Avançando a imagem de alta resolução de conjuntos de vírus em líquido e gelo

Resumo

Aqui os protocolos são descritos para preparar conjuntos de vírus adequados para análise líquido-EM e crio-EM em nanoescala usando microscopia eletrônica de transmissão.

Resumo

O interesse na microscopia líquida-eletrônica (EM-líquido) disparou nos últimos anos, já que os cientistas agora podem observar processos em tempo real em nanoescala. É extremamente desejável emparelhar informações crio-EM de alta resolução com observações dinâmicas, pois muitos eventos ocorrem em escalas de tempo rápidas - na faixa de milissegundos ou mais rápido. Um melhor conhecimento de estruturas flexíveis também pode ajudar no projeto de novos reagentes para combater patógenos emergentes, como o SARS-CoV-2. Mais importante ainda, a visualização de materiais biológicos em um ambiente fluido fornece um vislumbre único de seu desempenho no corpo humano. Apresentamos aqui métodos recém-desenvolvidos para investigar as propriedades em nanoescala de conjuntos de vírus em gelo líquido e vítreo. Para atingir esse objetivo, amostras bem definidas foram utilizadas como sistemas modelo. Comparações lado a lado dos métodos de preparação de amostras e informações estruturais representativas são apresentadas. Características sub-nanômetros são mostradas para estruturas resolvidas na faixa de ~3,5-Å-10 Å. Outros resultados recentes que apoiam essa estrutura complementar incluem insights dinâmicos de candidatas a vacinas e terapias baseadas em anticorpos com imagens em líquido. No geral, essas aplicações correlativas avançam nossa capacidade de visualizar a dinâmica molecular, fornecendo um contexto único para seu uso na saúde e na doença humanas.

Introdução

A pesquisa biomédica melhora nossa compreensão da saúde e da doença humanas através do desenvolvimento de novas tecnologias. A imagem de alta resolução está transformando nossa visão do nanomundo - permitindo-nos estudar células e moléculas em detalhes requintados 1,2,3,4,5. Informações estáticas de componentes dinâmicos, como polímeros moles, conjuntos de proteínas ou vírus humanos, revelam apenas um instantâneo limitado de sua narrativa complexa. Para entender melhor como as entidades moleculares operam, sua estrutura e função devem ser investigadas em conjunto.

Avanços recentes na produção de materiais como grafeno atomicamente fino ou microchips à base de silício oferecem novas oportunidades para análise estrutura-função em tempo real usando microscópios eletrônicos de transmissão (METs). Esses materiais podem criar câmaras hermeticamente seladas para imagens EM ao vivo 6,7,8,9,10,11. O novo campo de EM-líquido, o correlato de temperatura ambiente com o crio-EM, fornece visões sem precedentes de materiais duros ou macios em solução, permitindo que os cientistas estudem simultaneamente a estrutura e a dinâmica de sua amostra. As aplicações de EM líquido incluem registros em tempo real de nanopartículas terapêuticas interagindo com células-tronco cancerígenas, bem como mudanças nos meandros moleculares de patógenos virais^12,13,14.

Assim como os avanços metodológicos estimularam a revolução da resolução no campo da crio-EM, novas técnicas e métodos são necessários para ampliar o uso do líquido-EM como uma ferramenta de alto rendimento para a comunidade científica. O objetivo geral dos métodos apresentados aqui é simplificar os protocolos de preparação de amostras líquidas-EM. A lógica por trás das técnicas desenvolvidas é empregar novos projetos de microchips e dispositivos de carregador automático, adequados para a coleta de dados líquidos e crio-EM (Figura 1)7,14,15,16,17. Os conjuntos são selados mecanicamente usando clipes de grade padrão para instrumentos automatizados, como o Krios, que pode acomodar várias amostras por sessão ou um TEM F200C (Figura 2). Essa metodologia expande o uso de imagens de alta resolução para além das aplicações padrão de crio-EM, demonstrando propósitos mais amplos para análise de materiais em tempo real.

No presente artigo em vídeo, são apresentados protocolos para a preparação de conjuntos de vírus em líquido com e sem suportes de espécimes comercialmente disponíveis. Usando o suporte de amostra especializado para EM-líquido, espécimes líquidos finos podem fornecer informações estruturais comparáveis às amostras crio-EM, bem como insights dinâmicos dos espécimes. Também são demonstrados métodos para preparar amostras líquidas usando ferramentas de carregador automático para rotinas de alto rendimento. A principal vantagem sobre outras técnicas é que a produção automatizada de amostras permite que o usuário avalie rapidamente suas amostras quanto à espessura ideal e dosagem de elétrons antes da coleta de dados. Essa técnica de triagem identifica rapidamente áreas ideais para gravações em tempo real em líquido ou gelo^12,14,18,19. Para fins de determinação da estrutura 3D, o líquido-EM pode complementar os métodos crio-EM estabelecidos há muito tempo implementados no crio-EM. Os leitores que empregam tecnologias convencionais de TEM ou crio-EM podem considerar o uso de fluxos de trabalho líquido-EM para fornecer observações novas e dinâmicas de suas amostras de uma maneira que complemente suas estratégias atuais.

As amostras de vírus utilizadas neste protocolo incluem o vírus adenoassociado purificado subtipo 3 (AAV) obtido como presente e cultivado em condições padrão¹². Também foram utilizados conjuntos subvirais não infecciosos do SARS CoV-2 derivados do soro de pacientes com COVID-19¹² e obtidos de fonte comercial. Finalmente, partículas purificadas de dupla camada (DLPs) do rotavírus símio (cepa SA11) foram obtidas do laboratório da Dra. Sarah M. McDonald Esstman na Wake Forest University e cultivadas usando condições padrão ^6,17. Os pacotes de software descritos aqui estão disponíveis gratuitamente e os links foram fornecidos na seção Tabela de Materiais.

Protocolo

1. Carregamento do suporte do provete para o líquido-EM

1. Limpe os microchips de nitreto de silício (SiN) incubando cada chip em 150 mL de acetona por 2 min seguido de incubação em 150 mL de metanol por 2 min. Deixe os cavacos secarem em fluxo de ar laminar.
2. Limpe a plasma os cavacos secos usando um instrumento de descarga de brilho operando sob condições padrão de 30 W, 15 mA por 45 s usando gás argônio.
3. Coloque um microchip de base seca na ponta do suporte da amostra. Adicione ~0,2 μL de amostra (0,2-1 mg/mL de conjuntos de vírus em 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl₂) ao chip base. Após uma etapa de incubação de 1-2 minutos, coloque o chip superior no chip de base úmida que contém a amostra.
4. Aperte o conjunto para formar um invólucro hermeticamente fechado, mantido no lugar mecanicamente por três parafusos de latão. Ao selar o conjunto, bombeie a ponta para 10-6 Torr usando uma estação de bombeamento seco ^{turbo-bombeada} . O suporte está agora pronto para ser inserido no TEM.
   NOTA: O suporte seleto não tem capacidades de arrefecimento e não é utilizado para crio-EM.

2. Produção de conjuntos sanduíche de microchips

NOTA: Diferentes microchips de SiN ou dióxido de silício (SiO) podem ser usados diretamente das embalagens de gel enviadas. Grades de ouro revestidas de carbono também podem ser usadas diretamente como fornecidas.

1. O plasma limpa os microchips e as grades de carbono usando um instrumento de descarga de brilho operando sob condições padrão de 30 W, 15 mA para 45 s usando gás argônio.
2. Adicionar ~2 μL de amostra contida em HEPES de 50 mM, pH 7,5; NaCl de 150 mM; 10 mM MgCl₂; CaCl₂ de 10 mM para um microchip descarregado por brilho colocado em uma embalagem de gel. Remova o excesso de solução (~50%) usando um papel de filtro ou uma pipeta. Após uma etapa de incubação de 1-2 minutos, adicione a grade de carbono descarregada por brilho ao microchip úmido que contém a amostra.
3. Aperte o conjunto usando um suporte de amostra de inclinação única ou clipes de grade do carregador automático à temperatura ambiente para formar um gabinete hermeticamente fechado. Para as braçadeiras do carregador automático, coloque o conjunto sanduíche no clipe C inferior, coloque o clipe superior na parte superior do conjunto e use a ferramenta de fixação padrão para selar o conjunto.
   NOTA: O procedimento de fixação realizado aqui usa as mesmas etapas que para o clampeamento de grade crio-EM, mas à temperatura ambiente. As amostras presas podem ser armazenadas por 2 meses ou mais antes da imagem, mantendo o líquido no recinto. Nenhuma verificação de vazamento é usada com um suporte de amostra de temperatura ambiente ou o carregador automático.
4. O espécime está agora pronto para ser inserido no TEM. Examine as amostras colocadas em carregadores automáticos sob condições criogênicas ou à temperatura ambiente.

3. Espécimes de imagem usando um microscópio eletrônico de transmissão

1. Imagem Liquid-EM
   1. Carregar o suporte do espécime no MET equipado com um canhão de emissão de campo (FEG) e operando a 200 kV.
   2. Ligue a pistola e ajuste a altura eucêntrica do estágio do microscópio em relação ao espécime usando a função oscilante, inclinando a amostra de -15° a +15° na coluna. Este procedimento ajusta o estágio na direção Z para acomodar a espessura da amostra. E ajuda a garantir uma ampliação precisa durante a gravação da imagem.
   3. Grave imagens como filmes de moldura longa usando o pacote in situ integrado com um detector direto com um espaçamento de pixels de 6 μm (Vídeo 1 e Vídeo 2). Imagens individuais também podem ser gravadas usando o pacote de software de coleta de dados seriais²⁰, implementando rotinas de imagem automatizadas. Adquira imagens em condições de baixa dose em ampliações que variam de 28.000x-92.000x e 40 quadros por segundo.
   4. Ajuste os tempos de exposição (0,25-1 s) para minimizar os danos do feixe à amostra. Use um intervalo de desfocagem de -1-4 μm na ampliação especificada. Se uma solução espessa for encontrada, use valores de desfocagem mais altos ou selecione uma região diferente de interesse.
   5. Certifique-se de que a solução esteja presente nas amostras durante toda a sessão de imagem, concentrando o feixe de elétrons em uma área de sacrifício não usada para coleta de dados, até que as bolhas sejam formadas (Figura 1 Suplementar).
2. Imagem crio-EM
   1. Carregue as grades EM cortadas ou sanduíches de microchip no TEM equipado com um FEG e operando a 300 kV. Ligue a pistola e ajuste a altura eucêntrica do estágio do microscópio, usando um procedimento semelhante descrito para o líquido-TEM acima (etapa 3.1.2).
   2. Grave imagens individuais usando o sistema de análise de partículas únicas integrado ao sistema de microscópio enquanto implementa rotinas de imagem automatizadas. Grave imagens em condições de baixa dose usando o detector de elétrons diretos de análise de partícula única com um espaçamento de pixels de 14 μm a uma ampliação de 59.000x e 40 quadros por segundo.
   3. Use um intervalo de desfocagem de 1-4 μm na ampliação especificada. Se forem encontradas camadas espessas de gelo vítreo, use valores de desfocagem mais altos ou selecione uma região diferente para a coleta de dados.

4. Análise de dados e comparações de estruturas 3D

1. Análise do vírus adenoassociado (AAV) em gelo líquido e vítreo
   1. Processe filmes para partículas AAV em líquido e gelo usando o programa RELION-3.08²¹ ou outro software de processamento de imagem²². Execute a correção de movimento usando o MotionCor2 v1.2.3.
   2. Uma vez corrigido, extraia partículas usando a ferramenta de seleção automática no pacote de software do programa. Os tamanhos típicos das caixas são de 330 pixels para espécimes líquidos e 350 pixels para espécimes de gelo.
   3. Calcule as reconstruções iniciais usando a simetria C1 usando a rotina do modelo inicial 3D do programa e/ou as opções do modelo ab-initio no pacote de software de processamento de dados. No programa, use um parâmetro de regularização de T = 4 e um tamanho de pixel de 1,01 Å para espécimes líquidos e 1,13 Å para espécimes de gelo.
   4. Use um valor de máscara de 300 Å durante os procedimentos de refinamento. Execute protocolos de refinamento no software de processamento de dados usando simetria I1 para obter vários mapas EM. A resolução estrutural esperada pode estar na faixa de 4 Å ou melhor. Use equivalência de partículas implementando simetria icosaédrica em 16.800 para líquido e 15.240 para gelo^12,14.
      NOTA: As estimativas de resolução são baseadas nos critérios de correlação de casca de Fourier (FSC) padrão-ouro.
   5. Mascarar mapas EM a ~250 Å e examinar os resultados usando um pacote de software de análise de estrutura molecular^23,24. Na Figura 3, as fatias são mostradas em incrementos de ~5 nm.
   6. Extraia as subunidades da proteína do capsídeo (VP1) dos mapas EM para comparação. Quantifique as mudanças dinâmicas entre as estruturas EM com base nas medições do diâmetro das partículas (Figura 2 Suplementar) e, em seguida, visualize usando a função Morph map no software.
2. Análise de conjuntos subvirais do SARS-CoV-2 em líquido
   1. Processe filmes usando o programa RELION-3.08. Correto para desvio de imagem e movimento induzido por feixe usando MotionCor2 v1.2.3. Correto para a função de transferência de contraste (CTF) do microscópio.
   2. Use a ferramenta de seleção automática no programa para selecionar montagens virais com um tamanho de caixa de 800 pixels. Para eficiência computacional, as partículas extraídas podem ser redimensionadas para 256 pixels. Obtenha um modelo inicial usando simetria C1 no programa com um parâmetro de regularização de T = 2 e tamanho de pixel 1,66 Å.
   3. Execute o refinamento 3D no programa para obter um mapa EM, um exemplo é mostrado em ~ 8,25 Å de acordo com os critérios padrão do FSC (Figura 4). Visualize mapas EM usando o software de análise de estrutura molecular com fatias incrementadas a 25 nm, conforme demonstrado na Figura 4.
3. Análise de partículas de dupla camada de rotavírus (DLPs) em gelo vítreo
   1. Processe filmes para DLPs de rotavírus usando outro software de processamento de imagem. Use o MotionCor2 v1.2.3 para corrigir desvios nas imagens. Use a estimativa do Patch CTF para corrigir os efeitos da lente nas imagens.
   2. Extraia partículas usando a ferramenta de seleção automática no software com um tamanho de caixa de 950 pixels. Reduza a amostra do tamanho da caixa conforme necessário para fins de computação.
   3. Calcule os modelos iniciais usando opções ab-initio e simetria C1. Use parâmetros de refinamento, incluindo um tamanho de pixel de 1,47 Å e um valor de máscara de 800 Å.
   4. Execute rotinas de refinamento adicionais enquanto impõe simetria I1. Os resultados do exemplo incluem um mapa EM de 10,15 Å, de acordo com os critérios do FSC padrão-ouro. O total de partículas utilizadas foi de 2050, o que equivale a 123.000 unidades de protômeros devido ao operador de simetria icosaédrica (Figura 5).
   5. Mascare os mapas finais em ~750 Å e visualize os resultados no pacote de software de análise de estrutura molecular. Fatias de exemplo através do mapa EM são mostradas na Figura 5 em incrementos de ~10 nm.

Resultados

Um TEM líquido operando a 200 kV foi utilizado para todos os experimentos de imagem de EM líquido e um TEM crio-TEM operando a 300 kV foi usado para toda a coleta de dados de crio-EM. Imagens representativas e estruturas de vários vírus são apresentadas para demonstrar a utilidade dos métodos em vários sujeitos de teste. Estes incluem vírus adenoassociado recombinante subtipo 3 (AAV), SARS-CoV-2 sub-conjuntos virais derivados do soro do paciente e partículas de dupla camada de rotavírus símio (DLPs), cepa SA11...

Discussão

Novas oportunidades são apresentadas para agilizar os fluxos de trabalho atuais de EM líquido usando novas ferramentas e tecnologias automatizadas adaptadas do campo crio-EM. As aplicações que envolvem a nova técnica de sanduíche de microchip são significativas em relação a outros métodos, pois permitem a análise de imagens de alta resolução em gelo líquido ou vítreo. Uma das etapas mais críticas do protocolo é a produção de espécimes com a espessura líquida ideal para visualizar detalhes requintados...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Scientific	A11-1	1 Liter
Autoloader clipping tool	ThermoFisher Scientific	N/A	Also SubAngstrom supplier
Autoloader grid clips	ThermoFisher Scientific	N/A	top and bottom clips
Carbon-coated gold EM grids	Electron Microcopy Sciences	CF400-AU-50	400-mesh, 5-nm thickness
COVID-19 patient serum	RayBiotech	CoV-Pos-S-500	500 microliters of PCR+ serum
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	1 Liter
Microwell-integrad microchips	Protochips, Inc.	EPB-42A1-10	10x10-mm window arrays
TEMWindows microchips	Simpore Inc.	SN100-A10Q33B	9 large windows, 10-nn thick
TEMWindows microchips	Simpore, Inc.	SN100-A05Q33A	9 small windows, 5-nm thick
Top microchips	Protochips, Inc.	EPT-50W	500 mm x 100 mm window
Whatman #1 filter paper	Whatman	1001 090	100 pieces, 90 mm
Equipment
DirectView direct electron detector	Direct Electron		6-micron pixel spacing
Falcon 3 EC direct electron detector	ThermoFisher Scientific		14-micron pixel spacing
Gatan 655 Dry pump station	Gatan, Inc.		Pump holder tip to 10-6 range
Mark IV Vitrobot	ThermoFisher Scientific		state-of-the-art specimen preparation unit
PELCO easiGlow, glow discharge unit	Ted Pella, Inc.		Negative polarity mode
Poseidon Select specimen holder	Protochips, Inc.		FEI compatible;specimen holder
Talos F200C TEM	ThermoFisher Scientific		200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3	ThermoFisher Scientific		300 kV; Cryo-TEM
Freely available software	Website link		Comments (optional)
cryoSPARC	https://cryosparc.com/		other image processing software
CTFFIND4	https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4		CTF finding program
MotionCorr2	https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELION	https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEM	https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimera	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/		molecular structure analysis software package