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要約

本プロトコルは、光トラップと表面増強ラマン分光法(SERS)を統合してプラズモニックナノ粒子を操作して高感度分子検出を行うための便利なアプローチを記載しています。凝集剤なしで、トラッピングレーザーはプラズモニックナノ粒子を組み立てて、 in situ 分光測定用のターゲット分析物のSERSシグナルを強化します。

要約

表面増強ラマン分光法(SERS)は、金属ナノ構造の電場が増強されているため、さまざまなアプリケーションで分析種分子の超高感度検出を可能にします。塩誘導性銀ナノ粒子凝集は、SERS活性基質を生成するための最も一般的な方法です。ただし、再現性、安定性、および生体適合性が低いために制限されます。本プロトコルは、光マニピュレーションとSERS検出を統合して、これに対処するための効率的な分析プラットフォームを開発します。1064 nmのトラップレーザーと532 nmのラマンプローブレーザーを顕微鏡で組み合わせて銀ナノ粒子を組み立て、水性環境で のin situSERS 測定用のプラズモニックホットスポットを生成します。凝集剤なしで、この動的プラズモニック銀ナノ粒子アセンブリは、分析物分子シグナルの約50倍の増強を可能にします。さらに、0.05 nMという低い分析物でコーティングされた銀ナノ粒子溶液でSERS活性アセンブリを形成するための空間的および時間的制御を提供し、 in vivo 分析の潜在的な摂動を最小限に抑えます。したがって、この光トラップ統合SERSプラットフォームは、液体中、特に水性生理学的環境における効率的で再現性のある安定した分子分析に大きな可能性を秘めています。

概要

表面増強ラマン分光法(SERS)は、超低濃度または単一分子レベルで標的分子の化学構造を直接検出するための高感度分析技術です1,2,3,4。レーザー照射は、標的分子のラマンシグナルを増幅するためのSERS基板として使用される金属ナノ構造に局在表面プラズモン共鳴を誘導します。塩誘導ナノ粒子凝集体は広く使用されているSERS基質であり、コロイド懸濁液中で自発的にブラウン運動を受ける5,6。さらに乾燥することで、安定したSERS測定が可能になります。しかしながら、不純物濃度が発生する可能性があり、これはバックグラウンドノイズを導入し、生物学的試料7に不可逆的な損傷を引き起こす。したがって、無塩ナノ粒子凝集体を開発し、溶液中での動きを制御し、測定効率を維持しながら生体適合性を改善することが適切です。

光学トラッピングは、さまざまな金属基板を制御し、SERS検出を容易にするために採用されています8、9、10、11、12、13、14。光学トラップは、レーザ光をしっかりと集束させて光学力場を生成することによって生成され、焦点15,16の周りの最も強度の高い領域に小さな物体を引き付けます。最近、光トラップは、さまざまなアプリケーション向けの再現性のある高感度プラズモニックセンシングプラットフォームの開発に使用され、溶液中のSERS活性金属ナノ構造の位置を特定および制御する独自の利点を示しています17,18,19,20,21,22,23,24.本プロトコルでは、光ピンセットとラマン分光顕微鏡を組み合わせて銀ナノ粒子(AgNP)を動的に組み立て、溶液中のブラウン運動に対して安定化させて効率的なSERS測定を行うアプローチを紹介します。AgNPアセンブリ領域では、AgNPの表面にコーティングされた分析物分子である3,3'-ジチオビス[6-ニトロ安息香酸]ビス(スクシンイミド)エステル(DSNB)のシグナルを約50倍増強することができます。このアプローチは、化学キャッピング剤25、26、27と不適合な高感度生体分子を分析するのに適している。さらに、SERSアクティブAgNPアセンブリを生成するための空間的および時間的制御を提供します。これにより、水性環境でのin situ検出が可能になり、AgNPの使用を減らし、in vivo分析の摂動を最小限に抑えることができます28,29,30。さらに、光トラッピング誘発AgNPアセンブリは、安定で、再現性があり、可逆的である31,32。したがって、溶液中および塩誘導凝集が適用できない生理学的条件下で分析物分子を検出するための有望なプラットフォームです。

本研究では、1064 nmのトラップレーザー、力検出モジュール、および明視野照明光源を光学ピンセット顕微鏡システムに統合して、粒子の光学操作と視覚化を行います。532 nmのラマンプローブレーザーも顕微鏡に組み込まれ、サンプルチャンバー内のトラップレーザーと位置合わせされました。スペクトル取得のために、後方散乱光を収集し、分光器にリダイレクトしました(図1)。

プロトコル

1.光学セットアップ

  1. 532 nmのレーザービーム(ラマン励起源)を光学ピンセット顕微鏡のフレックスポートに向けます( 材料表を参照)。
  2. 532 nmのレーザービームを750 nmのロングパスダイクロイックミラーで光学ピンセット顕微鏡のステレオ二重層経路に合わせ、元のトラップレーザービームと組み合わせてサンプルチャンバーに焦点を合わせます。
  3. 750 nmのロングパスダイクロイックミラーを使用してサンプルチャンバーから後方散乱光を収集し、液体窒素冷却電荷結合素子(CCD)カメラを含む分光器にリダイレクトします( 材料表を参照)。スペクトル取得の前に、分光器の入口スリットの前に532 nmのノッチフィルターを配置します。
    注意: レーザーをオンにするときは目の保護具を使用する必要があり、レーザービームは安全な領域内に収める必要があります。

2. AgNPの作製

  1. 1mM AgNO3水溶液50mLを沸騰させながらナスフラスコに加熱する。
  2. 沸騰したAgNO3 水溶液に1.0 mLの0.1 Mクエン酸三ナトリウム溶液を滴下します。
  3. 絶えず攪拌しながら混合物を16分間沸騰させ続ける。
  4. 混合物を室温に冷却する。黄色がかった色が観察されます。
  5. AgNPコロイドを室温で2000 × g で5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を除去します。
  6. AgNPコロイドを1 mLの脱イオン水(抵抗率18.2 MΩ cm)で再懸濁します。
  7. 手順2.5と2.6を3回繰り返して、残留還元剤を除去します。
  8. 走査型電子顕微鏡(SEM)と動的光散乱(DLS)33 を使用してAgNPのサイズ分布を特徴付け、AgNPの均一性を確認します(図2)。AgNP濃度はUV吸光度34により0.1nMと推定された。
    注:濃度が低いため、AgNPストック溶液はクラスタリングなしで2〜3週間維持できます。安定化剤は必要ありません。AgNPストック溶液に沈殿物が観察された場合は、上記のプロトコルに従って新しいAgNP溶液を調製しました。

3. DSNB分析物分子とAgNPの相互作用

  1. 200 μLの2 mM DSNB( 材料表を参照)を1 mLのAgNPコロイドに加え、室温で3時間インキュベートして、AgNPとDSNB35の間のAg-S結合の形成によってAgNPの表面にDSNBの層をコーティングします。この相互作用の概略図を 図3に示します。
  2. AgNPを2,000 × g で室温で5分間遠心分離し、上清を除去します。
  3. AgNP-DSNBを1 mLの脱イオン水で再懸濁します。
  4. 手順 3.2 と 3.3 を 3 回繰り返して、余分な DSNB を削除します。
  5. AgNPコロイドおよびAgNP-DSNB溶液の紫外可視スペクトルを記録します。
    注:このスペクトルは、約420 nmから450 nmへの吸収ピークシフトを示しており、AgNPの表面でのDSNBのコーティングが成功したことを示しています(図3)。

4. SERS測定用試料室の作製とAgNPアセンブリの生成

  1. スライドガラスをきれいにし、水とエタノールで覆います。
  2. スライドガラスにフレームテープ(厚さ0.25mm、 材料表参照)を貼り付けてチャンバー(長さ1.0cm×幅1.0cm×高さ0.25mm)を作成します。
  3. AgNP-DSNB溶液(約25μL)を数滴フレームに加えます。
  4. カバーガラスをフレームテープの上に置き、密封します(図4)。
  5. 液体窒素冷却CCDカメラの容器に液体窒素を-120°Cになるまで加えます。
  6. 磁気レーザー安全スクリーン( 材料表を参照)を使用してラマンプローブビーム経路をブロックし、532nmのラマン励起源レーザーをオンにします。
  7. サンプルチャンバーをAgNP-DSNB溶液でチャンバーホルダーに固定します。図1に示すように、水に浸した対物レンズ(1.2倍の倍率、 1.2の開口A1.2)に水を追加します。次に、チャンバーホルダーを対物レンズの上のマイクロステージにすぐに置きます。
  8. カバーガラスの上に液浸オイルを落とし、油浸コンデンサーを配置して、顕微鏡カメラで粒子を視覚化します。
  9. 532 nmのラマンプローブビームがチャンバーの下部ガラス面に集束し、顕微鏡カメラに白いスポットが表示されるまで、顕微鏡のノブを回して対物レンズのZ位置を調整します(図5)。
    1. マイクロステージのX位置とY位置を調整してチャンバーを移動させ、チャンバーの中央領域を白いスポットに配置します。光ピンセット制御ソフトウェア( 材料の表を参照)を開き、装備されているジョイスティックコントロールを使用して、1064 nmトラップレーザー(光ピンセットシステムの赤い円で示されている)を白いスポットと重なるように動かします(図5)。
    2. 次に、顕微鏡のつまみを調整して、対物レンズのZ位置を上に動かします。
      注:顕微鏡カメラ画像の白い斑点が消えていることは、532nmのラマンプローブビームがチャンバー内に集束していることを示しています。
  10. 1064 nmのトラップレーザーをオンにして、サンプルチャンバー内のAgNPを引き付け、プラズモニックAgNPアセンブリを作成します。
    注:AgNPが集まると、サンプルチャンバーにダークスポットができます(図6B)。
    1. 必要に応じて過熱や気泡の形成を避けるために、トラップレーザービームを下げてください。
      注意: AgNPアセンブリの明らかな形成がない場合は、トラップレーザー出力と照射時間を増やします。
  11. サンプルマイクロステージの位置を調整して、プラズモニックAgNPアセンブリのダークスポットを分光測定用の532 nmラマンプローブビームの焦点の下に配置します。
  12. 532 nmのラマンレーザー出口の前に減光(ND)フィルターを配置して、出力を10 mWに調整します。スペクトルソフトウェアの設定パネル(材料表を参照)に取得時間(本研究では10秒、図6)を入力し、[取得]ボタンをクリックしてスペクトル取得を開始します。
    注:これにより、分析種分子のSERSスペクトルが生成されます(代表的な結果と 図6のDSNB)。

結果

概念実証として、DSNBが分析物分子として選択され、AgNPの表面にコーティングされました。プラズモニックAgNPアセンブリおよび分散AgNPによって増強されたDSNBの典型的なSERSスペクトルを図6に示す。トラップレーザーがない場合、サンプルチャンバー内に分散したAgNPは、ラマンプローブレーザーによる励起時にブラックスペクトル(図6A)を生成しました。DSNBの対称NO2ストレッチからの特徴的なピークである約1380-1450 cm-1で弱くブロードなSERSシグナルが観察され、これは文献報告35,36と一致しています。分散したAgNPはブラウン運動を受けていたため、図6Cに示すように、粒子間接合は大きく不安定でした。したがって、DSNBのSERSシグナル増幅は、分散したAgNPに対して低かった。

AgNPは、トラッピングレーザーがオンのときにプラズモニックAgNPアセンブリを形成するために収集されます。図6Bに示すように、トラップレーザーの出力を上げて照射時間を延長すると、より多くのAgNPを引き付け、ダークスポットを生成することができます。ここでは、700 mMのトラップレーザー出力と20秒の照射時間を適用して、0.05 nM DSNBコーティングされたAgNP溶液中に、指定された場所と瞬間にプラズモニックAgNPアセンブリを作成しました。DSNBのSERSスペクトルは、プラズモニックAgNPアセンブリの領域で得られた(図6A、赤)。930 cm-1の強いラマンバンドはニトロシザー振動に割り当てられ、1078 cm-1、1152 cm-1、および1191 cm-1の大きなバンドは、DSNB 35,37の芳香環モードと重なるスクシンイミジルN-C-Oストレッチに対応する可能性があります。1385 cm-1および1444 cm-1の特徴バンドは、DSNBの対称ニトロストレッチから生じ、AgNP35,37の表面との反応により大幅に強化され、わずかにシフトします。以前に報告されたDSNB35,36,37のSERSフィンガープリントに基づいて、1579 cm-1のバンドがDSNBの芳香環モードに割り当てられました。プラズモニックAgNPアセンブリにおけるDSNBの全体的な強度は、分散したAgNPの強度よりも高かった。1444 cm-1の特徴的なピークの強度を考慮すると、プラズモニックAgNPアセンブリは、分散したAgNPのSERS信号と比較して、DSNBのSERSシグナルの約50倍の増強を提供できます。図7に示すように、DSNBのSERSスペクトルは、実験中のAgNPアセンブリについて繰り返し(20回)記録され、同一の振動特性を示しました。これらの20のSERSスペクトルにわたる1152 cm-1、1444 cm-1、および1579 cm-1のDSNBの特徴的なピークの強度を、相対標準偏差(RSD)がそれぞれ6.88%、6.59%、および5.48%のヒストグラムとしてプロットしました。これにより、再現性と安定性がさらに検証されました。したがって、このアプローチは、プラズモニックナノ粒子の操作および溶液中の分析物分子のSERS検出に信頼性があります。

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図1:光ピンセット結合ラマン分光プラットフォームの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:SERS測定のための AgNPの調製。 (A)AgNPのSEM画像。(B) DLSによるAgNPのサイズ分布 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:AgNPとDSNBの相互作用。 (A)AgNP表面上のDSNBコーティングの概略図。(B)AgNPおよびAgNP-DSNBの紫外可視スペクトル。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:サンプルチャンバーの準備の概略図。 (a)サンプルチャンバーの準備プロセス。(B)試料室を用意した。スケールバー= 1 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:532 nmラマンレーザーと1064 nmトラップレーザーの位置の重なり。 (a) 532nmラマンレーザーの位置を白色スポットで示す。 (B) 1064nm捕集レーザーの位置を赤丸で示した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:プラズモニックAgNPアセンブリによって増強された分析物分子の典型的な SERSスペクトル。 (a)プラズモニックAgNPアセンブリ(赤)と分散AgNP(黒)におけるDSNBのSERSスペクトル。(B)トラップレーザーがオンのときのプラズモニックAgNPアセンブリは、顕微鏡の視覚化の下でダークスポットを示します。(C)トラップレーザーがオフのときの分散AgNP。 (D)AgNPアセンブリ形成のメカニズムの説明図。(E)捕集レーザーがない場合の濃度依存的なSERS強度。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:DSNBのSERSシグナルの再現性。 (a)プラズモニックAgNPアセンブリでのDSNBの20のSERSスペクトルを実験で繰り返し記録した。(B)1152 cm-1(RSD = 6.88%)、1444 cm-1(RSD = 6.59%)、および1579 cm-1(RSD = 5.48%)における特徴的なDSNBピークの強度のヒストグラム。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図8:異なる実験パラメータで生成されたAgNPアセンブリ 。 (A)異なるトラッピングレーザー出力。照射時間は20秒、AgNP濃度は0.05nMであった。(B)異なる照射時間;トラップレーザー出力700mW、AgNP濃度0.05nM。(C)異なるAgNP濃度;照射時間20秒、捕捉レーザー出力700mW。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:捕集レーザーをオフにしたときの時系列でのAgNPアセンブリの顕微鏡カメラ画像。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

本研究では、 in situ 分子特性評価のための光学トラップとSERS検出を組み合わせた分析プラットフォームを報告します。532 nmのラマンプローブビームをステレオ二重層経路を介して1064 nmのトラップレーザービームと組み合わせて、後方散乱形状における追加の分光測定のためにフォーカスとコレクトを組み合わせました。トラップレーザービームはAgNPを組み立ててプラズモニックホットスポットを形成し、続いてラマンプローブレーザービームを励起して溶液中の分析物分子のSERS信号を生成します。概念実証として、AgNPの表面にコーティングされたDSNBの検出が実証されました。トラッピングレーザ光によって制御されるAgNPアセンブリ領域では、周囲の分散AgNPと比較してDSNBの信号の約50倍の増強が達成された。提示されたプラットフォームでの溶液相SERS測定における分析物分子の同様の高シグナル増幅が再現性よく得られた。

SERS信号増幅に影響を与える重要なステップは、光トラッピング誘発AgNPアセンブリを形成することです。分析種分子のSERS信号は、トラップレーザー出力、照射時間、AgNP濃度などの実験パラメータを微調整することで最適化できます。 図8に示すように、より高いトラップレーザー出力を使用すると、AgNPアセンブリ形成の効率を高めることができます。再現可能なAgNPアセンブリは、トラッピングレーザーの出力を450 mWから700 mWに増やすことによって得られました。しかしながら、950mWより高いトラップレーザ出力は、過熱および気泡発生を誘発する可能性がある38。したがって、動的なAgNPアセンブリを作成するには、適度なトラッピングレーザー出力が推奨されます。同様に、より長い照射時間は、AgNP集合体の形成を促進するために有用である。 図8B は、照射時間が5〜20秒から増加したときに透明な球状のAgNP集合体が形成されたことを示す。しかし、AgNPアセンブリは60秒の照射後に歪んだ。さらに、 図8Cに示すように、AgNPアセンブリの形成は0.01 nMから0.05 nMのより高いAgNP濃度で加速されましたが、0.25 nMで急速に過熱しました。明らかなAgNPアセンブリの形成がない場合は、トラップレーザー出力と照射時間を増やすことをお勧めします。安定したAgNPアセンブリを生成したら、潜在的な熱損傷を避けるために、トラッピングレーザーをオフにする必要があります。

光トラップ誘起AgNPアセンブリのSERS活性は、 図6Bのダークスポットであるトラッピングレーザー照射領域における局所AgNP濃度の増加に起因した。流体AgNP溶液では、光トラップはAgNPを連続的に引き付けて蓄積し、粒子間接合の限られたスペースにプラズモニックホットスポットを形成することができます。これにより、SERS効果を高める電界が強化されます。 図6Eに示すように、トラッピングレーザーなしでより低いAgNP濃度(0.05nM)で取得された弱いSERS信号と比較して、より高いAgNP濃度(1.00nM)で得られたより強いSERS信号によってさらに検証されました。

さらに、溶液中のプラズモニックAgNPアセンブリの位置制御は、ブラウン運動に対して、光学トラップによって、SERS測定の効率および安定性を著しく改善した。マイクロ流体システムに接続すると、ハイスループットセンシングを行うことができます。SERS活性基質を生成するためのナノ粒子の従来の塩誘導凝集と比較して、私たちのプラットフォームは、設計された場所と瞬間に、高い柔軟性でプラズモニックAgNPアセンブリの動的形成を可能にします26,28。さらに、ナノモルのAgNP濃度で効率的に機能し、溶液中のin situ分光測定のためのSERS活性ホットスポットの時空間操作を可能にします。この動的AgNPアセンブリは、トラッピングレーザーをオフにすると、数分で徐々に分解されました。トラップレーザーがない場合、補足図1に示すように、AgNPアセンブリは20分でほぼ消失しました。これにより、検出システムへの影響を最小限に抑えることができ、さまざまなバイオアプリケーション、特に生理学的およびin vivo条件下での生体分子(DNA、RNA、およびタンパク質)の検出に大きな可能性を示します。しかしながら、この動的AgNP集合体は、塩誘導性AgNP集合体2よりも小さい増強係数を提供するため、さらなる改変および開発が必要である。

結論として、光トラップとSERS検出の統合は、プラズモニックナノ粒子を制御し、再現性のあるSERSシグナル増強を達成して、高効率、安定性、および生体適合性を備えた溶液中の分析物分子を検出するための便利な方法を提供します。

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

我々は、深セン市の科学技術イノベーション委員会からの資金援助を認める(No.JCYJ20180306174930894)、中山市科学技術局(2020AG003)、および香港研究助成評議会(プロジェクト26303018)。我々はまた、Che Chi-Ming Professorと、中華人民共和国香港特別行政区イノベーション技術委員会が立ち上げたHealth@InnoHKプログラムの下での「合成化学およびケミカルバイオロジー研究所」からの彼の資金援助に感謝する。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1064 nm trapping laserIPG Photonics, United States1064 nm CW Yb fiber laser, 10W
3,3'-Dithiobis[6-nitrobenzoic acid] bis(succinimide) ester Biosynth CarbosynthFD15467
532 nm Raman excitation sourceCNI, ChinaMLL-III-532
Bluelake softwareLUMICKS, Netherlandsversion 1.6.12optical tweezer control software
Frame tapeThermo Fisher Scientific, IncAB-0576
Immersion oilCargille Laboratories, Inc16482
Liquid nitrogen-cooled charge-coupled device (CCD) cameraTeledyn Princeton Instrument, United States400B eXcelon
Long-pass dichroic mirrorAHF, GermanyF48-801
Magnetic laser safety screenThorLabsTPSM2
Optical tweezer microscopeLUMICKS, Netherlandsm-trap
Silver nitrateSigma-Aldrich China, Inc.S8157
SpectrometerTeledyn Princeton Instrument, United StatesIsoPlane SCT-320
Trisodium citrateSigma-Aldrich China, Inc.S4641
WinSpec softwareTeledyn Princeton Instrument, United Statesversion 2.6.24.0spectrum software

参考文献

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