Differenzierte Mausadipozyten in Primärkultur: ein Modell der Insulinresistenz

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Präadipozyten der Maus aus subkutanem Fett, ihre Differenzierung in reife Adipozyten und die Induktion einer Insulinresistenz. Die Insulinwirkung wird durch die Phosphorylierung/Aktivierung von Mitgliedern des Insulin-Signalwegs durch Western Blot bewertet. Diese Methode ermöglicht die direkte Bestimmung der Insulinresistenz/-sensitivität in primären Adipozyten.

Zusammenfassung

Insulinresistenz ist eine verminderte Wirkung von Insulin auf seine Zielzellen, die in der Regel auf eine verminderte Signalübertragung der Insulinrezeptoren zurückzuführen ist. Insulinresistenz trägt zur Entwicklung von Typ-2-Diabetes (T2D) und anderen durch Fettleibigkeit verursachten Krankheiten mit hoher Prävalenz weltweit bei. Daher ist es von großer Relevanz, die Mechanismen zu verstehen, die der Insulinresistenz zugrunde liegen. Mehrere Modelle wurden verwendet, um die Insulinresistenz sowohl in vivo als auch in vitro zu untersuchen. Primäre Adipozyten stellen eine attraktive Option dar, um die Mechanismen der Insulinresistenz zu untersuchen und Moleküle zu identifizieren, die diesem Zustand entgegenwirken, sowie die molekularen Ziele von insulinsensibilisierenden Medikamenten. In dieser Arbeit haben wir ein Insulinresistenzmodell mit primären Adipozyten in Kulturen etabliert, die mit Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) behandelt wurden.

Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs), die aus Kollagenase-verdautem subkutanem Fettgewebe der Maus mittels Magnetzelltrennungstechnologie isoliert wurden, werden in primäre Adipozyten differenziert. Die Insulinresistenz wird dann durch die Behandlung mit TNF-α induziert, einem proinflammatorischen Zytokin, das die Tyrosinphosphorylierung/-aktivierung von Mitgliedern der Insulinsignalkaskade reduziert. Die verminderte Phosphorylierung des Insulinrezeptors (IR), des Insulinrezeptorsubstrats (IRS-1) und der Proteinkinase B (AKT) wird mittels Western Blot quantifiziert. Diese Methode bietet ein hervorragendes Werkzeug, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Insulinresistenz im Fettgewebe vermitteln.

Einleitung

Insulin ist ein anaboles Hormon, das von den β-Zellen der Pankreasinsel produziert wird und der Schlüsselregulator des Glukose- und Fettstoffwechsels ist. Insulin reguliert unter anderem die Glukoseaufnahme, die Glykogensynthese, die Gluconeogenese, die Proteinsynthese, die Lipogenese und die Lipolyse¹. Das erste molekulare Signal nach der Interaktion von Insulin mit seinem Rezeptor (IR) ist die Aktivierung der intrinsischen Tyrosinkinase-Aktivität von IR², was zu seiner Autophosphorylierung³ und der anschließenden Aktivierung einer Familie von Proteinen führt, die als Insulinrezeptorsubstrate (IRS) bekannt sind und an Adapterproteine binden, was zur Aktivierung einer Kaskade von Proteinkinasen^{führt 4} . Insulin aktiviert zwei Hauptsignalwege: die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)-Proteinkinase B (AKT) und die Ras-Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK). Ersterer stellt einen wichtigen Verzweigungspunkt oder Knoten ^4,5 für die Aktivierung zahlreicher nachgeschalteter Effektoren dar, die an verschiedenen physiologischen Funktionen beteiligt sind, einschließlich der Regulation der Brennstoffhomöostase, während letzterer das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung reguliert ^4,6. Die Insulinwirkung hängt letztendlich vom Zelltyp und dem physiologischen Kontext ab⁷.

Eines der wichtigsten insulinempfindlichen Stoffwechselgewebe ist das Fettgewebe. Weißes Fettgewebe ist die am häufigsten vorkommende Art von Fett bei Menschen und Nagetieren, verteilt in subkutanem Fett (zwischen Haut und Muskeln) und viszeralem Fett (um die Organe in der Bauchhöhle). Aufgrund ihres großen Volumens sind Adipozyten oder Fettzellen der am häufigsten vorkommende Zelltyp im Fettgewebe. Diese Fettzellen können braun/beige (thermogen), rosa (in der Brustdrüse) und weiß sein ^8,9. Weiße Adipozyten halten die wichtigsten Energiereserven im Körper in Form von Triglyceriden, einem insulinabhängigen Prozess. Insulin fördert den Glukosetransport und die Lipogenese, während es die Lipolyse oder den Lipidabbau hemmt ^7,10. Es erleichtert auch die Differenzierung von Präadipozyten in Adipozyten – die reifen fettspeichernden Zellen¹¹.

Eine Insulinresistenz tritt auf, wenn ein normaler Insulinspiegel eine abgeschwächte biologische Reaktion hervorruft, was zu einer kompensatorischen Hyperinsulinämie führt¹². Insulinresistenz ist eine Erkrankung, die mit Übergewicht und Adipositas einhergeht⁵ und in Kombination zu Typ-2-Diabetes (T2D) und anderen Stoffwechselerkrankungen führt¹³. Hyperinsulinämie kompensiert die Insulinresistenz im peripheren Gewebe, um einen normalen Blutzuckerspiegel aufrechtzuerhalten¹⁴. Ein eventueller Verlust oder eine Erschöpfung β Zellen führt jedoch zusammen mit einer verschlimmerten Insulinresistenz zu erhöhten Blutzuckerspiegeln, die mit T2D⁵ übereinstimmen. Daher können Insulinresistenz und Hyperinsulinämie zur Entwicklung von Adipositas-bedingten Stoffwechselerkrankungen beitragen¹⁵. Darüber hinaus kann Adipositas eine chronische, niedriggradige lokale Entzündung verursachen, die die Insulinresistenz im Fettgewebe fördert^15,16,17. Darüber hinaus führen durch Fettleibigkeit verursachte Veränderungen des Fettgewebes, wie z. B. Fibrose, Entzündungen und eine verminderte Angiogenese und Adipogenese, zu niedrigeren Adiponektin-Serumspiegeln (einem Insulinsensibilisator) und einer erhöhten Sekretion von Faktoren wie dem Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1), freien Fettsäuren und Exosomen in den Blutkreislauf, was die Insulinresistenz verschlimmert¹⁷.

Viele Aspekte, die der Insulinresistenz zugrunde liegen, sind noch unbekannt. In-vitro- und In-vivo-Modelle wurden entwickelt, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Insulinresistenz in wichtigen Zielgeweben, einschließlich des Fettgewebes, vermitteln. Der Vorteil von In-vitro-Modellen besteht darin, dass die Forscher die Umweltbedingungen besser kontrollieren und die Insulinresistenz in bestimmten Zelltypen beurteilen können. Insbesondere Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs) weisen den individuellen Phänotyp des Spendergewebes auf, der die Physiologie besser widerspiegeln könnte als Adipozyten-Zelllinien. Ein Hauptfaktor, der die Insulinresistenz in vitro induziert, ist der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α). TNF-α ist ein proinflammatorisches Zytokin, das von Adipozyten und Makrophagen im Fettgewebe sezerniert^{wird 18}. Während es für den korrekten Umbau und die Expansion des Fettgewebes erforderlich ist¹⁹, induziert eine langfristige Exposition gegenüber TNF-α eine Insulinresistenz im Fettgewebe in vivo und in Adipozyten in vitro²⁰. Die chronische TNF-α-Behandlung verschiedener Zelltypen führt zu einer erhöhten Serinphosphorylierung sowohl von IR als auch von IRS-1, wodurch eine verminderte Tyrosinphosphorylierung gefördert^{wird 21}. Eine erhöhte Phosphorylierung von IRS-1 auf Serinresten hemmt die Aktivität der IR-Tyrosinkinase und könnte einer der Schlüsselmechanismen sein, durch die eine chronische TNF-α-Behandlung die Insulinwirkung beeinträchtigt^22,23. TNF-α aktiviert Signalwege, die den Serin/Threonin-Kinase-Inhibitor der nukleären Faktor-ĸB-Kinase β (IKKβ) und der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK) ^betreffen24. JNK induziert ein komplexes proinflammatorisches Transkriptionsprogramm, phosphoryliert aber auch direkt IRS-1⁶.

Das Verständnis der Pathogenese der Insulinresistenz wird immer wichtiger, um die Entwicklung zukünftiger Therapien gegen T2D zu steuern. APCs haben sich als hervorragendes Modell für die Untersuchung der Fettzellbiologie, einschließlich der Sensitivität und Resistenz gegenüber Insulin, und für die Identifizierung der intrinsischen Eigenschaften von Adipozyten unabhängig von der systemischen Umgebung erwiesen. APCs können leicht aus verschiedenen Fettdepots gewonnen und unter geeigneten Bedingungen in reife Adipozyten differenziert werden. Mit dieser Methode können direkte Effekte auf die Insulinresistenz/-sensitivität in Adipozyten untersucht werden.

Protokoll

Alle Nagetierexperimente wurden von der Bioethikkommission des Instituts für Neurobiologie der UNAM, Protokollnummer 075, genehmigt.

1. Isolierung von Adipozyten-Vorläuferzellen der Maus

1. 8-10 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse einschläfern (z. B. durch CO₂ -Inhalation und anschließende Zervixluxation) (vier Tiere pro Isolierung). Desinfizieren Sie die Mäuse durch Einreiben mit 70%igem Ethanol und erhalten Sie das Fettgewebe sofort nach der Opferung.
   Anmerkungen: Isolieren Sie nach der Euthanasie von Nagetieren sofort das Fettgewebe und führen Sie alle Schritte in einer sterilen Laminar-Flow-Haube durch. Mäuse werden unter 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten.
2. Präparieren Sie das inguinale subkutane Fettgewebe jeder Maus. Entfernen Sie nur das Fettgewebe, vermeiden Sie die Entfernung von Muskeln, Haut oder anderem Gewebe und sammeln Sie es in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit 15 ml Kollagenaselösung Typ 1 (1,5 mg/ml) auf Eis. Lösen Sie Typ-1-Kollagenase in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glukose-1%-Kälberserumalbumin (BSA) auf und filtrieren Sie durch 0,2-μm-Spritzenvorsatzfilter.
3. Schneiden Sie das Fettgewebe mit einer sterilen chirurgischen Schere in kleine Stücke und verdauen Sie die Proben durch Inkubation mit Kollagenaselösung Typ 1 bei 37 °C in einem Orbitalschüttler (150 U/min) für 30 min (legen Sie das Röhrchen mit Fett und Kollagenase in eine horizontale Position, um eine größere Schüttelfläche zu erhalten). Überprüfen Sie die Verdauung alle 10 Minuten, um sicherzustellen, dass sie funktioniert (Gewebeabbau ist sichtbar) und um eine Überverdauung zu verhindern (siehe ergänzende Abbildung S1).
4. Filtern Sie mit einer 200-μm-Netzspritze (zuvor autoklaviert), um Gewebe zu entfernen, das nicht mit Kollagenase verdaut wurde. Führen Sie den Filter über den Rand des Röhrchens, um so viele Zellen wie möglich in die Lösung zu entleeren. Fügen Sie 15 ml kaltes DMEM-1% BSA hinzu, um den Aufschluss zu stoppen, und zentrifugieren Sie bei 400 × g für 10 min bei 4 °C.
5. Saugen Sie die oberste Schicht mit reifen Adipozyten und den größten Teil der Flüssigkeitsschicht ab. Vermeiden Sie es, das Pellet zu berühren oder zu stören. Fügen Sie 20 ml kalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) - 2 % fötales Kälberserum (FBS) hinzu und resuspendieren Sie das Pellet. Bei 400 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
6. Entfernen Sie den Überstand und saugen Sie zuerst die obere Schicht ab, um die verbleibenden Adipozyten und das Fett zu entfernen. Das Pellet wird in 1 ml Ammoniumchlorid-Kalium-Lysepuffer (ACK) (zur Lyse der roten Blutkörperchen) resuspendiert und 5 Minuten lang auf Eis inkubiert. 10 ml PBS-2% FBS zugeben, mischen und bei 400 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
7. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl Anti-Fc-Lösung (gereinigtes Anti-Maus-CD16/CD32 der Ratte, verdünnt in PBS-2% FBS [1:150]), um die Fc-Rezeptor-vermittelte Bindung durch interessierende Antikörper zu reduzieren. 5 Minuten auf Eis inkubieren. Die Zellsuspension wird in ein 5-ml-Röhrchen überführt, das in die vorgekühlten Racks eines Magnetzellenseparators passt, und bei 400 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
8. Den Überstand entfernen, 200 μl der Mischung aus monoklonalem CD31(PECAM-1)-Antikörper (390)-Biotin (1:100) und monoklonalem CD45-Antikörper (30-F11)-Biotin (1:100) zugeben, gut mischen und 15 min auf Eis inkubieren (Antikörperverdünnungen in Anti-Fc-Lösung vorbereiten; siehe Tabelle 1). 400 μl PBS-2% FBS zugeben und bei 400 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
   HINWEIS: CD31 und CD45 sind Marker von Endothelzellen bzw. hämatopoetischen Zellen.
9. Den Überstand absaugen und in 100 μl Anti-Biotin-Mikrokügelchen (1:5) 15 min auf Eis inkubieren (Antikörperverdünnungen in Anti-Fc-Lösung vorbereiten, siehe Tabelle 1). 400 μl PBS-2% FBS zugeben und bei 400 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
10. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 350 μl PBS-2% FBS. Entfernen Sie Zellaggregate oder große Partikel mit einem Vorzerlegungsfilter (70 μm) aus den Einzelzellsuspensionen. Aktivieren Sie zuerst den Filter mit 100 μl PBS-2% FBS, führen Sie die Zellsuspension durch den Filter (sammeln Sie sie in einem sauberen Röhrchen) und waschen Sie den Filter schließlich mit 100 μl PBS-2% FBS.
11. Führen Sie die magnetische Trennung von Zellen mit der negativen Trennstrategie mit einem magnetischen Zellseparator durch.
    1. Platzieren Sie die Probe in Position A des Kühlracks (stellen Sie sicher, dass das Rack vorgekühlt ist) und zwei leere Röhrchen in Position B und C, um die nicht markierten bzw. markierten Zellen zu gewinnen.
    2. Füllen Sie den Waschpuffer und den Laufpuffer in die entsprechenden Flaschen, bevor Sie das Gerät einschalten. Programmieren Sie das Gerät so, dass es die magnetische Trennung von Zellen mit dem DEPLETE-Protokoll durchführt.
       HINWEIS: Dieses Protokoll ist für die Depletion im Standardmodus zur Entfernung von Zellen mit normaler Antigenexpression (in diesem Fall Zellen, die mit anti-CD31 und anti-CD45 markiert sind) vorgesehen, wenn die Wiederherstellung die höchste Priorität hat.
    3. Wählen Sie im Abschnitt "Trennung" die Anzahl der zu trennenden Proben aus und wählen Sie das DEPLETE-Protokoll aus. Drücken Sie auf Ausführen und starten Sie die Trennung. Am Ende des Programms werden die unmarkierten Zellen zurückgewonnen und bei 400 × g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert.
12. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl Wachstumsmedium (Tabelle 1).
13. Die APCs werden in einer Vertiefung einer 12-Well-Platte ausgesät, die zuvor mit einer 2,5-prozentigen Basalmembranmatrix beschichtet wurde (es werden ca. 50.000 bis 75.000 Zellen gewonnen). Fügen Sie 400 μl 2,5 % Basalmembranmatrix hinzu, um die gesamte Oberfläche jeder Vertiefung abzudecken. Lassen Sie die Platte unmittelbar nach dem Entfernen der überschüssigen Lösung und nur einer kleinen Schicht (ohne Deckel) mindestens 1 Stunde lang in der Laminar-Flow-Haube trocknen. Inkubieren bei 37 °C in einer 5%igen CO₂ -Atmosphäre. Wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben.
14. Bei einer Konfluenz von 80 % das Medium vollständig entfernen und mit 350 μl PBS-2 % FBS waschen. Die Zellen werden mit 350 μl 0,05%igem Trypsin-EDTA für 2 min bei 37 °C geerntet. Fügen Sie 2 ml Wachstumsmedium hinzu und sammeln Sie die Zellen in einem neuen konischen 50-ml-Röhrchen, dann zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 400 × g .
15. Passage der APCs zu 12-Well-Platten (10.000-20.000 Zellen pro Well), die zuvor mit einer 2,5%igen Basalmembranmatrix beschichtet wurden. Inkubieren bei 37 °C mit 5% CO₂. Wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben.
    HINWEIS: Schützenpanzer können einmal durchgelassen werden. In der Folge verlieren sie ihre Fähigkeit, sich zu vermehren und zu differenzieren. Sehen Sie sich den Workflow für den APC-Isolationsprozess in der ergänzenden Abbildung S2 an.

2. Adipozytendifferenzierung und Induktion der Insulinresistenz

HINWEIS: Halten Sie die Zellen bei 37 °C in 5% CO₂ und führen Sie Schritte durch, die einen Medienwechsel und Behandlungen mit TNF-α und Insulin in einer sterilen Haube umfassen.

1. Beginnen Sie bei 80 % Konfluenz mit dem Differenzierungsprozess. Saugen Sie ein beliebiges Nährmedium ab und ersetzen Sie es durch 500 μl Differenzierungsmedium (Tabelle 1), das in jeder Vertiefung 3,3 nM knochenmorphogenetisches Protein (BMP4) enthält.
2. Nach 48 h wird das Medium durch das Differenzierungsmedium (500 μl pro Well) und den Differenzierungscocktail ersetzt (Tabelle 1).
3. Entfernen Sie das Medium 72 h später und geben Sie 100 nM Insulin in 500 μl frisches Differenzierungsmedium.
   Anmerkungen: Die Zellen beginnen ein rundes Aussehen mit kleinen Lipidtröpfchen im Inneren zu zeigen.
4. Saugen Sie ein beliebiges Differenzierungsmedium ab und ersetzen Sie es 48 h später durch 500 μl einfaches Medium-2% FBS (Tabelle 1). Induzieren Sie eine Insulinresistenz mit 4 ng/ml TNF-α. Kontrollvertiefungen ohne TNF-α-Behandlung.
5. Nach 24 h Inkubation werden 4 ng/ml TNF-α in einfachem mittel-0%igem FBS zugegeben (Tabelle 1). Aufrechterhaltung der Kontrollbrunnen ohne TNF-α-Behandlung.
6. 24 h später wird der Insulin-Signalweg durch Zugabe von 100 nM Insulin aktiviert und 15 min bei 37 °C in einer 5%igen CO₂ -Atmosphäre inkubiert. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es mit 500 μl PBS. Integrieren Sie Kontrollvertiefungen ohne Insulinbehandlung.

3. Evaluierung des Insulin-Signalwegs mittels Western Blot

1. Proteinextraktion und -quantifizierung
   1. Waschen Sie jede Vertiefung der Zellen mit 500 μl PBS und lassen Sie sie auf Eis, um die Zellen in 50 μl RIPA-Puffer (Tabelle 1) zu lysieren, der 1 % Protease-Inhibitor-Cocktail enthält, der kurz vor der Probenisolierung hinzugefügt wurde. Kratzen Sie die gesamte Oberfläche der Vertiefung mit einer Spitze ab und übertragen Sie das Lysat in ein 0,6-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (auf Eis aufbewahren).
   2. 1 h bei 4 °C in einem rotierenden Schüttler inkubieren, durch Vortexen mischen und bei 8.000 × g 15 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand zurückgewinnen (auf Eis aufbewahren).
   3. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay (verdünnen Sie die Probe nicht, um sie zu quantifizieren).
   4. Das erforderliche Volumen entsprechend 40-60 μg entnehmen und mit 6x Laemmli-Puffer (Tabelle 1) denaturieren, indem bei 97 °C für 15 min unter Schütteln mit 550 U/min inkubiert wird. Bis zur Verwendung einfrieren.
2. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
   1. Führen Sie eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit einem 7,5%igen Polyacrylamid-Gel mit einer Dicke von 1,5 mm durch. Geben Sie das Gel in den Tank und füllen Sie es mit laufendem Puffer (Tabelle 1).
   2. Geben Sie 3 μl vorgefärbten Proteinstandard in die erste Vertiefung des Gels und laden Sie jede Probe in nachfolgende Vertiefungen.
   3. Lassen Sie das Gel ca. 15 Minuten lang bei 80 V laufen, um sicherzustellen, dass die Probe in die Gelmatrix des Polyacrylamidkonzentrators gelangt. Danach erhöhen Sie die Spannung für 2,5 h auf 90 V oder bis der 37 kDa Molekulargewichtsmarker am unteren Rand des Gels zu sehen ist.
   4. Übertragen Sie die Proteine aus dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran in einer halbtrockenen Kammer für 35 Minuten bei 25 V. Tauchen Sie zuvor das Gel, die Membran und die Filter für einige Minuten in Transferpuffer (Tabelle 1).
3. Westlicher Fleck
   1. Nach dem Transfer wird die Membran mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit 0,1 % Tween 20 (TBS-T 0,1 %) (Tabelle 1) 3 Minuten lang unter Schütteln bei 30 U/min gewaschen.
   2. Blockieren Sie die Membran mit Blockierlösung (Tabelle 1) bei 4 °C für 1 h in konstanter Rotation.
   3. Schneiden Sie die Membran entsprechend dem Molekulargewichtsmarker in drei Teile, um über Nacht mit verschiedenen Primärantikörpern (verdünnt in Blockierungslösung) bei 4 °C in konstanter Rotation zu inkubieren: Phospho-IRS1 (Tyr608)-Antikörper (1:1.000), erwartete Bande bei 180 kDa; Phospho-Insulinrezeptor-β Antikörper (Tyr1150/1151) (1:1.000), erwartete Bande bei 95 kDa; Phospho-Akt (Ser473)-Antikörper (1:1.000), erwartete Bande bei 60 kDa.
   4. Waschen Sie die Membranen 5x für je 5 min mit TBS-T 0,1%.
   5. Inkubieren Sie die Membranen mit dem entsprechenden Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper (verdünnt in Blockierlösung) für 2 h bei Raumtemperatur in ständiger Rotation: Peroxidase affiniPure donkey anti-rabbit IgG (H+L) (1:5.000).
   6. Waschen Sie die Membranen 5x für je 5 min mit TBS-T 0,1%.
   7. Weisen Sie die Proteine mit dem Chemilumineszenz-Detektionssystem nach. Bereiten Sie den Untergrund gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
   8. Legen Sie den Blot in eine Plastiktüte und fügen Sie 200 μl chemilumineszierendes Substrat hinzu, um die Membran vollständig zu bedecken. Überschüssiges Substrat abtropfen lassen und alle Luftblasen entfernen.
   9. Belichten Sie jeden Blot für 30-60 s in einem leistungsstarken Bildgebungssystem, das mit Chemilumineszenz kompatibel ist.
   10. Entfernen Sie die Membranen (Schritte 10-13 des Western-Blot-Abschnitts), um die Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen zu unterbrechen und so die Nitrozellulosemembranen erneut zu blotten. Erholen Sie die Membranen und waschen Sie sie 3x für je 5 min mit TBS-T 1% bei 50 U/min.
   11. 7 min mit 10 ml 0,2 M NaOH bei 50 U/min inkubieren.
   12. 3x für je 5 min mit Leitungswasser bei 50 U/min waschen.
   13. 10 min mit TBS-T 1% bei 50 U/min waschen.
   14. Wiederholen Sie die Schritte 2-9 des Western-Blot-Abschnitts, um die Membran mit Anti-Beta-Tubulin (55 kDa) als Beladungskontrolle mit einer Verdünnung von 1:1.000 zu inkubieren.
   15. Führen Sie eine densitometrische Analyse²⁵ für jedes Protein mit der ImageJ-Software (https://imagej.nih.gov/) durch.

Ergebnisse

Die zunehmende Prävalenz von Adipositas und T2D hat in den letzten Jahren zu einer intensiven Suche nach den Mechanismen geführt, die die Insulinresistenz im Fettgewebe vermitteln. Mit dem hier beschriebenen Protokoll können APCs in reife Adipozyten differenziert werden, um die Insulinresistenz und -sensitivität zu bewerten. Sobald die APCs die Konfluenz erreicht haben, dauert es 10 Tage, bis ihre Differenzierung in reife Adipozyten und ihre TNF-α-vermittelte Induktion der Insulinresistenz abgeschlossen sind (

Diskussion

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Untersuchung der Insulinresistenz vorgestellt, bei der primäre Adipozyten in Kulturen verwendet werden, die mit TNF-α behandelt wurden. Dieses Modell hat den Vorteil, dass primäre Adipozyten unter definierten Bedingungen über lange Zeiträume mit einer strengen Kontrolle zellulärer Umweltfaktoren kultiviert werden können²⁶. Die Testdauer beträgt 15-20 Tage, obwohl es zwischen den Experimenten zu Abweichungen im Prozentsatz der differenzierten Adipozyte...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer	LONZA	10-548E
Anti-Biotin Microbeads	Miltenyi	130-090-485
Anti-CD31	eBioscience	13-0311-85
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi
Basement membrane matrix (matrigel)	Corning	354234
bFGF	Sigma	F0291	Growth factor
BSA	Equitech-Bio, Inc.	BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin	eBioscience	13-0451-85
Collagenase, Type 1	Worthington Biochem	LS004197
Dexamethasone	Sigma	D1756
DMEM	GIBCO	12800017
DMEM low glucose	GIBCO	31600-034
EGF	Peprotech	315-09	Growth factor
FBS	GIBCO	26140-079
ITS mix	Sigma	I3146
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960
LIF	Millipore	ESG1107	Growth factor
Linoleic acid-albumin	Sigma	L9530
MCDB 201 medium	Sigma	M6770
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
PDGF-BB	Peprotech	315-18	Growth factor
Peniciline-Streptomycine	BioWest	L0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm)	Miltenyi	130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32	BD Pharmingen	553142
Trypsin-EDTA	GIBCO	25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]	Sigma	I5879	Differentiation cocktail
BMP4	R&D Systems	5020-BP-010	Differentiation cocktail
Dexamethasone	Sigma	D1756	Differentiation cocktail
Insulin	Sigma	I9278
Rosiglitazone	Cayman	71742	Differentiation cocktail
TNFα	R&D Systems	210-TA-005
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibody	Abcam	ab6046
Bromophenol blue	BioRad	161-0404	Laemmli buffer
EDTA	Sigma	E5134	RIPA buffer
EGTA	Sigma	E4378	RIPA buffer
FluorChem E system	ProteinSimple
Glycerol	Sigma	G6279	Laemmli buffer
Glycine	Sigma	G7126	Running and Transfer buffer
Igepal	Sigma	I3021	RIPA buffer
2- mercaptoethanol	Sigma	M3148	Laemmli buffer
Methanol	JT Baker	907007	Transfer buffer
NaCl	JT Baker	3624-05	TBS-T
NaF	Sigma	77F-0379	RIPA buffer
NaOH	JT Baker	3722-19
Na4P2O7	Sigma	114F-0762	RIPA buffer
Na3VO4	Sigma	S6508	RIPA buffer
Nitrocellulose membrane	BioRad	1620112
Nonfat dry milk	BioRad	1706404	Blocking solution
Prestained protein standard	BioRad	1610395
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β	Cell signaling	3024
Phospho-Akt (Ser473) Antibody	Cell signaling	9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody	Millipore	9432
Saccharose	JT Baker	407205	RIPA buffer
SDS	BioRad	1610302	Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34577
Tris-base	Promega	H5135	Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HCl	JT Baker	4103-02	RIPA buffer - TBS
Tween 20	Sigma	P1379	TBS-T