АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Желудочно-кишечный тракт является одним из наиболее чувствительных органов к травмам при радиотерапевтическом лечении рака. Это одновременно система органов с одной из самых высоких регенеративных способностей после таких инсультов. Представленный протокол описывает эффективный метод исследования регенеративной способности кишечного эпителия.

Аннотация

Кишечный эпителий состоит из одного слоя клеток, но содержит несколько типов терминально дифференцированных клеток, которые образуются в результате активной пролиферации кишечных стволовых клеток, расположенных на дне кишечных крипт. Однако во время острого повреждения кишечника эти активные кишечные стволовые клетки подвергаются клеточной гибели. Гамма-облучение является широко используемым методом лечения колоректального рака, который, хотя и является терапевтически эффективным, имеет побочный эффект истощения активного пула стволовых клеток. Действительно, пациенты часто испытывают желудочно-кишечный лучевой синдром во время лучевой терапии, отчасти из-за активного истощения стволовых клеток. Потеря активных кишечных стволовых клеток в кишечных криптах активирует пул обычно спокойных резервных стволовых клеток кишечника и индуцирует дедифференцировку секреторных и энтероцитарных клеток-предшественников. Если бы не эти клетки, кишечный эпителий не смог бы восстановиться после лучевой терапии и других подобных серьезных повреждений тканей. Новые достижения в технологиях отслеживания линий позволяют отслеживать активацию, дифференцировку и миграцию клеток во время регенерации и успешно используются для изучения этого в кишечнике. Это исследование направлено на то, чтобы изобразить метод анализа клеток кишечного эпителия мыши после лучевого поражения.

Введение

Кишечный эпителий человека покрывал бы примерно половину площадки для бадминтона, если бы он былполностью плоским1. Вместо этого этот одноклеточный слой, отделяющий людей от содержимого их кишечника, уплотняется в серию пальцевидных выступов, ворсинок и углублений, крипт, которые максимизируют площадь поверхности кишечника. Клетки эпителия дифференцируются по оси крипты-ворсинки. Ворсинки в основном состоят из поглощающих питательные вещества энтероцитов, бокаловидных клеток, секретирующих слизь, и гормонопродуцирующих энтероэндокринных клеток, в то время как крипта в основном состоит из дефензин-продуцирующих клеток Панета, активных и резервных стволовых клеток и клеток-предшественников 2,3,4,5. Кроме того, двунаправленная связь этих клеток со стромальными и иммунными клетками нижележащего мезенхимального компартмента и микробиотой просвета создает сложную сеть взаимодействий, которая поддерживает гомеостаз кишечника и имеет решающее значение для восстановления после травмы 6,7,8.

Кишечный эпителий является наиболее быстро самообновляющейся тканью в организме человека, со скоростью обновления 2-6 дней 9,10,11. Во время гомеостаза активные стволовые клетки у основания кишечных крипт (столбчатые клетки крипты), отмеченные экспрессией богатого лейцином повторного рецептора, связанного с G-белком (LGR5), быстро делятся и обеспечивают клетки-предшественники, которые дифференцируются во все другие линии кишечного эпителия. Однако из-за высокой митотической скорости активные стволовые клетки и их непосредственные предшественники особенно чувствительны к поражению гамма-излучением и подвергаются апоптозу после облучения 5,12,13,14. При их потере резервные стволовые клетки и нестволовые клетки (субпопуляция предшественников и некоторых терминально дифференцированных клеток) в кишечных криптах подвергаются активации и пополняют базальный компартмент крипты, который затем может восстанавливать клеточные популяции ворсинок и, таким образом, регенерировать кишечный эпителий15. Используя методы отслеживания происхождения, несколько исследовательских групп продемонстрировали, что резервные (покоящиеся) стволовые клетки способны поддерживать регенерацию при потере активных стволовых клеток 13,16,17,18,19,20,21,22. Эти клетки характеризуются наличием онкогена 1-го белка поликомбного комплекса (Bmi1), гена обратной транскриптазы теломеразы мыши (mTert), гомеобокса хмеля (Hopx) и богатого лейцином гена повторного белка 1 (Lrig1). Кроме того, было показано, что нестволовые клетки способны пополнять кишечные крипты при повреждении 23,24,25,26,27,28,29,30,31. В частности, было показано, что предшественники секреторных клеток и энтероцитов подвергаются дедифференцировке при повреждении, возвращаются к стволовым клеткам и поддерживают регенерацию кишечного эпителия. Недавние исследования выявили клетки, экспрессирующие несколько маркеров, которые обладают способностью приобретать стволовые характеристики при травме (такие как DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Удивительно, но Yu et al. показали, что даже зрелые клетки Панета (LYZ+) могут способствовать регенерации кишечника37. Кроме того, помимо апоптоза эпителиальных клеток кишечника и нарушения функции эпителиального барьера, облучение приводит к дисбиозу кишечной флоры, активации иммунных клеток и инициации провоспалительного ответа, а также активации мезенхимальных и стромальных клеток38,39.

Гамма-излучение является ценным терапевтическим инструментом при лечении рака, особенно при колоректальных опухолях40. Однако облучение значительно влияет на гомеостаз кишечника, вызывая повреждение клеток, что приводит к апоптозу. Радиационное облучение вызывает множественные возмущения, которые замедляют выздоровление пациента и характеризуются повреждением слизистой оболочки и воспалением в острой фазе, а также диареей, недержанием мочи, кровотечением и болями в животе в течение длительного времени. Этот набор проявлений называется желудочно-кишечной радиационной токсичностью. Кроме того, радиационно-индуцированное прогрессирование трансмурального фиброза и/или склероза сосудов может проявиться только спустя годы после лечения38,41. Одновременно с самой травмой радиация вызывает реакцию восстановления в клетках кишечника, которая активирует сигнальные пути, ответственные за инициирование и организацию регенерации42. Радиационно-индуцированное заболевание тонкой кишки может возникать в результате лучевой терапии органов малого таза или брюшной полости, проводимых в других органах (таких как шейка матки, простата, поджелудочная железа, прямая кишка)41,43,44,45,46. Таким образом, поражение кишечника от облучения является серьезной клинической проблемой, и лучшее понимание патофизиологии, вероятно, будет способствовать разработке вмешательств для облегчения желудочно-кишечных осложнений, связанных с лучевой терапией. Существуют и другие методы, которые позволяют исследовать регенеративное назначение кишечного эпителия, помимо облучения. Были разработаны трансгенные и химические мышиные модели для изучения воспаления и последующей регенерации47. Декстран сульфат натрия (DSS) индуцирует воспаление в кишечнике и приводит к развитию характеристик, сходных с характеристиками воспалительного заболевания кишечника48. Комбинация лечения DSS проканцерогенным соединением азоксиметаном (ОСО) может привести к развитию рака, связанного с колитом48,49. Травма, вызванная ишемией, является еще одним методом, используемым для изучения регенеративного потенциала кишечного эпителия. Эта методика требует опыта и хирургических знаний50. Кроме того, вышеупомянутые методы вызывают различные виды повреждений, чем радиация, и могут привести к вовлечению различных механизмов регенерации. Кроме того, эти модели отнимают много времени, в то время как радиационная техника довольно короткая. В последнее время методы in vitro с использованием энтероидов и колоноидов, генерируемых из кишечника и толстой кишки, используются в сочетании с лучевым повреждением для изучения механизмов регенерации кишечника51,52. Однако эти методы не полностью повторяют орган, который они моделируют53,54.

Представленный протокол включает описание мышиной модели поражения гамма-излучением в сочетании с генетической моделью, которая после лечения тамоксифеном позволяет отслеживать линии, происходящие из резервной популяции стволовых клеток (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Эта модель использует облучение всего тела 12 Гр, которое вызывает достаточно значительное повреждение кишечника для активации резервных стволовых клеток, в то же время позволяя проводить последующее исследование регенеративной способности кишечника в течение 7 дней после травмы55.

протокол

Все мыши были размещены в Отделе лабораторных ресурсов животных (DLAR) в Университете Стоуни-Брук. Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Стоуни-Брук одобрил все исследования и процедуры с участием животных. Эксперименты с участием животных проводились строго в соответствии с утвержденным протоколом обращения с животными (IACUC #245094).

ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы мыши B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) и B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) были коммерчески получены (см. Таблицу материалов) и скрещены для получения Bmi1-Cre ER; Мыши Rosa26eYFP (Bmi1ctrl), как описано ранее56,57,58.

1. Корпус Bmi1-Cre ER; Мыши Rosa26 eYFP

  1. Держите мышей в помещении для животных при температуре от 68 до 72 ° F и влажности от 30 до 70%, в 12-часовом / 12-часовом светлом/темном цикле, с водой и нормальным кормом ad libitum.
  2. Перед экспериментами подтверждают генотипы мышей с помощью стандартной методики генотипирования ПЦР57,58.

2. Подготовка животных и материалов

  1. Переведите мышей в экспериментальную комнату для содержания не менее чем за 7 дней до любых экспериментов, чтобы дать мышам акклиматизироваться.
  2. Сопоставляйте экспериментальных и контрольных животных по полу и возрасту.
  3. Подвергните контрольных животных индуцированной тамоксифеном Cre-опосредованной рекомбинации, но не облучению (фиктивное лечение, 0 Гр), при этом убедитесь, что экспериментальные животные получают инъекцию тамоксифена и подвергаются гамма-облучению.
  4. Приготовьте раствор тамоксифена. Ресуспендировать порошок тамоксифена в стерильном кукурузном масле в концентрации 30 мг / мл. Обрабатывайте ультразвуком в течение 3 мин циклами 30 с ВКЛ и 30 с ВЫКЛ с амплитудой 60%, а затем вращайте в темноте в течение 1 ч при комнатной температуре (RT). Раствор тамоксифена можно замораживать при температуре −20 °C, но не замораживайте/размораживайте его более одного раза. Желательно каждый раз готовить свежий раствор и не хранить его.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тамоксифен чувствителен к свету. Оберните его оловянной фольгой во время вращения комнатной температуры.
    ВНИМАНИЕ: Тамоксифен является потенциально опасным веществом: опасностью для здоровья (GHS08) и окружающей среды (GHS09).
  5. Приготовьте исходный раствор 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU). Ресуспендировать порошок EdU в 1/5 от общего объема стерильного диметилсульфоксида (ДМСО) и медленно добавить оставшиеся 4/5 от общего объема стерильной сверхчистой воды. После полного растворения аликвотировать и хранить при температуре -20 °C.
    ВНИМАНИЕ: 5-этинил-2′-дезоксиуридин (EdU) и диметилсульфоксид (ДМСО) являются потенциально опасными веществами: опасность для здоровья (H340 и H631, а также H227, H315 и H319 соответственно). EdU может вызывать генетические дефекты и подозревается в повреждении фертильности или нерожденных детей, а DMSO может вызывать раздражение кожи и глаз.
  6. Подготовьте реагенты для сбора и фиксации тканей: разбавьте этанол для приготовления 70% водного раствора, охладите DPBS до 4 °C и приготовьте модифицированный фиксирующий буфер Буэна (50% этанол и 5% уксусная кислота в дистиллированном H2O) и 10% буферный формалин.
    ВНИМАНИЕ: Этиловый спирт является потенциально опасным веществом: опасен для здоровья (H225-H319), легко воспламеняется (GHS02) и вызывает острую токсичность (GHS07). Уксусная кислота является потенциально опасным веществом: опасным для здоровья (H226-H314), легковоспламеняющимся (GHS02) и коррозионным (GHS05). Формалин является потенциально опасным веществом: опасным для здоровья (H350, H315, H317, H318, H370) и коррозионным. Формалин может вызвать рак, раздражение кожи и глаз, повреждение органов и аллергические кожные реакции.
  7. Подготовьте оборудование, необходимое для эвтаназии в соответствии с утвержденным методом (например, камера CO2 ), набор для вскрытия мышей (ножницы, щипцы), чашки Петри, иглу для зонда 16 G, прикрепленную к шприцу объемом 10 мл для промывания кишечника, и гистологические кассеты.

3. Гамма-облучение всего тела (ЧМТ) и сбор тканей

  1. За два дня до облучения гамма-облучением вводите экспериментальным животным однократную дозу тамоксифена, чтобы вызвать Cre-опосредованную рекомбинацию и отслеживание клеточной линии BMI1 / EYFP + . Взвесьте каждое животное и рассчитайте дозу 40 мг/кг массы тела тамоксифена, ресуспендированного в кукурузном масле. Продезинфицируйте область брюшной полости 70% этанолом и введите тамоксифен внутрибрюшинно с помощью иглы 27G, прикрепленной к шприцу объемом 1 мл.
  2. Наблюдайте за животными в течение следующих 48 часов, чтобы исключить потенциальную токсичность тамоксифена.
  3. Переведите мышей в комнату облучения в соответствии с указаниями местного учреждения.
  4. Рассчитайте время облучения, высвобождаемого источником 137Cs, в соответствии с текущей мощностью дозы экзитора. Например, если текущая мощность дозы равна 75,9 рад/мин (0,759 Гр мин-1 = 75,9 сГр м-1), время воздействия в минутах рассчитывается как желаемая доза/0,759. Для облучения животных до дозы 12 Гр ЧМТ время воздействия составляет ~15,81 мин (15 мин и 48 с).
  5. Продезинфицируйте камеру отбора проб в гамма-облучателе 70% раствором этанола; Поместите абсорбирующий коврик и животных в камеру для проб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, подвергшиеся фиктивному лечению, должны быть помещены в комнату для облучения, но не подвергаться гамма-облучению.
  6. Закройте крышку и закройте камеру.
  7. Запрограммируйте гамма-облучатель так, чтобы животные подвергались воздействию 12 Гр ЧМТ.
    1. Включите машину, повернув ключ в положение START.
    2. Введите номер оператора с помощью цифровой клавиатуры и подтвердите нажатием клавиши ENTER.
    3. Введите PIN-код с помощью цифровой клавиатуры и подтвердите нажатием клавиши ENTER.
    4. Нажмите 1 для выбора параметров.
    5. Нажмите 1 для настройки таймера.
    6. Нажмите 1 , чтобы узнать время облучения.
    7. Введите настройку таймера для следующего цикла с помощью цифровой клавиатуры (формат чч:мм:сс) и подтвердите нажатием клавиши ВВОД.
    8. Подтвердите настройки еще раз, нажав ENTER.
    9. Вернитесь в главное меню, нажав CLEAR 2x.
    10. Нажмите START, чтобы начать экспозицию.
  8. Оставьте помещение на время активного воздействия. Машина автоматически остановится по истечении заданного времени и начнет издавать звуковой сигнал.
    ВНИМАНИЕ: Цезий-137 (137Cs) является смертельно опасным веществом (опасность для здоровья: H314). Внешнее воздействие больших количеств 137Cs может вызвать ожоги, острую лучевую болезнь и даже смерть.
  9. Выключите машину, повернув ключ в положение СТОП.
  10. Откройте камеру для образцов, снимите крышку, перенесите животных обратно в клетку и продезинфицируйте камеру для отбора проб 70% раствором этанола.
  11. Переведите животных обратно в обычную комнату содержания и наблюдайте за их состоянием после лечения.
  12. Контролируйте вес животных каждый день и немедленно усыпляйте их (несмотря на запланированный момент времени), если наблюдаются какие-либо симптомы измененного самочувствия, дистресса или потери веса, превышающие 15% от исходной массы тела.
  13. За три часа до планируемой эвтаназии продезинфицируйте область живота и, используя инсулиновый шприц 28 г, введите мышам 100 мкл исходного раствора EdU (вводимого внутрибрюшинно).
  14. Собирают проксимальный отдел кишечника через 0 ч, 3 ч, 6 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 168 ч после облучения.
    1. Проведите эвтаназию CO2 в соответствии со стандартами домашнего учреждения.
      ВНИМАНИЕ: Углекислый газ является опасным веществом (H280). Содержит газ под давлением; Может взорваться при нагревании. Может вытеснить кислород и вызвать быстрое удушье.
    2. Затем рассекают проксимальную часть тонкой кишки, удаляют прикрепленные ткани, промывают холодным DPBS с помощью иглы для прямого кормления 16 г, прикрепленной к шприцу объемом 10 мл, фиксируют модифицированным фиксирующим буфером Буэна с помощью иглы для прямого кормления 16 г, прикрепленной к шприцу объемом 10 мл, разрезают в продольном направлении и сворачивают проксимальную кишку с использованием техники швейцарского рулона, как описано ранее59.
  15. Поместите ткани в гистологическую кассету и оставьте на 24-48 ч при комнатной температуре в емкости с 10% буферным формалином. Объем формалина должен быть достаточным, чтобы полностью покрыть гистологические кассеты. Когда время инкубации истечет, с помощью щипцов перенесите гистологические кассеты в емкость, заполненную 70% этанолом. Затем приступайте к заделке тканевого парафина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Встраивание тканевого парафина было выполнено Исследовательской лабораторией гистологии в Университете Стоуни-Брук. На этом процедуру можно остановить, а парафиновые блоки хранить при комнатной температуре.
    ВНИМАНИЕ: Формалин является потенциально опасным веществом: опасным для здоровья (H350, H315, H317, H318, H370) и коррозионным. Формалин может вызвать рак, раздражение кожи и глаз, повреждение органов и аллергические кожные реакции.

4. Гистологический анализ

  1. Охладите гистологические кассеты, содержащие образцы тканей, залитые парафином, поместив их на лед не менее чем на 1 час. С помощью микротома подготовьте для окрашивания срезы толщиной 5 мкм. Каждая ткань должна быть нарезана горизонтально, чтобы покрыть весь свернутый образец.
    1. После резки парафинового блока переложите срезы тканей на водяную баню, подогретую до 45 °С, и поместите срезы на заряженные предметные стекла. Оставьте предметные стекла на решетке на ночь при комнатной температуре для высыхания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом процедуру можно остановить, а слайды можно хранить при комнатной температуре.
  2. Поместите горки в держатель для слайдов и запекайте в духовке при температуре 65 °C в течение ночи. Горки можно выпекать более короткое время, 1-2 часа. Однако это не рекомендуется в случае свежесрезанных (менее 1 месяца) слайдов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите набор для ручного окрашивания предметного стекла под химический колпак и проведите инкубацию с ксилолом, этанолом и гематоксилином под химическим колпаком.
  3. На следующий день охладите предметные стекла, поместив их в держатель слайда под химическим колпаком на 10 минут.
  4. Депарафинизируйте ткани, поместив держатель предметного стекла в емкость, заполненную 100% ксилолом, на 3 мин. Повторите инкубацию, используя свежий 100% ксилол.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента следите за тем, чтобы образцы всегда оставались влажными.
    ВНИМАНИЕ: Ксилол является потенциально опасным веществом: легковоспламеняющимся (GHS02), вызывающим острую токсичность (GHS07) и опасным для здоровья (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). Потенциальные опасные последствия заключаются в том, что он смертелен при проглатывании или попадании в дыхательные пути и может вызвать раздражение кожи, глаз и дыхательных путей. Кроме того, он может влиять на двигательные функции, вызывая сонливость или головокружение, и вызывать повреждение органов в случае длительного или повторного воздействия.
  5. Регидратируют секции в градиенте этанола, помещая держатель слайда последовательно в емкости, заполненные следующими растворами: 100% этанол, 2 мин; 95% этанол, 2 мин; 70% этанол, 2 мин.
  6. Перенесите держатель слайдера в емкость, наполненную дистиллированной водой, и промойте в проточной дистиллированной воде в течение 2 минут.
  7. Поместите держатель слайда в емкость, наполненную раствором гематоксилина, и оставьте пятно на 5 мин (под химическим колпаком).
  8. Перенесите держатель предметного стекла в емкость, наполненную водопроводной водой, и промойте в проточной водопроводной воде до тех пор, пока окрашивание гематоксилином не станет синеватым, обычно через 2 минуты.
  9. Перенесите держатель слайда в контейнер, заполненный 5% (мас./об.) раствором карбоната лития. Погружение в 10 раз.
    ВНИМАНИЕ: Карбонат лития является потенциально опасным веществом: вызывает острую токсичность (GHS07) и опасность для здоровья (H302 - H319). Он вреден при проглатывании, вреден при контакте с кожей и вызывает серьезное раздражение глаз.
  10. Перенесите держатель слайдера в емкость, наполненную дистиллированной водой, и промойте в проточной дистиллированной воде в течение 2 минут.
  11. Поместите держатель слайда в емкость, наполненную эозином и пятном, на 5 минут.
  12. Перенесите держатель слайда в емкость, заполненную 70% этанолом, и ненадолго промойте (10 с).
  13. Обезвоживают секции, помещая держатель слайда последовательно в емкости, заполненные растворами градиента этанола: 95% этанола, 5 погружений; 100% этанол, 5 погружений.
  14. Очистите слайды, поместив держатель слайда в контейнер, заполненный 100% ксилолом, на 3 минуты. Повторите инкубацию, используя свежий 100% ксилол.
  15. Выньте предметное стекло из стойки, высушите область вокруг тканей бумажным полотенцем и, в зависимости от размера образца, добавьте одну или две капли монтажной среды на основе ксилола на поверхность образца. Установите, аккуратно поместив покровное стекло поверх предметного стекла (будьте осторожны, чтобы не оставить пузырьков воздуха). При необходимости аккуратно нажмите. Вся поверхность стекла должна быть покрыта и герметична.
  16. Высушите предметные стекла, оставив их под химическим колпаком на ночь. Как правило, монтажная среда затвердевает менее чем за 24 часа. Чтобы слайды были сухими, можно сделать образец слайда. Используя пустую направляющую, поместите каплю монтажной среды и оставьте под химическим колпаком на ночь. На следующий день прикоснитесь к капле и проверьте, затвердела ли она.
  17. Когда предметные стекла высохнут, проанализируйте гистологию тканей с помощью светового микроскопа или более совершенного микроскопа с каналом светлого поля.
    1. Поместите предметное стекло микроскопа на предметный столик, перемещайте его, пока образец не окажется в центре поля зрения, отрегулируйте фокусировку с помощью ручки фокусировки и используйте объектив с 10-кратным и/или 20-кратным увеличением для анализа гистологии по сравнению с контрольными тканями (фиктивное облучение).
    2. Если микроскоп оснащен камерой, сделайте также снимки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура может быть остановлена здесь; Предметные стекла можно хранить при комнатной температуре и анализировать позже. Не храните предметные стекла дольше 30 дней, так как пятна медленно исчезают.

5. Иммунофлюоресцентное окрашивание

  1. Охладите гистологические кассеты, содержащие образцы тканей, залитые парафином, поместив их на лед не менее чем на 1 час. С помощью микротома подготовьте для окрашивания срезы толщиной 5 мкм. Каждая ткань должна быть нарезана горизонтально, чтобы покрыть весь свернутый образец.
    1. После резки парафинового блока переложите срезы ткани на водяную баню, подогретую до 45 °С, и поместите срезы на заряженные предметные стекла. Оставьте предметные стекла на решетке на ночь при комнатной температуре для высыхания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом процедуру можно остановить, а слайды можно хранить при комнатной температуре.
  2. Поместите горки в держатель для слайдов и запекайте в духовке при температуре 65 °C в течение ночи. Горки можно выпекать более короткое время, 1-2 часа. Однако это не целесообразно в случае свежесрезанных (менее 1 месяца назад) слайдов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите набор для ручного окрашивания предметного стекла под химический колпак и проведите инкубацию с ксилолом, этанолом и H2 O2 / метанолом под химическим колпаком.
  3. На следующий день охладите предметные стекла, поместив их в держатель слайда под химическим колпаком на 10 минут.
  4. Депарафинизируйте ткани, поместив держатель предметного стекла в емкость, заполненную 100% ксилолом, на 3 мин. Повторите инкубацию, используя свежий 100% ксилол.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента следите за тем, чтобы образцы всегда оставались влажными.
  5. Гасят эндогенную пероксидазу путем инкубации предметных стекол в течение 30 мин в емкости, заполненной 2% раствором перекиси водорода в метаноле под химическим колпаком.
    ВНИМАНИЕ: Метиловый спирт является потенциально опасным веществом: опасен для здоровья (H225-H301, H311, H331-H370), легковоспламеняющийся (GHS02) и вызывает острую токсичность (пероральную, кожную, ингаляционную) (GHS08). Перекись водорода является потенциально опасным веществом: вызывает коррозию (GHS05) и вызывает острую токсичность (GHS07).
  6. Регидратируйте секции в градиенте этанола, поместив держатель слайда последовательно в контейнеры, заполненные следующими растворами: 100% этанол, 3 мин; 95% этанол, 3 мин; 70% этанол, 3 мин.
  7. Перенесите держатель слайда в емкость, наполненную дистиллированной водой, и промойте в проточной дистиллированной воде в течение 2 мин.
  8. Чтобы извлечь антигены, перенесите держатель предметного стекла в контейнер с 250 мл цитратного буферного раствора (10 мМ цитрата натрия, 0,05% Tween-20, pH 6,0) и готовьте при 110 ° C в течение 10 минут с помощью камеры для снятия маскировки.
  9. Перенесите весь контейнер в холодильную камеру и дайте ему постепенно остыть в течение 30 минут.
  10. Через 30 мин замените цитратный буферный раствор дистиллированной водой и промойте в проточной дистиллированной воде до тех пор, пока не будут удалены все плавающие кусочки парафина.
  11. Выньте предметные стекла из держателя (по одному), постучите по бумажному полотенцу и тщательно высушите область вокруг образца бумажным полотенцем. Нарисуйте замкнутую форму вокруг образца с помощью ручки, обеспечивающей гидрофобный барьер (ПАП-ручка). Поместите в увлажненную камеру.
  12. Блок с 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в TBS-Tween путем добавления 200 мкл раствора на поверхность образца. Убедитесь в отсутствии утечек. Инкубировать при 37 °C в увлажненной камере в течение 30 мин.
  13. Удалите блокирующий раствор, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу. Поместите обратно в увлажненную камеру. Добавьте 100 мкл соответствующей концентрации первичных антител, ресуспендированных в блокирующем буфере, и инкубируйте при 4 ° C с легким покачиванием в течение ночи. Для BMI1 / EYFP используйте куриный анти-GFP (разведение 1:500); для Ki-67 используйте кроличий анти-Ki-67 (разбавление 1:200).
  14. Удалите раствор антител, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу; поместите слайды в держатель слайда и переложите в контейнер, заполненный TBS-Tween. Промойте предметные стекла встряхиванием в течение 5 мин. Повторите 3 раза. Каждый раз используйте свежую порцию буфера TBS-Tween.
  15. Выньте предметные стекла из держателя (по одному), удалите излишки моющего раствора, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу, и поместите в увлажненную камеру. Добавьте 100 мкл соответствующей концентрации вторичных антител, ресуспендированных в блокирующем буфере, и инкубируйте при 37 ° C в течение 30 мин. Вторичные антитела должны быть конъюгированы с флуорофором. Для BMI1 / EYFP используйте ослиный антикуриный Alexa Fluor 647 (разбавление 1:500); для Ki-67 используйте козий антикроличий Alexa Fluor 488 (разведение 1:500).
  16. Удалите раствор антител, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу; поместите слайды в держатель слайда и переложите в контейнер, заполненный TBS-Tween. Промойте предметные стекла встряхиванием в течение 5 мин. Повторите 3 раза. Каждый раз используйте свежую порцию буфера TBS-Tween.
  17. Выньте предметные стекла из держателя (по одному), удалите излишки моющего раствора, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу, и поместите в увлажненную камеру. Добавьте 100 мкл раствора для окрашивания EdU, приготовленного в соответствии с инструкциями производителя и с использованием флуорофора Alexa Fluor 555.
  18. Удалите раствор EdU, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу; поместите слайды в держатель слайда и переложите в контейнер, заполненный TBS-Tween. Промойте предметные стекла встряхиванием в течение 5 мин. Повторите 2 раза. Каждый раз используйте свежую порцию буфера TBS-Tween.
  19. Вынимайте слайды из держателя (по одному); Удалите излишки моющего раствора, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу, и поместите в увлажненную камеру. Выполните контрокрашивание по Хёхсту 33258 путем добавления 100 мкл раствора Хёхста 33258 (разведение 1:1000 в TBS-Tween) на поверхность образца. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 5 мин.
  20. Удалите раствор Hoechst 33258, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу; поместите слайды в держатель слайда и переложите в контейнер, наполненный TBS-Tween. Промойте предметные стекла встряхиванием в течение 5 минут.
  21. Выньте предметное стекло из держателя предметного стекла, высушите область вокруг салфеток бумажным полотенцем и, в зависимости от размера образца, добавьте одну или две капли монтажного носителя на основе морской среды на поверхность образца. Установите, аккуратно поместив покровное стекло поверх предметного стекла (будьте осторожны, чтобы не оставить пузырьков воздуха). При необходимости аккуратно нажмите. Вся поверхность стекла должна быть покрыта и герметична.
  22. Высушите предметные стекла, оставив их в темноте при комнатной температуре на ночь. Как правило, монтажная среда затвердевает менее чем за 24 часа. Чтобы слайды были сухими, можно сделать образец слайда. Используйте пустой слайд; Капните установочную среду и оставьте под химическим колпаком на ночь. На следующий день прикоснитесь к капле и проверьте, затвердела ли она.
  23. Когда предметные стекла высыхают, окрашенные ткани могут быть проанализированы с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного эмиссионными фильтрами длин волн, позволяющими визуализировать окрашивание Ki-67, EdU и BMI1 / EYFP (535 нм, 646 нм и 700 нм соответственно).
  24. Поместите предметное стекло микроскопа на предметный столик, перемещайте его, пока образец не окажется в центре поля зрения, отрегулируйте фокусировку с помощью ручки фокусировки и используйте объектив с 10-кратным и/или 20-кратным увеличением для анализа окрашивания по сравнению с контрольными тканями (фиктивное облучение). Если микроскоп оснащен камерой, можно делать снимки. Снимайте изображения для каждого канала отдельно и объединяйте позже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура может быть остановлена здесь; предметные стекла можно хранить при температуре 4 °C и анализировать в дальнейшем. Не храните предметные стекла дольше 14 дней, так как пятно медленно исчезает.

6. Окрашивание TUNEL

  1. Охладите гистологические кассеты, содержащие образцы тканей, залитые парафином, поместив их на лед не менее чем на 1 час. С помощью микротома подготовьте для окрашивания срезы толщиной 5 мкм. Каждая ткань должна быть нарезана горизонтально, чтобы покрыть весь свернутый образец.
    1. После резки парафинового блока переложите срезы тканей на водяную баню, подогретую до 45 °С, и поместите срезы на заряженные предметные стекла. Оставьте предметные стекла на решетке на ночь при комнатной температуре для высыхания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом процедуру можно остановить, а слайды можно хранить при комнатной температуре.
  2. Поместите горки в держатель для слайдов и запекайте в духовке при температуре 65 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды можно запекать в течение более короткого времени, 1-2 часа. Однако это не рекомендуется в случае свежесрезанных (менее 1 месяца назад) слайдов. Поместите набор для ручного окрашивания предметного стекла под химический колпак и проведите инкубацию с ксилолом и этанолом под химическим колпаком.
  3. На следующий день охладите предметные стекла, поместив их в держатель слайда под химическим колпаком на 10 минут.
  4. Депарафинизируйте ткани, поместив держатель предметных стекол в емкость, заполненную 100% ксилолом, на 3 мин. Повторите инкубацию, используя свежий 100% ксилол.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента следите за тем, чтобы образцы всегда оставались влажными.
  5. Регидратируйте срезы в градиенте этанола, последовательно помещая держатель предметных стекол в емкости, заполненные следующими растворами: 100% этанол, 3 мин; 95% этанол, 3 мин; 90% этанол, 3 мин; 80% этанол, 3 мин; 70% этанол, 3 мин.
  6. Перенесите держатель слайда в емкость, наполненную дистиллированной водой, и промойте в проточной дистиллированной воде в течение 1 мин.
  7. Выньте предметные стекла из держателя (по одному), постучите по бумажному полотенцу и тщательно высушите область вокруг образца бумажным полотенцем. Нарисуйте замкнутую форму вокруг образца с помощью ручки, обеспечивающей гидрофобный барьер (ПАП-ручка). Поместите в увлажненную камеру.
  8. Инкубируют со свободной ДНКазой протеиназы К. Добавляют 100 мкл раствора ДНКазной протеиназы К (разбавление 1:25 в DPBS) на поверхность образца в гидрофобном барьере. Инкубировать при комнатной температуре в увлажненной камере в течение 15 мин.
    ВНИМАНИЕ: Протеиназа К является потенциально опасным веществом: опасность для здоровья (H315 - H319 - H334).
  9. Удалите раствор протеиназы К, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу; поместите слайды в держатель для слайдов и перенесите в контейнер, наполненный DPBS. Промойте предметные стекла встряхиванием в течение 5 мин. Повторите 2 раза. Каждый раз используйте свежую порцию DPBS.
  10. Приготовьте реакционную смесь TUNEL: смешайте раствор метки (1x) с раствором фермента (10x). Хорошо пипетка.
  11. Вынимайте слайды из держателя (по одному); Удалите излишки моющего раствора, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу, и поместите в увлажненную камеру. Добавьте 50 мкл реакционной смеси TUNEL на поверхность образца и инкубируйте в темноте при 37 °C в увлажненной камере в течение 60 мин. Для отрицательного контроля используйте только раствор метки (без TdT).
  12. Удалите раствор TUNEL, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу; поместите слайды в держатель слайда и переложите в контейнер, наполненный DPBS. Промойте предметные стекла встряхиванием в течение 5 мин. Повторите 2 раза. Каждый раз используйте свежую порцию DPBS.
  13. Вынимайте слайды из держателя (по одному); Удалите излишки моющего раствора, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу, и поместите в увлажненную камеру. Выполните контрокрашивание по Хёхсту 33258 путем добавления 100 мкл раствора Хёхста 33258 (разведение 1:1000 в TBS-Tween) на поверхность образца. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 5 мин.
  14. Удалите раствор Hoechst 33258, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу; поместите слайды в держатель для слайдов и перенесите в контейнер, наполненный DPBS. Промойте предметные стекла встряхиванием в течение 5 минут.
  15. Выньте слайд из держателя слайда; Высушите область вокруг тканей с помощью бумажного полотенца и, в зависимости от размера образца, добавьте одну или две капли монтажной среды на основе воды на поверхность образца. Установите, аккуратно поместив покровное стекло поверх предметного стекла (будьте осторожны, чтобы не оставить пузырьков воздуха). При необходимости аккуратно нажмите. Вся поверхность стекла должна быть покрыта и герметична.
  16. Высушите предметные стекла, оставив их в темноте при комнатной температуре на ночь. Как правило, монтажная среда затвердевает менее чем за 24 часа. Чтобы слайды были сухими, можно сделать образец слайда. Поместите каплю монтажной среды и оставьте в темноте при комнатной температуре на ночь. На следующий день прикоснитесь к капле и проверьте, затвердела ли она.
  17. Когда предметные стекла высыхают, окрашенные ткани могут быть проанализированы с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного эмиссионными фильтрами длины волны, позволяющими визуализировать окрашивание TUNEL (535 нм).
  18. Поместите предметное стекло микроскопа на предметный столик, перемещайте его, пока образец не окажется в центре поля зрения, отрегулируйте фокусировку с помощью ручки фокусировки и используйте объектив с 10-кратным и/или 20-кратным увеличением для анализа окрашивания по сравнению с контрольными тканями (фиктивное облучение). Если микроскоп оснащен камерой, можно делать снимки. Снимайте изображения для каждого канала отдельно и объединяйте позже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура может быть остановлена здесь; предметные стекла можно хранить при температуре 4 °C и анализировать в дальнейшем. Не храните предметные стекла дольше 14 дней, так как пятно медленно исчезает.

Результаты

Использование облучения всего тела (ЧМТ) 12 Гр в сочетании с отслеживанием генетического происхождения мышей позволяет провести тщательный анализ последствий лучевого поражения кишечника. Для начала, Bmi1-CreER; Мыши Rosa26eYFP получили однократную инъекцию тамоксифена, котора...

Обсуждение

Этот протокол описывает надежную и воспроизводимую модель лучевого поражения. Это позволяет проводить точный анализ изменений в кишечном эпителии в течение 7 дней после травмы. Важно отметить, что выбранные временные точки отражают критические стадии повреждения и характеризуются от...

Раскрытие информации

Конфликт интересов у авторов отсутствует.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Центру исследований гистологии Онкологического центра Стоуни-Брук за экспертную помощь в подготовке образцов тканей и Отделу ресурсов лабораторных животных Университета Стоуни-Брук за помощь в уходе за животными и обращении с ними. Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения DK124342, присужденными Агнешке Б. Бялковской, и DK052230 доктору Винсенту В. Янгу.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeBD309659-
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: StraightVWR20068-630-
27G x 1/2" needleBD305109-
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringeCovidien1188128012-
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)Santa Cruz Biotechnologysc284628A10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered FormalinFisher Scientific22-026-213-
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/JThe Jackson LaboratoryStrain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/JThe Jackson LaboratoryStrain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shockMillipore-Sigma3116956001
Chicken anti-GFPAvesGFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, InvitrogenThermo Fisher ScientificC10638-
Corn oilMillipore-SigmaC8267-
Decloaking ChamberBiocare MedicalDC2012-
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher BioReagentsBP231-100light sensitive
DNase-free proteinase KInvitrogenC10618Hdiluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647Jackson ImmunoResearch703-605-155
DPBSFisher Scientific21-031-CV-
EosinFisher ScientificS176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20XNikon
Fluoromount Aqueous Mounting MediumMillipore-SigmaF4680-25ML
Gamma Cell 40 ExactorBest Theratronics Ltd.-0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488Jackson ImmunoResearch111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3Millipore-SigmaGHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo ScientificFisher Scientific23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)Thermo Fisher ScientificH3569dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-603-252-
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)Millipore-Sigma11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificL119-5000.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mLVWR89215-218-
MethanolVWRBDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOFFisher ScientificNC1675398-
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS GradeCapitol ScientificAAP-281000ACSCSLT-
Rabbit anti-Ki67BioCare MedicalCRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting MediumFisher Scientific22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degreeFisher Scientific50-728-103
Sodium Citrate DihydrateFisher ScientificS279-500
Stainless Steel Dissecting KitVWR25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]VWR 48311-703
TamoxifenMillipore-SigmaT564830 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable HandleSakura4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile BladesSakura4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining SetSakura4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with LidSakura4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with LidSakura4457
Tween 20Millipore-SigmaP7949
Unisette Processing CassettesVWR87002-292-
VWR Micro Cover GlassesVWR48393-081
XyleneFisher ScientificX5P-1GAL

Ссылки

  1. Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
  2. vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
  3. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 466-471 (2012).
  6. Liao, Z., Hu, C., Gao, Y. Mechanisms modulating the activities of intestinal stem cells upon radiation or chemical agent exposure. Journal of Radiation Research. 63 (2), 149-157 (2022).
  7. Meyer, A. R., Brown, M. E., McGrath, P. S., Dempsey, P. J. Injury-Induced Cellular Plasticity Drives Intestinal Regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (3), 843-856 (2022).
  8. Owens, B. M., Simmons, A. Intestinal stromal cells in mucosal immunity and homeostasis. Mucosal Immunology. 6 (2), 224-234 (2013).
  9. Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
  10. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. The American Journal of Anatomy. 141 (4), 537-561 (1974).
  11. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nature Medicine. 27 (1), 45-48 (2021).
  12. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  13. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  14. Tirado, F. R., et al. Radiation-induced toxicity in rectal epithelial stem cell contributes to acute radiation injury in rectum. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 63 (2021).
  15. Tetteh, P. W., Farin, H. F., Clevers, H. Plasticity within stem cell hierarchies in mammalian epithelia. Trends in Cell Biology. 25 (2), 100-108 (2015).
  16. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  17. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 179-184 (2011).
  18. Orzechowska, E. J., Katano, T., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Interplay among p21(Waf1/Cip1), MUSASHI-1 and Kruppel-like factor 4 in activation of Bmi1-Cre(ER) reserve intestinal stem cells after gamma radiation-induced injury. Scientific Reports. 10 (1), 18300 (2020).
  19. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  20. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nature Cell Biology. 14 (4), 401-408 (2012).
  21. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  22. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  23. Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
  24. Castillo-Azofeifa, D., et al. Atoh1(+) secretory progenitors possess renewal capacity independent of Lgr5(+) cells during colonic regeneration. The EMBO Journal. 38 (4), 99984 (2019).
  25. Van Landeghem, L., et al. Activation of two distinct Sox9-EGFP-expressing intestinal stem cell populations during crypt regeneration after irradiation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (10), 1111-1132 (2012).
  26. Roche, K. C., et al. SOX9 maintains reserve stem cells and preserves radioresistance in mouse small intestine. Gastroenterology. 149 (6), 1553-1563 (2015).
  27. Barriga, F. M., et al. Mex3a marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  28. May, R., et al. Brief report: Dclk1 deletion in tuft cells results in impaired epithelial repair after radiation injury. Stem Cells. 32 (3), 822-827 (2014).
  29. Tetteh, P. W., et al. Replacement of lost Lgr5-positive stem cells through plasticity of their enterocyte-lineage daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
  30. Bohin, N., et al. Rapid crypt cell remodeling regenerates the intestinal stem cell niche after Notch inhibition. Stem Cell Reports. 15 (1), 156-170 (2020).
  31. Li, N., et al. Single-cell analysis of proxy reporter allele-marked epithelial cells establishes intestinal stem cell hierarchy. Stem Cell Reports. 3 (5), 876-891 (2014).
  32. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  33. Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (23), 8965-8970 (2012).
  34. Hayakawa, Y., et al. BHLHA15-positive secretory precursor cells can give rise to tumors in intestine and colon in mice. Gastroenterology. 156 (4), 1066-1081 (2019).
  35. Yan, K. S., et al. Intestinal enteroendocrine lineage cells possess homeostatic and injury-inducible stem cell activity. Cell Stem Cell. 21 (1), 78-90 (2017).
  36. Chandrakesan, P., et al. Intestinal tuft cells regulate the ATM mediated DNA damage response via Dclk1 dependent mechanism for crypt restitution following radiation injury. Scientific Reports. 6, 37667 (2016).
  37. Yu, S., et al. Paneth cell multipotency induced by Notch activation following Injury. Cell Stem Cell. 23 (1), 46-59 (2018).
  38. Moussa, L., et al. Bowel radiation injury: Complexity of the pathophysiology and promises of cell and tissue engineering. Cell Transplantation. 25 (10), 1723-1746 (2016).
  39. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
  40. Tam, S. Y., Wu, V. W. C. A review on the special radiotherapy techniques of colorectal cancer. Frontiers in Oncology. 9, 208 (2019).
  41. Shadad, A. K., Sullivan, F. J., Martin, J. D., Egan, L. J. Gastrointestinal radiation injury: Symptoms, risk factors and mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 19 (2), 185-198 (2013).
  42. Serrano Martinez, P., Giuranno, L., Vooijs, M., Coppes, R. P. The radiation-induced regenerative response of adult tissue-specific stem cells: Models and signaling pathways. Cancers. 13 (4), 855 (2021).
  43. Stacey, R., Green, J. T. Radiation-induced small bowel disease: Latest developments and clinical guidance. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 5 (1), 15-29 (2014).
  44. Pan, Y. B., Maeda, Y., Wilson, A., Glynne-Jones, R., Vaizey, C. J. Late gastrointestinal toxicity after radiotherapy for anal cancer: A systematic literature review. Acta Oncologica. 57 (11), 1427-1437 (2018).
  45. Elhammali, A., et al. Late gastrointestinal tissue effects after hypofractionated radiation therapy of the pancreas. Radiation Oncology. 10, 186 (2015).
  46. You, S. H., Cho, M. Y., Sohn, J. H., Lee, C. G. Pancreatic radiation effect in apoptosis-related rectal radiation toxicity. Journal of Radiation Research. 59 (5), 529-540 (2018).
  47. Jiminez, J. A., Uwiera, T. C., Douglas Inglis, G., Uwiera, R. R. Animal models to study acute and chronic intestinal inflammation in mammals. Gut Pathogens. 7, 29 (2015).
  48. Snider, A. J., et al. Murine model for colitis-associated cancer of the colon. Methods in Molecular Biology. 1438, 245-254 (2016).
  49. Clapper, M. L., Cooper, H. S., Chang, W. C. Dextran sulfate sodium-induced colitis-associated neoplasia: A promising model for the development of chemopreventive interventions. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (9), 1450-1459 (2007).
  50. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  51. Fujimichi, Y., Otsuka, K., Tomita, M., Iwasaki, T. Ionizing radiation alters organoid forming potential and replenishment rate in a dose/dose-rate dependent manner. Journal of Radiation Research. 63 (2), 166-173 (2022).
  52. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4alpha as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  53. Nagle, P. W., Coppes, R. P. Current and future perspectives of the use of organoids in radiobiology. Cells. 9 (12), 2649 (2020).
  54. Taelman, J., Diaz, M., Guiu, J. Human Intestinal Organoids: Promise and Challenge. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854740 (2022).
  55. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
  56. Kuruvilla, J. G., et al. Kruppel-like factor 4 modulates development of BMI1(+) intestinal stem cell-derived lineage following gamma-radiation-induced gut injury in mice. Stem Cell Reports. 6 (6), 815-824 (2016).
  57. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nature Genetics. 40 (7), 915-920 (2008).
  58. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
  59. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  60. Booth, C., Tudor, G., Tudor, J., Katz, B. P., MacVittie, T. J. Acute gastrointestinal syndrome in high-dose irradiated mice. Health Physics. 103 (4), 383-399 (2012).
  61. Lu, L., Jiang, M., Zhu, C., He, J., Fan, S. Amelioration of whole abdominal irradiation-induced intestinal injury in mice with 3,3'-Diindolylmethane (DIM). Free Radical Biology & Medicine. 130, 244-255 (2019).
  62. Karlsson, J. A., Andersen, B. L. Radiation therapy and psychological distress in gynecologic oncology patients: Outcomes and recommendations for enhancing adjustment. Journal of Psychosomatic Obstetrics & Gynecology. 5 (4), 283-294 (1986).
  63. Yang, J., Cai, H., Xiao, Z. X., Wang, H., Yang, P. Effect of radiotherapy on the survival of cervical cancer patients: An analysis based on SEER database. Medicine. 98 (30), 16421 (2019).
  64. Giroux, V., et al. Mouse intestinal Krt15+ crypt cells are radio-resistant and tumor initiating. Stem Cell Reports. 10 (6), 1947-1958 (2018).
  65. Kim, C. K., et al. Kruppel-like factor 5 regulates stemness, lineage specification, and regeneration of intestinal epithelial stem cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 587-609 (2020).
  66. Sheng, X., et al. Cycling stem cells are radioresistant and regenerate the intestine. Cell Reports. 32 (4), 107952 (2020).
  67. Gross, S., et al. Nkx2.2 is expressed in a subset of enteroendocrine cells with expanded lineage potential. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (12), 975-987 (2015).
  68. Sato, T., et al. Characterization of radioresistant epithelial stem cell heterogeneity in the damaged mouse intestine. Scientific Reports. 10 (1), 8308 (2020).
  69. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7 (6), 38965 (2012).
  70. Bohin, N., et al. Insulin-like growth factor-1 and mTORC1 signaling promote the intestinal regenerative response after irradiation injury. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 797-810 (2020).
  71. Romesser, P. B., et al. Preclinical murine platform to evaluate therapeutic countermeasures against radiation-induced gastrointestinal syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (41), 20672-20678 (2019).
  72. Gu, J., et al. At what dose can total body and whole abdominal irradiation cause lethal intestinal injury among C57BL/6J mice. Dose Response. 18 (3), 1559325820956783 (2020).
  73. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
  74. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 365-367 (2019).
  75. Bohin, N., Carlson, E. A., Samuelson, L. C. Genome toxicity and impaired stem cell function after conditional activation of CreER(T2) in the intestine. Stem Cell Reports. 11 (6), 1337-1346 (2018).
  76. Boynton, F. D. D., Ericsson, A. C., Uchihashi, M., Dunbar, M. L., Wilkinson, J. E. Doxycycline induces dysbiosis in female C57BL/6NCrl mice. BMC Research Notes. 10 (1), 644 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены