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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, des protocoles sont décrits pour préparer des assemblages de virus adaptés à l’analyse liquide-EM et cryo-EM à l’échelle nanométrique en utilisant la microscopie électronique à transmission.

Résumé

L’intérêt pour la microscopie électronique liquide (EM liquide) a explosé ces dernières années, car les scientifiques peuvent maintenant observer des processus en temps réel à l’échelle nanométrique. Il est extrêmement souhaitable de coupler des informations cryo-EM à haute résolution avec des observations dynamiques, car de nombreux événements se produisent à des échelles de temps rapides - de l’ordre de la milliseconde ou plus. Une meilleure connaissance des structures flexibles peut également aider à la conception de nouveaux réactifs pour lutter contre les agents pathogènes émergents, tels que le SRAS-CoV-2. Plus important encore, l’observation des matériaux biologiques dans un environnement fluide donne un aperçu unique de leur performance dans le corps humain. Les méthodes nouvellement développées ici sont présentées pour étudier les propriétés à l’échelle nanométrique des assemblages de virus dans la glace liquide et vitreuse. Pour atteindre cet objectif, des échantillons bien définis ont été utilisés comme systèmes modèles. Des comparaisons côte à côte des méthodes de préparation des échantillons et des informations structurelles représentatives sont présentées. Les caractéristiques sub-nanométriques sont montrées pour les structures résolues dans la plage de ~3,5-Å-10 Å. Parmi les autres résultats récents qui soutiennent ce cadre complémentaire, citons les connaissances dynamiques des candidats vaccins et des thérapies à base d’anticorps imagées dans un liquide. Dans l’ensemble, ces applications corrélatives font progresser notre capacité à visualiser la dynamique moléculaire, fournissant un contexte unique pour leur utilisation dans la santé et la maladie humaines.

Introduction

La recherche biomédicale améliore notre compréhension de la santé et des maladies humaines grâce au développement de nouvelles technologies. L’imagerie à haute résolution transforme notre vision du nanomonde - nous permettant d’étudier les cellules et les molécules dans les moindres détails 1,2,3,4,5. L’information statique des composants dynamiques tels que les polymères mous, les assemblages de protéines ou les virus humains ne révèle qu’un instantané limité de leur récit complexe. Pour mieux comprendre le fonctionnement des entités moléculaires, leur structure et leur fonction doivent être étudiées conjointement.

Les progrès récents dans la production de matériaux tels que le graphène atomiquement mince ou les micropuces à base de silicium offrent de nouvelles possibilités d’analyse structure-fonction en temps réel à l’aide de microscopes électroniques à transmission (MET). Ces matériaux peuvent créer des chambres hermétiquement scellées pour l’imagerie EM en direct 6,7,8,9,10,11. Le nouveau champ de liquide-EM, le corrélat à température ambiante à cryo-EM, fournit des vues sans précédent des matériaux durs ou mous en solution, permettant aux scientifiques d’étudier simultanément la structure et la dynamique de leur échantillon. Les applications EM liquides comprennent des enregistrements en temps réel de nanoparticules thérapeutiques interagissant avec les cellules souches cancéreuses ainsi que des changements dans les subtilités moléculaires des pathogènes viraux12,13,14.

Tout comme les progrès méthodologiques ont stimulé la révolution de la résolution dans le domaine de la cryo-EM, de nouvelles techniques et méthodes sont nécessaires pour étendre l’utilisation de la ME liquide en tant qu’outil à haut débit pour la communauté scientifique. L’objectif global des méthodes présentées ici est de rationaliser les protocoles de préparation des échantillons liquides. La raison d’être des techniques développées est d’utiliser de nouvelles conceptions de micropuces et de dispositifs de chargement automatique, adaptés à la collecte de données liquides et cryo-EM (Figure 1)7,14,15,16,17. Les assemblages sont scellés mécaniquement à l’aide de clips de grille standard pour les instruments automatisés, tels que le Krios, qui peut accueillir plusieurs échantillons par session ou un TEM F200C (Figure 2). Cette méthodologie étend l’utilisation de l’imagerie haute résolution au-delà des applications cryo-EM standard, démontrant des objectifs plus larges pour l’analyse des matériaux en temps réel.

Dans le présent article vidéo, des protocoles sont présentés pour la préparation d’assemblages de virus dans un liquide avec et sans porte-échantillons disponibles dans le commerce. En utilisant le porte-échantillon spécialisé pour les échantillons liquides-EM, les échantillons liquides minces peuvent fournir des informations structurelles comparables aux échantillons cryo-EM, ainsi que des informations dynamiques sur les échantillons. Des méthodes de préparation d’échantillons liquides à l’aide d’outils de chargement automatique pour les routines à haut débit ont également été démontrées. Le principal avantage par rapport aux autres techniques est que la production automatisée d’échantillons permet à l’utilisateur d’évaluer rapidement ses échantillons pour une épaisseur et un dosage d’électrons optimaux avant la collecte des données. Cette technique de criblage identifie rapidement les zones idéales pour les enregistrements en temps réel dans un liquide ou de la glace12,14,18,19. Aux fins de la détermination de la structure 3D, la solution EM liquide peut compléter les méthodes cryo-EM établies de longue date mises en œuvre dans la cryo-EM. Les lecteurs utilisant des technologies conventionnelles de GDT ou de cryo-EM peuvent envisager d’utiliser des flux de travail liquide-EM pour fournir de nouvelles observations dynamiques de leurs échantillons d’une manière qui complète leurs stratégies actuelles.

Les échantillons de virus utilisés dans ce protocole comprennent le virus adéno-associé purifié de sous-type 3 (AAV) obtenu en cadeau et cultivé dans des conditions standard12. Des assemblages sous-viraux non infectieux du SRAS-CoV-2 dérivés du sérum de patients atteints de COVID-1912 et obtenus d’une source commerciale ont également été utilisés. Enfin, des particules à double couche (DLP) purifiées du rotavirus simien (souche SA11) ont été obtenues dans le laboratoire du Dr Sarah M. McDonald Esstman à l’Université de Wake Forest et cultivées en utilisant des conditions standard 6,17. Les progiciels décrits ici sont disponibles gratuitement et les liens ont été fournis dans la section Tableau des matériaux.

Protocole

1. Chargement du porte-échantillon pour liquide-EM

  1. Nettoyez les micropuces de nitrure de silicium (SiN) en incubant chaque puce dans 150 mL d’acétone pendant 2 minutes, suivie d’une incubation dans 150 mL de méthanol pendant 2 min. Laissez les copeaux sécher dans un flux d’air laminaire.
  2. Nettoyez au plasma les copeaux séchés à l’aide d’un instrument à décharge luminescente fonctionnant dans des conditions standard de 30 W, 15 mA pendant 45 s en utilisant du gaz argon.
  3. Chargez une micropuce à base sèche dans l’extrémité du porte-échantillon. Ajouter ~0,2 μL d’échantillon (0,2-1 mg/mL d’assemblages de virus dans 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) à la puce de base. Après une étape d’incubation de 1 à 2 minutes, placez la puce supérieure sur la puce de base humide contenant l’échantillon.
  4. Serrez l’ensemble ensemble pour former une enceinte hermétiquement scellée, maintenue mécaniquement en place par trois vis en laiton. Lors de l’étanchéité de l’ensemble, pompez la pointe à 10-6 Torr à l’aide d’une station de pompage à sec turbo-pompée . Le support est maintenant prêt à être inséré dans le TEM.
    REMARQUE: Le support de sélection n’a aucune capacité de refroidissement et n’est pas utilisé pour cryo-EM.

2. Production d’assemblages sandwich à micropuce

REMARQUE: Différentes micropuces SiN ou dioxyde de silicium (SiO) peuvent être utilisées directement à partir des packs de gel expédiés. Les grilles en or revêtues de carbone peuvent également être utilisées directement telles qu’elles sont fournies.

  1. Nettoyez au plasma les micropuces et les grilles de carbone à l’aide d’un instrument à décharge luminescente fonctionnant dans des conditions standard de 30 W, 15 mA pendant 45 s en utilisant du gaz argon.
  2. Ajouter ~2 μL d’échantillon contenu dans 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2 à une micropuce à décharge luminescente placée sur un sachet de gel. Éliminer l’excès de solution (~50%) à l’aide d’un papier filtre ou d’une pipette. Après une étape d’incubation de 1 à 2 minutes, ajoutez la grille de carbone à décharge luminescente à la micropuce humide contenant l’échantillon.
  3. Serrez l’ensemble à l’aide d’un porte-échantillon à inclinaison unique ou de clips de grille de chargeur automatique à température ambiante pour former un boîtier hermétiquement fermé. Pour les pinces à chargement automatique, placez l’ensemble sandwich sur le clip C inférieur, placez le clip supérieur sur le dessus de l’ensemble et utilisez l’outil de serrage standard pour sceller l’ensemble.
    REMARQUE: La procédure de serrage effectuée ici utilise les mêmes étapes que pour le serrage cryo-EM de grille, mais à température ambiante. Les échantillons serrés peuvent être conservés pendant 2 mois ou plus avant l’imagerie tout en maintenant le liquide dans l’enceinte. Aucun contrôle d’étanchéité n’est utilisé avec un porte-échantillon à température ambiante ou le chargeur automatique.
  4. Le spécimen est maintenant prêt à être inséré dans le TEM. Examiner les échantillons placés dans des chargeurs automatiques dans des conditions cryogéniques ou à température ambiante.

3. Imagerie d’échantillons au microscope électronique à transmission

  1. Imagerie EM liquide
    1. Charger le porte-échantillon dans le TEM équipé d’un canon à émission de champ (FEG) et fonctionnant à 200 kV.
    2. Allumez le pistolet et ajustez la hauteur eucentrique de l’étage du microscope par rapport à l’échantillon en utilisant la fonction wobbler, en inclinant l’échantillon de -15° à +15° dans la colonne. Cette procédure ajuste l’étage dans la direction Z pour s’adapter à l’épaisseur de l’échantillon. Et permet d’assurer un grossissement précis pendant l’enregistrement de l’image.
    3. Enregistrez des images sous forme de films à cadre long à l’aide du boîtier in situ intégré à un détecteur direct ayant un espacement des pixels de 6 μm (vidéo 1 et vidéo 2). Les images individuelles peuvent également être enregistrées à l’aide du progiciel de collecte de données série20, mettant en œuvre des routines d’imagerie automatisées. Obtenez des images dans des conditions de faible dose à des grossissements allant de 28 000 x à 92 000x et 40 images par seconde.
    4. Ajuster les temps d’exposition (0,25-1 s) pour minimiser les dommages causés par le faisceau à l’échantillon. Utilisez une plage de flou de -1-4 μm au grossissement spécifié. Si une solution épaisse est rencontrée, utilisez des valeurs de défocalisation plus élevées ou sélectionnez une autre région d’intérêt.
    5. Assurez-vous que la solution est présente dans les échantillons tout au long de la séance d’imagerie en concentrant le faisceau d’électrons sur une zone sacrificielle non utilisée pour la collecte de données, jusqu’à ce que des bulles se forment (figure supplémentaire 1).
  2. Imagerie cryo-EM
    1. Chargez les grilles EM coupées ou les sandwichs à micropuce dans le TEM équipé d’un FEG et fonctionnant à 300 kV. Allumez le pistolet et ajustez la hauteur eucentrique de la platine du microscope, en utilisant une procédure similaire décrite pour le TEM liquide ci-dessus (étape 3.1.2).
    2. Enregistrez des images individuelles à l’aide du système d’analyse de particules unique intégré au système de microscope tout en mettant en œuvre des routines d’imagerie automatisées. Enregistrez des images dans des conditions à faible dose à l’aide du détecteur d’électrons direct à analyse de particules unique ayant un espacement des pixels de 14 μm à un grossissement de 59 000x et 40 images par seconde.
    3. Utilisez une plage de flou de 1 à 4 μm au grossissement spécifié. Si d’épaisses couches de glace vitreuse sont rencontrées, utilisez des valeurs de flou plus élevées ou sélectionnez une autre région pour la collecte de données.

4. Analyse des données et comparaisons de structures 3D

  1. Analyse du virus adéno-associé (AAV) dans la glace liquide et vitreuse
    1. Traiter les films pour les particules AAV dans le liquide et la glace en utilisant RELION-3.08 programme21 ou un autre logiciel de traitement d’image22. Effectuez une correction de mouvement à l’aide de MotionCor2 v1.2.3.
    2. Une fois corrigées, extraire les particules à l’aide de l’outil de prélèvement automatique dans le progiciel du programme. Les tailles de boîte typiques sont de 330 pixels pour les spécimens liquides et de 350 pixels pour les spécimens de glace.
    3. Calculez les reconstructions initiales à l’aide de la symétrie C1 à l’aide de la routine du modèle initial 3D du programme et/ou des options de modèle ab-initio dans le progiciel de traitement des données. Dans le programme, utilisez un paramètre de régularisation de T = 4 et une taille de pixel de 1,01 Å pour les échantillons liquides et de 1,13 Å pour les spécimens de glace.
    4. Utilisez une valeur de masque de 300 Å tout au long des procédures d’affinement. Exécuter des protocoles d’affinement dans le logiciel de traitement des données en utilisant la symétrie I1 pour obtenir plusieurs cartes EM. La résolution structurelle attendue peut être de l’ordre de 4 Å ou mieux. Utiliser l’équivalence des particules en appliquant la symétrie icosaédrique à 16 800 pour le liquide et à 15 240 pour la glace12,14.
      REMARQUE : Les estimations de résolution sont basées sur les critères de corrélation de coquille de Fourier (FSC) de référence.
    5. Masquez les cartes EM à ~250 Å et examinez les résultats à l’aide d’un logiciel d’analyse de structure moléculaire23,24. Dans la figure 3, les tranches sont représentées par incréments de ~5 nm.
    6. Extraire les sous-unités de la protéine de capside (VP1) des cartes EM à des fins de comparaison. Quantifier les changements dynamiques entre les structures EM en fonction des mesures du diamètre des particules (Figure supplémentaire 2), puis visualisez à l’aide de la fonction Morph map du logiciel.
  2. Analyse des assemblages sous-viraux du SARS-CoV-2 dans un liquide
    1. Traitez les films à l’aide du programme RELION-3.08. Correction de la dérive de l’image et du mouvement induit par le faisceau à l’aide de MotionCor2 v1.2.3. Corriger la fonction de transfert de contraste (CTF) du microscope.
    2. Utilisez l’outil de sélection automatique du programme pour sélectionner des assemblages viraux d’une taille de boîte de 800 pixels. Pour l’efficacité de calcul, les particules extraites peuvent être redimensionnées à 256 pixels. Obtenez un modèle initial en utilisant la symétrie C1 dans le programme avec un paramètre de régularisation de T = 2 et une taille de pixel de 1,66 Å.
    3. Effectuez un raffinement 3D dans le programme pour obtenir une carte EM, un exemple est montré à ~8,25 Å selon les critères FSC standard (Figure 4). Visualisez les cartes EM à l’aide du logiciel d’analyse de structure moléculaire avec des tranches incrémentées à 25 nm, comme illustré à la figure 4.
  3. Analyse des particules à double couche (DLP) du rotavirus dans la glace vitrée
    1. Traiter les films pour les DLP de rotavirus à l’aide d’autres logiciels de traitement d’image. Utilisez MotionCor2 v1.2.3 pour corriger la dérive des images. Utilisez l’estimation CTF du patch pour corriger les effets de lentille sur les images.
    2. Extrayez les particules à l’aide de l’outil de prélèvement automatique du logiciel avec une taille de boîte de 950 pixels. Sous-échantillonnez la taille de la boîte selon les besoins informatiques.
    3. Calculez les modèles initiaux à l’aide des options ab-initio et de la symétrie C1. Utilisez des paramètres d’affinement, notamment une taille de pixel de 1,47 Å et une valeur de masque de 800 Å.
    4. Effectuez des routines de raffinement supplémentaires tout en imposant la symétrie I1. Les exemples de résultats incluent une carte EM de 10,15 Å, selon les critères FSC de référence. Le nombre total de particules utilisées était de 2050, ce qui équivaut à 123 000 unités protomères en raison de l’opérateur de symétrie icosaédrique (Figure 5).
    5. Masquez les cartes finales à ~750 Å et visualisez les résultats dans le progiciel d’analyse de structure moléculaire. Des exemples de tranches à travers la carte EM sont présentés à la figure 5 par incréments de ~10 nm.

Résultats

Un TEM liquide fonctionnant à 200 kV a été utilisé pour toutes les expériences d’imagerie EM liquide et un cryo-TEM fonctionnant à 300 kV a été utilisé pour toute la collecte de données cryo-EM. Des images et des structures représentatives de plusieurs virus sont présentées pour démontrer l’utilité des méthodes sur divers sujets de test. Il s’agit notamment du virus adéno-associé recombinant de sous-type 3 (AAV), des assemblages sous-viraux du SARS-CoV-2 dérivés du sérum du patient et des parti...

Discussion

De nouvelles opportunités sont présentées pour rationaliser les flux de travail actuels de liquide EM en utilisant de nouveaux outils automatisés et des technologies adaptées du domaine cryo-EM. Les applications impliquant la nouvelle technique sandwich par micropuce sont importantes par rapport à d’autres méthodes, car elles permettent une analyse d’imagerie à haute résolution dans la glace liquide ou vitreuse. L’une des étapes les plus critiques du protocole consiste à produire des spécimens avec l’...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents. L’auteur, Madeline J. Dressel-Dukes, est une employée de Protochips, Inc. et Michael Spilman est un employé de DirectElectron.

Remerciements

Les auteurs remercient le Dr Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Département d’ophtalmologie) pour avoir fourni AAV-3 purifié. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health et le National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 à D.F.K.).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneFisher Scientific A11-11 Liter
Autoloader clipping toolThermoFisher ScientificN/AAlso SubAngstrom supplier
Autoloader grid clipsThermoFisher ScientificN/Atop and bottom clips
Carbon-coated gold EM gridsElectron Microcopy SciencesCF400-AU-50400-mesh, 5-nm thickness
COVID-19 patient serumRayBiotechCoV-Pos-S-500500 microliters of PCR+ serum
MethanolFisher Scientific A412-11 Liter
Microwell-integrad microchipsProtochips, Inc.EPB-42A1-1010x10-mm window arrays
TEMWindows microchipsSimpore Inc.SN100-A10Q33B9 large windows, 10-nn thick
TEMWindows microchipsSimpore, Inc. SN100-A05Q33A9 small windows, 5-nm thick
Top microchipsProtochips, Inc.EPT-50W500 mm x 100 mm window
Whatman #1 filter paperWhatman1001 090100 pieces, 90 mm
Equipment 
DirectView direct electron detectorDirect Electron6-micron pixel spacing
Falcon 3 EC direct electron detectorThermoFisher Scientific14-micron pixel spacing
Gatan 655 Dry pump stationGatan, Inc. Pump holder tip to 10-6 range
Mark IV VitrobotThermoFisher Scientificstate-of-the-art specimen preparation unit 
PELCO easiGlow, glow discharge unitTed Pella, Inc. Negative polarity mode
Poseidon Select specimen holderProtochips, Inc. FEI compatible;specimen holder
Talos F200C TEMThermoFisher Scientific200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3ThermoFisher Scientific300 kV; Cryo-TEM
Freely available softwareWebsite linkComments (optional)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/other image processing software
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4CTF finding program
MotionCorr2https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/molecular structure analysis software package

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