroutinen. Nehmen Sie Bilder unter niedrig dosierten Bedingungen mit dem Einzelpartikelanalyse-Direktelektronendetektor mit einem Pixelabstand von 14 μm bei einer Vergrößerung von 59.000x und 40 Bildern pro Sekunde auf.
   3. Verwenden Sie einen Defokussierungsbereich von 1-4 μm bei der angegebenen Vergrößerung. Wenn dicke Schichten von Glaseis gefunden werden, verwenden Sie höhere Unschärfewerte, oder wählen Sie eine andere Region für die Datenerfassung aus.

4. Datenanalyse und 3D-Strukturvergleiche

1. Analyse von Adeno-assoziierten Viren (AAV) in flüssigem und glasigem Eis
   1. Verarbeiten von Filmen für AAV-Partikel in Flüssigkeit und Eis mit dem Programm RELION-3.08²¹ oder einer anderen Bildverarbeitungssoftware²². Führen Sie eine Bewegungskorrektur mit MotionCor2 v1.2.3 durch.
   2. Nach der Korrektur extrahieren Sie Partikel mit dem Auto-Picking-Tool im Programmsoftwarepaket. Typische Kartongrößen sind 330 Pixel für flüssige Proben und 350 Pixel für Eisproben.
   3. Berechnen Sie anfängliche Rekonstruktionen unter Verwendung der C1-Symmetrie unter Verwendung der 3D-Anfangsmodellroutine des Programms und/oder der ab-initio-Modelloptionen im Datenverarbeitungssoftwarepaket. Verwenden Sie im Programm einen Regularisierungsparameter von T = 4 und eine Pixelgröße von 1,01 Å für flüssige Proben und 1,13 Å für Eisproben.
   4. Verwenden Sie während der gesamten Verfeinerungsprozedur einen Maskenwert von 300 Å. Führen Sie Verfeinerungsprotokolle in der Datenverarbeitungssoftware unter Verwendung der I1-Symmetrie durch, um mehrere EM-Karten zu erhalten. Die erwartete strukturelle Auflösung kann im Bereich von 4 Å oder besser liegen. Verwenden Sie die Partikeläquivalenz, die die ikosaedrische Symmetrie bei 16.800 für Flüssigkeit und 15.240 für Eis^12,14 implementiert.
      HINWEIS: Auflösungsschätzungen basieren auf den Goldstandard-FSC-Kriterien (Fourier Shell Correlations).
   5. Maskieren Sie EM-Karten bei ~250 Å und untersuchen Sie die Ergebnisse mit einem Molekularstrukturanalyse-Softwarepaket^23,24. In Abbildung 3 sind die Slices in Schritten von ~5 nm dargestellt.
   6. Extrahieren Sie Kapsidprotein (VP1) Untereinheiten aus den EM-Karten zum Vergleich. Quantifizieren Sie dynamische Änderungen zwischen EM-Strukturen basierend auf den Partikeldurchmessermessungen (ergänzende Abbildung 2) und visualisieren Sie sie dann mit der Morph-Map-Funktion in der Software.
2. Analyse subviraler SARS-CoV-2-Anordnungen in flüssigen Flüssigkeiten
   1. Verarbeiten Sie Filme mit dem Programm RELION-3.08. Korrigiert für Bilddrift und strahlinduzierte Bewegung mit MotionCor2 v1.2.3. Korrekt für die Kontrastübertragungsfunktion (CTF) des Mikroskops.
   2. Verwenden Sie das Auto-Picking-Tool im Programm, um virale Assemblies mit einer Boxgröße von 800 Pixeln auszuwählen. Für die Recheneffizienz können extrahierte Partikel auf 256 Pixel skaliert werden. Erhalten Sie ein erstes Modell unter Verwendung der C1-Symmetrie im Programm mit einem Regularisierungsparameter von T = 2 und 1,66 Å Pixelgröße.
   3. Führen Sie eine 3D-Verfeinerung im Programm durch, um eine EM-Karte zu erhalten, ein Beispiel wird bei ~ 8,25 Å nach Standard-FSC-Kriterien gezeigt (Abbildung 4). Visualisieren Sie EM-Karten mit der Molekularstrukturanalysesoftware mit Scheiben, die bei 25 nm inkrementiert sind, wie in Abbildung 4 gezeigt.
3. Analyse von Rotavirus-Doppelschichtpartikeln (DLPs) im Glaseis
   1. Verarbeiten Sie Filme für Rotavirus-DLPs mit anderer Bildverarbeitungssoftware. Verwenden Sie MotionCor2 v1.2.3, um Abweichungen in den Bildern zu korrigieren. Verwenden Sie die Patch-CTF-Schätzung, um Linseneffekte auf den Bildern zu korrigieren.
   2. Extrahieren Sie Partikel mit dem Auto-Picking-Tool in der Software mit einer Boxgröße von 950 Pixeln. Berechnen Sie die Boxgröße nach Bedarf für Computerzwecke.
   3. Berechnen Sie erste Modelle mit ab-initio-Optionen und C1-Symmetrie . Verwenden Sie Verfeinerungsparameter wie eine Pixelgröße von 1,47 Å und einen Maskenwert von 800 Å.
   4. Führen Sie zusätzliche Verfeinerungsroutinen durch, während Sie die I1-Symmetrie auferlegen. Zu den Beispielergebnissen gehört eine 10,15 Å EM-Karte gemäß den Goldstandard-FSC-Kriterien. Die Gesamtzahl der verwendeten Partikel betrug 2050, was aufgrund des ikosaedrischen Symmetrieoperators 123.000 Protomereinheiten entspricht (Abbildung 5).
   5. Maskieren Sie endgültige Karten bei ~750 Å und visualisieren Sie die Ergebnisse im Softwarepaket für die Molekularstrukturanalyse. Beispielschnitte durch die EM-Karte sind in Abbildung 5 in Schritten von ~10 nm dargestellt.

Ergebnisse

Ein Liquid-TEM mit 200 kV wurde für alle Liquid-EM-Bildgebungsexperimente und ein Kryo-TEM mit 300 kV für die gesamte Kryo-EM-Datenerfassung verwendet. Repräsentative Bilder und Strukturen mehrerer Viren werden präsentiert, um den Nutzen der Methoden bei verschiedenen Testpersonen zu demonstrieren. Dazu gehören rekombinante adeno-assoziierte Virus-Subtyp 3 (AAV), SARS-CoV-2-subvirale Anordnungen, die aus dem Patientenserum abgeleitet sind, und Affenrotavirus-Doppelschichtpartikel (DLPs), SA11-Stamm. Zunächst werden...

Diskussion

Es werden neue Möglichkeiten zur Optimierung der aktuellen Liquid-EM-Arbeitsabläufe durch den Einsatz neuer automatisierter Tools und Technologien aus dem Kryo-EM-Bereich eröffnet. Anwendungen mit der neuen Mikrochip-Sandwichtechnik sind im Vergleich zu anderen Methoden von Bedeutung, da sie eine hochauflösende bildgebende Analyse in flüssigem oder glasigem Eis ermöglichen. Einer der kritischsten Schritte im Protokoll ist die Herstellung von Proben mit der idealen Flüssigkeitsdicke, um exquisite Details auf Nanoeb...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Scientific	A11-1	1 Liter
Autoloader clipping tool	ThermoFisher Scientific	N/A	Also SubAngstrom supplier
Autoloader grid clips	ThermoFisher Scientific	N/A	top and bottom clips
Carbon-coated gold EM grids	Electron Microcopy Sciences	CF400-AU-50	400-mesh, 5-nm thickness
COVID-19 patient serum	RayBiotech	CoV-Pos-S-500	500 microliters of PCR+ serum
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	1 Liter
Microwell-integrad microchips	Protochips, Inc.	EPB-42A1-10	10x10-mm window arrays
TEMWindows microchips	Simpore Inc.	SN100-A10Q33B	9 large windows, 10-nn thick
TEMWindows microchips	Simpore, Inc.	SN100-A05Q33A	9 small windows, 5-nm thick
Top microchips	Protochips, Inc.	EPT-50W	500 mm x 100 mm window
Whatman #1 filter paper	Whatman	1001 090	100 pieces, 90 mm
Equipment
DirectView direct electron detector	Direct Electron		6-micron pixel spacing
Falcon 3 EC direct electron detector	ThermoFisher Scientific		14-micron pixel spacing
Gatan 655 Dry pump station	Gatan, Inc.		Pump holder tip to 10-6 range
Mark IV Vitrobot	ThermoFisher Scientific		state-of-the-art specimen preparation unit
PELCO easiGlow, glow discharge unit	Ted Pella, Inc.		Negative polarity mode
Poseidon Select specimen holder	Protochips, Inc.		FEI compatible;specimen holder
Talos F200C TEM	ThermoFisher Scientific		200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3	ThermoFisher Scientific		300 kV; Cryo-TEM
Freely available software	Website link		Comments (optional)
cryoSPARC	https://cryosparc.com/		other image processing software
CTFFIND4	https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4		CTF finding program
MotionCorr2	https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELION	https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEM	https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimera	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/		molecular structure analysis software package