액체와 얼음에서 바이러스 어셈블리의 고해상도 이미징 향상

요약

여기에서는 투과 전자 현미경을 사용하여 나노 스케일에서 액체-EM 및 Cryo-EM 분석에 적합한 바이러스 어셈블리를 준비하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

과학자들이 이제 나노 스케일에서 실시간 프로세스를 관찰할 수 있게 되면서 액체 전자 현미경(액체-EM)에 대한 관심이 최근 몇 년 동안 급증했습니다. 많은 이벤트가 밀리초 범위 또는 더 빠른 시간 척도에서 발생하므로 고분해능 Cryo-EM 정보를 동적 관찰과 페어링하는 것이 매우 바람직합니다. 유연한 구조에 대한 향상된 지식은 SARS-CoV-2와 같은 신종 병원체와 싸우기 위한 새로운 시약의 설계에도 도움이 될 수 있습니다. 더 중요한 것은 유체 환경에서 생물학적 물질을 보는 것이 인체에서의 성능을 독특하게 엿볼 수 있다는 것입니다. 여기에 액체 및 유리질 얼음에서 바이러스 어셈블리의 나노 스케일 특성을 조사하기 위해 새로 개발 된 방법이 제시됩니다. 이 목표를 달성하기 위해 잘 정의된 샘플이 모델 시스템으로 사용되었습니다. 샘플 준비 방법과 대표적인 구조 정보의 나란히 비교가 제시됩니다. 서브 나노 미터 특징은 ~ 3.5-Å-10 Å 범위에서 분해 된 구조에 대해 표시됩니다. 이 보완적인 프레임워크를 뒷받침하는 다른 최근 결과에는 백신 후보에 대한 동적 통찰력과 액체로 이미지화된 항체 기반 치료법이 포함됩니다. 전반적으로 이러한 상관 응용 프로그램은 분자 역학을 시각화하는 능력을 향상시켜 인간의 건강과 질병에서 사용할 수 있는 고유한 컨텍스트를 제공합니다.

서문

생물 의학 연구는 새로운 기술 개발을 통해 인간의 건강과 질병에 대한 이해를 향상시킵니다. 고해상도 이미징은 나노 세계에 대한 우리의 관점을 변화시키고 있으며, 세포와 분자를^{정교하게 1,2,3,4,5} 연구할 수 있게 해줍니다. 연질 폴리머, 단백질 어셈블리 또는 인간 바이러스와 같은 동적 구성 요소의 정적 정보는 복잡한 내러티브의 제한된 스냅 샷 만 보여줍니다. 분자 개체가 어떻게 작동하는지 더 잘 이해하려면 구조와 기능을 공동으로 조사해야 합니다.

원자적으로 얇은 그래핀 또는 실리콘 기반 마이크로칩과 같은 재료 생산의 최근 발전은 투과 전자 현미경(TEM)을 사용한 실시간 구조 기능 분석을 위한 새로운 기회를 제공합니다. 이러한 재료는 라이브 EM 이미징 6,7,8,9,10,11을 위해 밀폐된 챔버를 생성할 수 있습니다. Cryo-EM과 상관 관계가 있는 실온인 액체-EM의 새로운 분야는 용액의 단단하거나 부드러운 물질에 대한 전례 없는 보기를 제공하여 과학자들이 시편의 구조와 역학을 동시에 연구할 수 있도록 합니다. Liquid-EM 애플리케이션에는 암 줄기 세포와 상호 작용하는 치료용 나노입자의 실시간 기록과 바이러스 병원체^12,13,14의 분자 복잡성 변화가 포함됩니다.

방법론적 발전이 Cryo-EM 분야의 분해능 혁명에 박차를 가한 것처럼, 과학계를 위한 고처리량 도구로서 액체-EM의 사용을 확장하기 위해서는 새로운 기술과 방법이 필요합니다. 여기에 제시된 방법의 전반적인 목표는 액체-EM 시편 준비 프로토콜을 간소화하는 것입니다. 개발된 기술의 이면에 있는 이론적 근거는 액체 및 극저온 EM 데이터 수집 모두에 적합한 새로운 마이크로칩 설계 및 오토로더 장치를 사용하는 것입니다(그림 1)7,14,15,16,17. 어셈블리는 세션당 여러 샘플을 수용할 수 있는 Krios 또는 F200C TEM과 같은 자동화 기기용 표준 그리드 클립을 사용하여 기계적으로 밀봉됩니다(그림 2). 이 방법론은 표준 Cryo-EM 애플리케이션을 넘어 고해상도 이미징의 사용을 확장하여 실시간 재료 분석의 더 넓은 목적을 보여줍니다.

현재 비디오 기사에서는 상업적으로 이용 가능한 표본 홀더가 있거나없는 액체로 바이러스 어셈블리를 준비하기위한 프로토콜이 제시됩니다. 액체-EM용 특수 시편 홀더를 사용하면 얇은 액체 시편은 Cryo-EM 샘플에 필적하는 구조 정보와 시편의 동적 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 고처리량 루틴을 위해 자동 로더 도구를 사용하여 액체 표본을 준비하는 방법도 시연됩니다. 다른 기술에 비해 가장 큰 장점은 자동화된 시편 생산을 통해 사용자가 데이터 수집 전에 최적의 두께와 전자 선량에 대해 샘플을 신속하게 평가할 수 있다는 것입니다. 이 스크리닝 기술은 액체 또는 얼음^12,14,18,19에서 실시간 기록에 이상적인 영역을 신속하게 식별합니다. 3D 구조 측정을 위해 액체-EM은 Cryo-EM에 구현된 오랫동안 확립된 Cryo-EM 분석법을 보완할 수 있습니다. 기존 TEM 또는 Cryo-EM 기술을 사용하는 독자는 현재 전략을 보완하는 방식으로 샘플에 대한 새롭고 역동적인 관찰을 제공하기 위해 액체-EM 워크플로우를 사용하는 것을 고려할 수 있습니다.

이 프로토콜에 사용되는 바이러스 샘플은 기증으로 수득되고 표준 조건¹² 하에서 배양된 정제된 아데노-관련 바이러스 서브타입 3 (AAV)을 포함한다. 또한 COVID-19 환자¹²의 혈청에서 파생되고 상업적 출처에서 얻은 비감염성 SARS CoV-2 하위 바이러스 어셈블리도 사용되었습니다. 마지막으로, 정제된 유인원 로타바이러스(SA11 균주) 이중층 입자(DLP)를 웨이크 포레스트 대학의 Sarah M. McDonald Esstman 박사의 실험실에서 얻고 표준 조건 ^6,17을 사용하여 배양했습니다. 여기에 설명된 소프트웨어 패키지는 무료로 사용할 수 있으며 링크는 재료 표 섹션에 제공되었습니다.

프로토콜

1. 액체-EM용 시편 홀더 적재

1. 각 칩을 150mL의 아세톤에서 2분 동안 인큐베이션한 후 150mL의 메탄올에서 2분 동안 인큐베이션하여 질화규소(SiN) 마이크로칩을 세척합니다. 층류 기류에서 칩을 건조시킵니다.
2. 아르곤 가스를 사용하여 30W, 15mA의 표준 조건에서 45초 동안 작동하는 글로우 방전 기기를 사용하여 건조된 칩을 플라즈마 청소합니다.
3. 건조베이스 마이크로 칩을 시편 홀더의 팁에 넣습니다. ~0.2μL의 샘플(50mM hepes, pH 7.5, 150mM NaCl, 10mM MgCl2_, 10mM CaCl2에서 0.2-1mg/mL의 바이러스 어셈블리)을 기본 칩에 추가합니다. 1-2분 인큐베이션 단계 후에, 샘플을 함유하는 습식 베이스 칩 상에 탑 칩을 놓는다.
4. 어셈블리를 함께 고정하여 3개의 황동 나사로 기계적으로 제자리에 고정되는 밀폐된 인클로저를 형성합니다. 어셈블리를 밀봉하면 터보 펌핑 건식 펌핑 스테이션을 사용하여 팁을 ^10-6Torr 로 펌핑합니다. 이제 홀더를 TEM에 삽입할 준비가 되었습니다.
   알림: 셀렉트 홀더에는 냉각 기능이 없으며 Cryo-EM에는 사용되지 않습니다.

2. 마이크로칩 샌드위치 어셈블리 생산

알림: 다른 SiN 또는 이산화규소(SiO) 마이크로칩은 배송된 젤 팩에서 직접 사용할 수 있습니다. 탄소 코팅 금 그리드는 제공된 대로 직접 사용할 수도 있습니다.

1. 플라즈마는 아르곤 가스를 사용하여 30W, 15mA의 표준 조건에서 45초 동안 작동하는 글로우 방전 기기를 사용하여 마이크로칩과 탄소 그리드를 청소합니다.
2. 50 mM hepes, pH 7.5에 포함 된 ~ 2 μL의 샘플을 추가하십시오. 150 mM NaCl; 10 mM_MgCl2; 10 mM_CaCl2 내지 글로우 방전된 마이크로칩을 겔 팩 위에 놓았다. 여과지 또는 피펫을 사용하여 과도한 용액(~50%)을 제거합니다. 1-2분 인큐베이션 단계 후에, 글로우 방전된 탄소 그리드를 샘플을 함유하는 습윤 마이크로칩에 첨가한다.
3. 실온에서 단일 틸트 시편 홀더 또는 자동 장전 장치 그리드 클립을 사용하여 어셈블리를 함께 고정하여 밀폐된 인클로저를 형성합니다. 자동 로더 클램프의 경우 샌드위치 어셈블리를 하단 C-클립에 놓고 상단 클립을 어셈블리 상단에 놓고 표준 클램핑 도구를 사용하여 어셈블리를 함께 밀봉합니다.
   알림: 여기에서 수행되는 클램핑 절차는 Cryo-EM 그리드 클램핑과 동일한 단계를 사용하지만 실온에서 사용됩니다. 클램핑된 샘플은 인클로저에 액체를 유지하면서 이미징 전에 2개월 이상 보관할 수 있습니다. 누출 검사는 실온 시편 홀더 또는 자동 로더와 함께 사용되지 않습니다.
4. 이제 시편을 TEM에 삽입할 준비가 되었습니다. 극저온 조건 또는 실온에서 오토로더에 배치된 샘플을 검사합니다.

3. 투과전자현미경을 이용한 표본 이미징

1. 액체-EM 이미징
   1. 시편 홀더를 전계 방출 건(FEG)이 장착되고 200kV에서 작동하는 TEM에 로드합니다.
   2. 건을 켜고 워블러 기능을 사용하여 표본에 대한 현미경 스테이지의 유센트릭 높이를 조정하고 컬럼에서 샘플을 -15°에서 +15°로 기울입니다. 이 절차는 샘플 두께를 수용하기 위해 Z 방향으로 스테이지를 조정합니다. 또한 이미지 녹화 중에 정확한 배율을 보장합니다.
   3. 픽셀 간격이 6μm인 직접 검출기와 통합된 in situ 패키지를 사용하여 이미지를 긴 프레임 동영상으로 녹화합니다(비디오 1 및 비디오 2). 개별 이미지는 또한 자동 이미징 루틴을 구현하는 직렬 데이터 수집 소프트웨어 패키지⁽²⁰)를 사용하여 기록될 수 있다. 저선량 조건에서 초당 28,000x-92,000x 및 40프레임 범위의 배율로 이미지를 획득합니다.
   4. 노출 시간(0.25-1초)을 조정하여 시편에 대한 빔 손상을 최소화합니다. 지정된 배율에서 -1-4 μm의 디포커스 범위를 사용합니다. 두꺼운 솔루션이 발견되면 더 높은 디포커스 값을 사용하거나 다른 관심 영역을 선택합니다.
   5. 기포가 형성될 때까지 데이터 수집에 사용되지 않는 희생 영역에 전자빔을 집중시켜 이미징 세션 전반에 걸쳐 용액이 샘플에 존재하는지 확인합니다(보충 그림 1).
2. 초저온 EM 이미징
   1. 잘린 EM 그리드 또는 마이크로칩 샌드위치를 FEG가 장착되고 300kV에서 작동하는 TEM에 로드합니다. 건을 켜고 위의 liquid-TEM에 대해 설명한 것과 유사한 절차를 사용하여 현미경 스테이지의 유센트릭 높이를 조정합니다(3.1.2단계).
   2. 현미경 시스템에 통합된 단일 입자 분석 시스템을 사용하여 개별 이미지를 기록하는 동시에 자동화된 이미징 루틴을 구현합니다. 59,000x 배율 및 초당 40프레임에서 14μm의 픽셀 간격을 갖는 단일 입자 분석 직접 전자 검출기를 사용하여 저선량 조건에서 이미지를 기록합니다.
   3. 지정된 배율에서 1-4μm의 디포커스 범위를 사용합니다. 두꺼운 유리질 얼음 층이 발견되면 더 높은 디포커스 값을 사용하거나 데이터 수집을 위해 다른 영역을 선택합니다.

4. 데이터 분석 및 3D 구조 비교

1. 액체 및 유리체 얼음에서 아데노 관련 바이러스(AAV) 분석
   1. RELION-3.08 프로그램⁽²¹ ) 또는 다른 화상 처리 소프트웨어⁽²²)를 사용하여 액체 및 얼음 내의 AAV 입자에 대한 무비 처리. MotionCor2 v1.2.3을 사용하여 모션 보정을 수행합니다.
   2. 수정되면 프로그램 소프트웨어 패키지의 자동 선택 도구를 사용하여 입자를 추출합니다. 일반적인 상자 크기는 액체 표본의 경우 330픽셀이고 얼음 표본의 경우 350픽셀입니다.
   3. 프로그램의 3D 초기 모델 루틴 및/또는 데이터 처리 소프트웨어 패키지의 ab-initio 모델 옵션을 사용하여 C1 대칭을 사용하여 초기 재구성을 계산합니다. 프로그램에서 정규화 파라미터 T = 4를 사용하고 픽셀 크기를 액체 표본의 경우 1.01Å, 얼음 표본의 경우 1.13Å로 사용합니다.
   4. 미세 조정 절차 전체에서 마스크 값 300 Å를 사용합니다. I1 대칭을 사용하여 데이터 처리 소프트웨어에서 구체화 프로토콜을 수행하여 여러 EM 맵을 얻습니다. 예상되는 구조적 분해능은 4 Å 이상의 범위 일 수 있습니다. 액체의 경우 16,800, 얼음의 경우 15,240에서 정사면체 대칭을 구현하는 입자 동등성을 사용합니다^12,14.
      참고: 예상 해상도는 금 표준 푸리에 쉘 상관 관계(FSC) 기준을 기반으로 합니다.
   5. ~250 Å에서 마스크 EM 맵핑하고 분자 구조 분석 소프트웨어 패키지^23,24를 사용하여 결과를 검사합니다. 그림 3에서 슬라이스는 ~5nm 단위로 표시됩니다.
   6. 비교를 위해 EM 맵에서 캡시드 단백질(VP1) 서브유닛을 추출합니다. 입경 측정을 기반으로 EM 구조 간의 동적 변화를 정량화한 다음(보충 그림 2) 소프트웨어에서 Morph map 함수를 사용하여 시각화합니다.
2. 액체의 SARS-CoV-2 하위 바이러스 어셈블리 분석
   1. RELION-3.08 프로그램을 사용하여 동영상을 처리합니다. MotionCor2 v1.2.3을 사용하여 이미지 드리프트 및 빔 유도 모션을 수정합니다. 현미경의 대비 전달 함수(CTF)에 대해 수정합니다.
   2. 프로그램의 자동 선택 도구를 사용하여 상자 크기가 800픽셀인 바이러스 어셈블리를 선택합니다. 계산 효율성을 위해 추출된 파티클을 256픽셀로 다시 스케일링할 수 있습니다. 프로그램에서 정규화 파라미터가 T = 2이고 픽셀 크기가 1.66Å인 C1 대칭을 사용하여 초기 모델을 얻습니다.
   3. EM 맵을 얻기 위해 프로그램에서 3D 미세 조정을 수행하면 표준 FSC 기준에 따라 ~ 8.25 Å에 예가 나와 있습니다 (그림 4). 그림 4와 같이 25nm에서 슬라이스가 증가한 분자 구조 분석 소프트웨어를 사용하여 EM 맵을 시각화합니다.
3. 유리체 얼음의 로타 바이러스 이중층 입자 (DLP) 분석
   1. 다른 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 로타바이러스 DLP용 동영상을 처리합니다. MotionCor2 v1.2.3을 사용하여 이미지의 드리프트를 수정합니다. 패치 CTF 추정을 사용하여 이미지의 렌즈 효과를 수정합니다.
   2. 소프트웨어에서 자동 선택 도구를 사용하여 상자 크기가 950픽셀인 입자를 추출합니다. 계산을 위해 필요에 따라 상자 크기를 다운 샘플링합니다.
   3. ab-initio 옵션과 C1 대칭을 사용하여 초기 모델을 계산합니다. 픽셀 크기 1.47Å 및 마스크 값 800Å를 포함한 미세 조정 매개변수를 사용합니다.
   4. I1 대칭을 적용하면서 추가 미세 조정 루틴을 수행합니다. 예제 결과에는 금 표준 FSC 기준에 따른 10.15 Å EM 맵이 포함됩니다. 사용된 총 입자는 2050개였으며, 이는 정사면체 대칭 연산자로 인해 123,000개의 프로토머 단위에 해당합니다(그림 5).
   5. ~750 Å에서 최종 맵을 마스킹하고 분자 구조 분석 소프트웨어 패키지에서 결과를 시각화합니다. EM 맵을 통한 예제 슬라이스는 그림 5 에 ~10nm 단위로 표시됩니다.

결과

모든 액체-EM 이미징 실험에는 200kV에서 작동하는 액체-TEM을 사용하였고, 모든 Cryo-EM 데이터 수집에는 300kV에서 작동하는 cryo-TEM을 사용하였다. 여러 바이러스의 대표적인 이미지와 구조를 제시하여 다양한 테스트 대상에 걸쳐 방법의 유용성을 입증합니다. 여기에는 재조합 아데노 관련 바이러스 아형 3(AAV), 환자 혈청에서 유래한 SARS-CoV-2 하위 바이러스 어셈블리, 유인원 로타바이러스 이중층 입자(...

토론

Cryo-EM 분야에서 채택된 새로운 자동화 도구 및 기술을 사용하여 현재 액체-EM 워크플로우를 간소화할 수 있는 새로운 기회가 제시됩니다. 새로운 마이크로칩 샌드위치 기술과 관련된 응용 분야는 액체 또는 유리질 얼음에서 고해상도 이미징 분석을 가능하게 하기 때문에 다른 방법과 관련하여 중요합니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 나노 스케일 수준에서 정교한 세부 사항을 시각?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Scientific	A11-1	1 Liter
Autoloader clipping tool	ThermoFisher Scientific	N/A	Also SubAngstrom supplier
Autoloader grid clips	ThermoFisher Scientific	N/A	top and bottom clips
Carbon-coated gold EM grids	Electron Microcopy Sciences	CF400-AU-50	400-mesh, 5-nm thickness
COVID-19 patient serum	RayBiotech	CoV-Pos-S-500	500 microliters of PCR+ serum
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	1 Liter
Microwell-integrad microchips	Protochips, Inc.	EPB-42A1-10	10x10-mm window arrays
TEMWindows microchips	Simpore Inc.	SN100-A10Q33B	9 large windows, 10-nn thick
TEMWindows microchips	Simpore, Inc.	SN100-A05Q33A	9 small windows, 5-nm thick
Top microchips	Protochips, Inc.	EPT-50W	500 mm x 100 mm window
Whatman #1 filter paper	Whatman	1001 090	100 pieces, 90 mm
Equipment
DirectView direct electron detector	Direct Electron		6-micron pixel spacing
Falcon 3 EC direct electron detector	ThermoFisher Scientific		14-micron pixel spacing
Gatan 655 Dry pump station	Gatan, Inc.		Pump holder tip to 10-6 range
Mark IV Vitrobot	ThermoFisher Scientific		state-of-the-art specimen preparation unit
PELCO easiGlow, glow discharge unit	Ted Pella, Inc.		Negative polarity mode
Poseidon Select specimen holder	Protochips, Inc.		FEI compatible;specimen holder
Talos F200C TEM	ThermoFisher Scientific		200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3	ThermoFisher Scientific		300 kV; Cryo-TEM
Freely available software	Website link		Comments (optional)
cryoSPARC	https://cryosparc.com/		other image processing software
CTFFIND4	https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4		CTF finding program
MotionCorr2	https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELION	https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEM	https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimera	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/		molecular structure analysis software package