Questo documento descrive in dettaglio la metodologia per la radiomarcatura di un anticorpo monoclonale anti-CD19 specifico per l'uomo e come utilizzarlo per quantificare le cellule B nel sistema nervoso centrale e nei tessuti periferici di un modello murino di sclerosi multipla utilizzando l'imaging PET in vivo, il conteggio gamma ex vivo e gli approcci di autoradiografia.
La sclerosi multipla (SM) è la malattia demielinizzante più comune del sistema nervoso centrale (SNC) che colpisce i giovani adulti, spesso con conseguenti deficit neurologici e disabilità man mano che la malattia progredisce. I linfociti B svolgono un ruolo complesso e critico nella patologia della SM e sono il bersaglio di diverse terapie negli studi clinici. Attualmente, non c'è modo di selezionare con precisione i pazienti per specifiche terapie con cellule anti-B o di quantificare in modo non invasivo gli effetti di questi trattamenti sul carico di cellule B nel SNC e negli organi periferici. L'imaging con tomografia a emissione di positroni (PET) ha un enorme potenziale per fornire informazioni quantitative altamente specifiche sulla distribuzione spazio-temporale in vivo e sul carico delle cellule B in soggetti viventi.
Questo articolo riporta i metodi per sintetizzare e impiegare un tracciante PET specifico per le cellule B CD19+ umane in un modello murino ben consolidato di SM guidato da cellule B, encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), che è indotta con glicoproteina oligodendrocitaria mielinica ricombinante umana 1-125. Di seguito sono descritte tecniche ottimizzate per rilevare e quantificare le cellule B CD19+ nel cervello e nel midollo spinale utilizzando l'imaging PET in vivo . Inoltre, questo documento riporta metodi semplificati per il conteggio gamma ex vivo di organi rilevanti per la malattia, tra cui midollo osseo, midollo spinale e milza, insieme all'autoradiografia ad alta risoluzione del legame del tracciante CD19 nei tessuti del SNC.
La sclerosi multipla è una malattia neurologica immuno-mediata; La presentazione unica in ogni paziente può rendere la gestione impegnativa sia per i pazienti che per i medici1. La malattia stessa è caratterizzata dalla presenza di lesioni demielinizzanti e dall'infiltrazione di cellule immunitarie nel cervello e nel midollo spinale, con conseguente deterioramento fisico e cognitivo2. Il paradigma tradizionale secondo cui la SM è una malattia mediata dalle cellule T è stato messo in discussione per la prima volta in uno studio clinico di fase II di rituximab3, una terapia mirata al sottogruppo CD20+ delle cellule B. Da allora sono state sviluppate ulteriori terapie a base di cellule B che hanno come bersaglio CD194, un biomarcatore di cellule pan B espresso su una gamma più ampia di cellule B, che può essere vantaggioso sia dal punto di vista diagnostico che terapeutico. Inoltre, i metodi esistenti per valutare l'efficacia del trattamento (ad esempio, il monitoraggio del numero di recidive e dell'attività della risonanza magnetica per immagini) non consentono misure precoci di risposta, esponendo così i pazienti a un rischio significativo di danni al SNC a causa della selezione e dell'ottimizzazione della terapia non ottimale. Quindi, c'è un bisogno critico di strategie per monitorare specifiche cellule immunitarie, come le cellule B CD19+ , in tempo reale nel sistema nervoso centrale e nella periferia dei pazienti con SM.
L'imaging PET è una tecnica di imaging robusta che consente la visualizzazione in vivo di tutto il corpo di un determinato bersaglio di interesse, come CD19. Mentre i prelievi di sangue, le registrazioni dei tassi di recidiva e il monitoraggio delle lesioni tramite risonanza magnetica forniscono istantanee sull'efficacia del trattamento, l'imaging PET può consentire ai ricercatori e ai medici di monitorare l'efficacia di una terapia in tutto il corpo. Questo approccio proattivo al monitoraggio terapeutico consente ai medici di valutare l'efficacia dei farmaci in tempo reale, consentendo rapidi aggiustamenti in base alle esigenze. Il monitoraggio della posizione e della densità delle popolazioni cellulari associate alla malattia consente anche una valutazione longitudinale della gravità utilizzando informazioni anatomiche specifiche per il paziente. È quindi essenziale stabilire metodi analitici riproducibili per utilizzare in modo affidabile il pieno potenziale dell'imaging PET in ambito clinico e preclinico.
Questo documento descrive i metodi (Figura 1) per eseguire l'imaging PET, il conteggio gamma ex vivo e l'autoradiografia (ARG) delle cellule B CD19+ con un anticorpo monoclonale (mAb) anti-umano CD19 marcato con 64 Cu, noto come 16C4-TM (64Cu-hCD19-mAb), nel modello murino sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE) di SM indotta in topi transgenici che esprimono CD19 umano (hCD19) utilizzando la glicoproteina oligodendrocitaria mielinica ricombinante umana 1-125 (MOG1-125). Forniamo anche metodi per valutare il legame del radiotracciante in modo accurato e riproducibile nel cervello e nel midollo spinale, entrambi siti critici di patogenesi spesso gravemente colpiti in questo e in altri modelli neurodegenerativi. Queste tecniche consentono un'indagine non invasiva del ruolo delle cellule B nella patologia della malattia e hanno il potenziale per essere tradotte clinicamente per valutare l'efficacia delle terapie anti-cellule B nella SM.
Figura 1: Disegno dello studio. Una panoramica delle tecniche chiave in questo articolo. (A) Posizionare i topi sul letto di scansione sulla schiena riduce il movimento della colonna vertebrale. (B) Imaging PET/TC dei topi. (C) Praticare un'incisione lungo il lato dorsale dell'animale per esporre la colonna vertebrale. (D) Dividere in due la colonna vertebrale in porzioni cervicale/toracica e lombare e rimuovere le sezioni seguendo i cinque tagli indicati. (E) Utilizzare una siringa per rimuovere il midollo spinale dalla colonna vertebrale sigillando con la siringa e la colonna vertebrale e lavando le estremità craniche e caudali della colonna vertebrale come mostrato. (F) Segmenti isolati del midollo spinale cervicale/toracico e lombare. Abbreviazione: PET/CT = Tomografia ad emissione di positroni/tomografia computerizzata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con l'Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) della Stanford University, un programma accreditato dall'Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC International). I topi sono stati acclimatati al vivaio per almeno 7 giorni prima dell'inizio dello studio per ridurre al minimo lo stress sui topi, poiché lo stress può influenzare l'induzione dell'EAE.
1. Induzione EAE in topi CD19 umanizzati femmine
2. Cura degli animali e punteggio nel modello murino EAE
3. Coniugazione, radiomarcatura e caratterizzazione degli anticorpi monoclonali
4. Preparazione della dose
NOTA: Prima di maneggiare la dose, indossare DPI adeguati, inclusi camice da laboratorio, dosimetri per il corpo e le dita e guanti.
5. Incannulamento e iniezione
NOTA: Vedere i metodi6 descritti in precedenza per l'incannulamento endovenoso di topi per l'iniezione del radiotracciante6.
6. Imaging PET/TC
7. Dissezione per conteggio gamma ex vivo e autoradiografia
8. Conteggio gamma ex vivo
9. Autoradiografia ex vivo (ARG) del tessuto del SNC
10. Analisi dei dati di biodistribuzione
11. Analisi dell'immagine PET
12. Analisi autoradiografica ex vivo
L'anticorpo monoclonale hCD19-mAb è stato coniugato con DOTA e radiomarcato con 64Cu, come mostrato nella Figura 2. EAE e topi naïve sono stati sottoposti a scansione PET/TC (Figura 3) 18-24 ore dopo l'iniezione con 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. Le immagini PET/CT sono state co-registrate utilizzando il software di analisi PET e i tessuti del SNC sono stati analizzati utilizzando ROI manuali o un atlante cerebrale 3D semi-automatizzato. Il legame con il radiotracciante nelle ROI (Figura 4) era più alto nei topi EAE rispetto ai topi naïve. Il conteggio gamma ex vivo e l'ARG hanno mostrato un aumento del legame nel midollo spinale (segmenti toracici sia lombari che cervicali) e nel cervello (solo ARG) dei topi EAE rispetto a quelli naïve (Figura 5 e Figura 6). Il conteggio gamma ex vivo di topi perfusi ha anche mostrato una diminuzione del legame del radiotracciante negli organi periferici, tra cui milza, femore e midollo osseo (Figura 5), coerente con le cellule B che lasciano la periferia e si infiltrano nel SNC in questo modello EAE.
Figura 2: Schema di coniugazione e radiomarcatura per la generazione di 64 anticorpi monoclonali CD19 specifici per l'uomo, 16C4-TM mAb (64Cu-DOTA-hCD19-mAb), oltre ai dati di controllo qualità. (A) Reazione dell'estere DOTA-NHS con l'anticorpo monoclonale hCD19 per produrre il coniugato hCD19-DOTA (non in scala) e radiomarcatura con 64 Cu-CuCl3 per produrre 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. (B) Cromatografo ITLC rappresentativo. Il picco a 40-60 cm è l'anticorpo radiomarcato; 64Cu-CuCl3 non legato viaggia con la fase mobile e sarebbe presente da 200 a 240 cm. In questo cromatografo non c'è 64Cu-CuCl3 libero rilevabile. (C) Le specifiche di controllo di qualità dell'anticorpo radiomarcato. Abbreviazioni: estere DOTA-NHS = 1,4,7,10-Tetraazaciclododecano-1,4,7,10-estere mono-N-idrossisuccinimide dell'acido tetraacetico; ITLC/HPLC = cromatografia istantanea su strato sottile/cromatografia liquida ad alta prestazione; MALDI/LC-MS = desorbimento/ionizzazione/cromatografia liquida-spettrometria laser assistita da matrice; CPM = conteggi al minuto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Fotografie che dimostrano come fissare i topi in un letto stampato in 3D all'interno dello scanner PET per consentire l'imaging di alta qualità del midollo spinale e del cervello riducendo al minimo il movimento . (A) Letto scanner a quattro mouse stampato in 3D (noto anche come "hotel del mouse") dotato di elementi riscaldanti e tubi per anestesia. (B) Topi anestetizzati in posizione supina per massimizzare la rettilineità della colonna vertebrale; Viene registrata la posizione del letto di ciascun mouse. (C) I topi hanno fissato saldamente la testa per ridurre al minimo il movimento nel cervello e attraverso la pancia per ridurre al minimo il movimento della respirazione, senza influenzare la respirazione. (D) Letto per mouse posizionato all'interno dello scanner e fissato con nastro adesivo al piano di scansione. Il tubo per l'anestesia è stato collegato dallo scanner al letto e l'isoflurano è stato impostato al 2%. La respirazione dei topi è stata monitorata per garantire un livello appropriato di isoflurano prima di chiudere lo sportello dello scanner. Abbreviazione: PET = Tomografia ad emissione di positroni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagine del midollo spinale e analisi del cervello e risultati utilizzando un software di analisi PET . (A) i) ROI (rosa e marrone chiaro ) disegnate sulla colonna vertebrale per separare le vertebre lombari da quelle toraciche e cervicali e preparare l'immagine per la soglia Otsu. ii ) Le vertebre spinali (turchese e rosse) sono state segmentate utilizzando la soglia Otsu. iii ) Le vertebre sono state quindi rese immutabili nel menu ROI 3D e il midollo spinale è stato diviso in ROI cervicale/toracica (viola) e lombare (blu marino). iv) La ROI vertebrale è stata rimossa, lasciando applicate le ROI del midollo spinale e l'atlante cerebrale rappresentativo. (B) Analisi rappresentativa dei risultati PET di varie regioni del SNC rappresentate come %ID/g normalizzate al ROI del cuore all'interno di ciascun animale. L'acquisizione della PET è stata una scansione statica di 10 minuti tramite imaging PET/CT. Regioni cerebrali quantificate utilizzando un approccio semi-automatizzato dell'atlante cerebrale, mostrato nel pannello A. iv) I risultati rappresentativi mostrano una significatività o una tendenza verso un aumento significativo del legame con i traccianti nel cervello e nel midollo spinale toracico. Statistiche eseguite utilizzando il test t di Student (*: p < 0,0332). Abbreviazioni: PET = Tomografia ad emissione di positroni; ROI = regioni di interesse; SNC = sistema nervoso centrale; TC = tomografia computerizzata; %ID/g = percentuale di dose iniettata per grammo di tessuto; EAE = encefalomielite autoimmune sperimentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Quantificazione rappresentativa del conteggio gamma ex vivo in vari organi in EAE e topi naïve espresso come %ID/g. Dopo la scansione PET, i topi sono stati perfusi con PBS per rimuovere il radiotracciante presente nel sangue, libero o legato alle cellule B CD19+ residenti nel sangue, e gli organi sono stati rapidamente sezionati e pesati per avere un peso accurato di ciascun organo. Il legame con i traccianti è significativamente ridotto nella milza e nel midollo osseo nei topi EAE rispetto a quelli naïve. L'aumento del legame con il radiotracciante è stato osservato sia nei segmenti lombari che in quelli del midollo spinale cervicale/toracico dei topi EAE. Il cervello non mostra un aumento significativo del segnale del radiotracciante, anche se tende ad aumentare in modo significativo. Statistiche eseguite utilizzando il test t di Student (*: p < 0,0332; ****: p < 0,0001). Abbreviazioni: PET = Tomografia ad emissione di positroni; %ID/g = percentuale di dose iniettata per grammo di tessuto; EAE = encefalomielite autoimmune sperimentale; PBS = soluzione salina tamponata con fosfati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Le immagini ARG ex vivo mostrano il legame di 64Cu-DOTA-hCD19-mAb nelle sezioni cerebrali sagittali e nell'intero midollo spinale di EAE rispetto ai topi naïve. Le pellicole digitali per la conservazione del fosforo sono state scansionate utilizzando un imager al fosforo dopo essere state esposte a campioni di tessuto radioattivo per circa 10 emivite (127 ore o 5 giorni). Le immagini risultanti rivelano un segnale visivamente più elevato nel cervello dei topi EAE rispetto alle sezioni cerebrali dei topi naïve, il che è previsto a causa delle regioni note per contenere cellule B in questo modello5. In particolare, c'è un aumento del segnale tracciante nel tronco encefalico, nel cervelletto e nei ventricoli delle sezioni cerebrali dei topi EAE. Questo aumento del segnale per le sezioni cerebrali di topo EAE rispecchia ciò che è stato trovato per la quantificazione PET dell'intero cervello descritta sopra. Allo stesso modo, c'è un aumento del legame del radiotracciante in entrambi i segmenti del midollo spinale cervicale/toracico e lombare rispetto al midollo spinale naïve, riflettendo ciò che è stato trovato utilizzando il conteggio gamma ex vivo . Abbreviazioni: PET = Tomografia ad emissione di positroni; EAE = encefalomielite autoimmune sperimentale; Sfiato = ventricoli; Cb = cervelletto; BS = tronco encefalico; TSc = midollo spinale toracico e cervicale combinati; LSc = midollo spinale lombare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare S1: Colorazione dei tessuti del SNC del tessuto cerebrale di topo naïve e EAE con CD45R/B220. Le cellule B sono osservate nel tronco encefalico, nelle meningi e nella sostanza bianca dei topi EAE (n = 7 EAE, n = 5 topi naïve, in media quattro fette per animale). Questa cifra è da 5. Barre della scala = 5 mm (basso ingrandimento [1x]) nelle immagini sagittali del cervello, 100 μm (alto ingrandimento [20x]) nel tronco encefalico, nelle meningi e nella sostanza bianca cerebellare. Fare clic qui per scaricare il file.
Questo articolo descrive un metodo semplificato per l'imaging delle cellule B CD19+ umane in un modello murino di SM utilizzando CD19-PET. A causa della presentazione eterogenea della SM e delle diverse risposte ai trattamenti, la sua gestione in clinica può essere impegnativa e sono necessari nuovi approcci per la selezione e il monitoraggio della terapia. L'imaging PET potrebbe servire come un potente strumento per monitorare la progressione della malattia e la risposta individuale alla terapia di deplezione delle cellule B. Oltre alla SM, l'imaging CD19-PET potrebbe essere utilizzato per monitorare la deplezione delle cellule B dopo il trattamento nei sottotipi di linfomi e leucemia o altre malattie mediate dalle cellule B. Questo protocollo e i dati rappresentativi mostrano l'utilità dell'imaging delle cellule B nelle malattie neurologiche.
Per studiare le cellule B CD19+ umane nel contesto della SM, abbiamo scelto il modello7 MOG1-125 EAE dipendente dalle cellule B. Simile ad altri modelli EAE, questo modello presenta sintomi di paralisi progressiva e infiltrazione di cellule immunitarie nel SNC. Tuttavia, il modello MOG1-125 è unico in quanto è un modello guidato dalle cellule B: i topi contengono un numero variabile di cellule B nello spazio subaracnoideo nelle meningi, nel tronco encefalico, nel parenchima e nei ventricoli. Questi linfociti possono essere sparsi in modo sparso in queste regioni e/o formare strutture simili a follicoli, che si osservano anche nell'uomo con SM 8,9. Oltre a utilizzare topi naïve come controlli, è possibile utilizzare un kit di induzione completo per l'adiuvante di Freund (CFA) (cioè un'emulsione di induzione identica a quella somministrata ai topi EAE senza la proteina MOG). Nel modello murino EAE, la barriera ematoencefalica (BBB) è disfunzionale e consente l'attraversamento di entità più grandi, come gli anticorpi. Il radiotracciante CD19-mAb si legherà e rimarrà nel SNC solo se sono presenti cellule B; il tracciante circolerà di nuovo nel pool sanguigno se le cellule B non sono presenti. Lo abbiamo dimostrato utilizzando il conteggio gamma e l'autoradiografia ex vivo dei tessuti del SNC mediante perfusione prima di misurare i livelli di radioattività nei tessuti. Lo abbiamo anche dimostrato in precedenti pubblicazioni che riportavano l'uso di radiotraccianti PET a base di anticorpi monoclonali (cioè approcci di imaging immunoPET) per rilevare le cellule B nel SNC 1,2.
Il chelante DOTA è stato utilizzato da quando è stato utilizzato nell'imaging clinico PET con peptidi e anticorpi marcati con rame-64 e miriamo a tradurre l'anticorpo monoclonale hCD19-mAb per l'imaging clinico dei pazienti con SM. DOTA ha un'adeguata affinità di legame con il rame-64 in vivo. La stabilità in vivo è molto importante perché il 64Cu libero va al fegato e può oscurare il segnale del radiotracciante legato; Pertanto, è importante misurare il segnale nel fegato per calcolare il segnale relativo rispetto ad altri organi. Il muscolo viene in genere preso come tessuto di controllo, ma nel caso dell'EAE, ci può essere un'infiammazione presente nei muscoli. L'emivita di 64Cu è di 12,7 ore, il che offre un ampio tempo per il DOTA-hCD19-mAb di legarsi al suo bersaglio, garantendo al contempo che il segnale possa essere misurato tramite PET. Quando si prepara il coniugato, è necessario eseguire reazioni di prova su piccola scala (75-125 μg) per determinare la quantità di DOTA da aggiungere all'anticorpo monoclonale per produrre il rapporto DOTA/anticorpo monoclonale desiderato (ad esempio, una reazione di 6-10 volte l'eccesso di estere DOTA-NHS per mol di anticorpo monoclonale può consentire un coniugato di 1-2 anticorpi monoclonali). Anche il tempo di reazione e la temperatura (ad es. 2-4 ore o una notte a 4 °C o a temperatura ambiente) influenzano il rapporto DOTA/mAb e devono essere ottimizzati. Una titolazione con rame non radioattivo può essere eseguita per calcolare il numero di DOTA per mAb; tuttavia, si consiglia di eseguire MALDI-MS e/o LC-MS per risultati più affidabili e accurati.
Il rapporto DOTA/mAb calcolato è un valore medio per un particolare campione e sono previste alcune variazioni. Per MALDI, vengono effettuate diverse iniezioni per campione per gli anticorpi monoclonali coniugati e non coniugati. Calcoliamo quindi il rapporto tra coniugati e non coniugati per determinare il numero medio di DOTA/mAb. Il rapporto DOTA/mAb è importante perché troppi chelanti interrompono il legame degli anticorpi e troppo pochi portano a una radiomarcatura incoerente e a un segnale basso. Il rapporto dovrebbe essere molto stretto tra i lotti di coniugato per mantenere costante l'intensità del segnale e la cinetica di legame; Idealmente, lo stesso lotto di coniugato dovrebbe essere utilizzato per tutti gli esperimenti all'interno di un particolare studio. Una tecnica promettente per ridurre i potenziali effetti sull'immunoreattività dovuti a una possibile sovraconiugazione è quella di utilizzare la coniugazione sito-specifica10 in cui la coniugazione del chelante è selettiva per il sito sui glicani a catena pesante dell'anticorpo, garantendo così l'aggiunta di 1 chelante per anticorpo monoclonale.
Le condizioni di reazione della radiomarcatura devono essere ottimizzate per garantire la massima efficienza e resa di marcatura poiché le differenze nell'anticorpo, nel rapporto DOTA/mAb e nell'attività molare di 64Cu, tra le altre condizioni, influiranno sulla radiomarcatura. L'utilizzo del rapporto coniugato ottimale tra 64Cu e mAb può consentire l'utilizzo del radiotracciante senza purificazione, riducendo il tempo necessario per la radiomarcatura e la perdita dovuta alla colonna di flusso gravitazionale e al decadimento radioattivo. Un'attività molare coerente e affidabile può essere raggiunta anche quando viene utilizzato lo stesso rapporto coniugato tra 64Cu e mAb, il che è particolarmente importante quando si confrontano i risultati di più coorti di topi o studi di imaging. Le condizioni ITLC possono anche essere modificate per adattarsi a ciascun utente. Se è necessaria la purificazione, è necessario conservare un'aliquota per la spettrofotometria HPLC e/o UV/Vis in modo da poter calcolare l'attività molare.
È importante notare che l'uso di anticorpi radiomarcati per l'imaging può essere difficile. È essenziale che l'anticorpo utilizzato per il radiotracciante sia biologicamente inerte per non avere un effetto fisiologico. Inoltre, poiché gli anticorpi hanno una lunga residenza nel sangue, è necessario attendere abbastanza a lungo per la circolazione, il legame e la clearance di un determinato anticorpo monoclonale per garantire un adeguato rapporto segnale-fondo senza compromettere la qualità dell'immagine. In genere è sufficiente attendere 20-48 ore per un anticorpo monoclonale marcato con 64 Cu, ma è necessario eseguire l'imaging a 2, 4, 6, 12, 24, 48 ore dopo l'iniezione quando si valuta un nuovo tracciante PET per mAb per determinare il miglior punto temporale per l'imaging in un determinato modello di roditore. Lo stesso vale per l'acquisizione di immagini ARG con il più alto rapporto segnale/sfondo. Le immagini rappresentative di questo protocollo sono state scattate 18-20 ore dopo l'iniezione, anche se possono essere utilizzati altri punti temporali a seconda del radioisotopo utilizzato. Anticorpi diversi che si legano a diversi epitopi di CD19 produrranno risultati diversi e dovrebbero essere rigorosamente caratterizzati.
Quando si analizza il segnale del midollo spinale, è importante posizionare i topi sulla schiena nel letto di scansione per ridurre il movimento causato dalla respirazione. Inoltre, il posizionamento supino può aiutare a raddrizzare la colonna vertebrale nei topi che hanno una maggiore curvatura spinale a causa della progressione della malattia EAE. Un altro aspetto importante da considerare quando si cerca di rilevare il segnale nella colonna vertebrale e nel midollo spinale è quello di evitare di iniettare MOG1-125 sul fianco, poiché i siti di iniezione possono legare il tracciante a causa della risposta immunitaria associata in quelle aree. La vicinanza del sito di iniezione può interferire con l'analisi del midollo spinale; Pertanto, le iniezioni nel torace sono preferibili per l'applicazione qui descritta.
Le tecniche di analisi delle immagini utilizzate sono specifiche per l'imaging del sistema nervoso centrale. Uno strumento di atlante cerebrale all'interno del software di analisi delle immagini offre risultati riproducibili e affidabili, purché la registrazione di PET e TC sia accurata. L'utilizzo dell'atlante cerebrale 3D semi-automatizzato e la sua regolazione per adattarlo al cranio di ciascun topo consente di ottenere ROI coerenti tra gli animali. Poiché attualmente non esiste un approccio automatizzato o semi-automatizzato per l'analisi del segnale nel midollo spinale, è necessario tracciare le ROI manuali. In particolare, quando si quantificano le cellule B CD19+ (o qualsiasi tipo di cellula presente sia nel midollo osseo che nel midollo spinale), è fondamentale eliminare il più possibile il segnale proveniente dalla colonna vertebrale e dal midollo osseo. La ragione di ciò è che i topi naïve sono noti per contenere più cellule B CD19+ nel loro midollo osseo rispetto ai topi EAE, in cui le cellule B lasciano la periferia per infiltrarsi nel SNC 5,11. Questo segnale del midollo osseo può oscurare il vero segnale nel midollo spinale.
Per delineare il vero segnale del midollo spinale riducendo al minimo il contributo del segnale proveniente dalla colonna vertebrale e dal midollo osseo, la soglia Otsu dell'immagine TC può essere utilizzata per ottenere un ROI immutabile per la colonna vertebrale. Una ROI separata del midollo spinale può quindi essere facilmente disegnata all'interno della colonna vertebrale. La stessa tecnica può essere applicata anche per misurare il midollo osseo nel femore. Questo è un metodo molto utile per ottenere informazioni sul legame del tracciante nel midollo spinale. Tuttavia, a causa della risoluzione spaziale relativamente bassa della PET e dei problemi relativi all'effetto del volume parziale durante la scansione di piccole regioni anatomiche dei topi, l'uso di ulteriori tecniche di conferma ex vivo (ad esempio, conteggio gamma, ARG) consente la convalida del legame del radiotracciante nel midollo spinale senza la presenza di sangue, liquido cerebrospinale o segnale di spillover dalla colonna vertebrale.
Il segnale nel midollo spinale cervicale/toracico tende a variare nei topi EAE a seconda della gravità della malattia e del numero di cellule B infiltrate durante la risposta immunitaria adattativa. Questa variazione nel numero di cellule B che si infiltrano, così come la piccola quantità di cellule B nel sistema nervoso centrale rispetto a quelle nel midollo osseo pelvico/spinale dei topi naïve, può rendere difficile la quantificazione in vivo del tessuto del midollo spinale nei topi. Data la risoluzione spaziale della PET nell'imaging di piccoli animali, il segnale proveniente dal midollo osseo può riversarsi sul segnale del midollo spinale. La biodistribuzione ex vivo e l'autoradiografia qui completate aiutano a convalidare il segnale PET delle vertebre rispetto al tessuto del midollo spinale. I topi vengono perfusi prima della dissezione per rimuovere qualsiasi tracciante non legato nel pool sanguigno in modo che il conteggio gamma e i risultati dell'autoradiografia riflettano il tracciante che è effettivamente legato in ciascun organo piuttosto che il tracciante che si trova nel pool sanguigno in quell'organo.
I radiotraccianti circolano attraverso il sangue e, in particolare, con i traccianti anticorpali, c'è spesso un radiotracciante non legato presente nel sangue per settimane dopo l'iniezione iniziale. Dal momento che stiamo visualizzando il cervello e il midollo spinale, che hanno molti vasi sanguigni, è importante capire quale parte del segnale è veramente dovuta al legame del tracciante nel cervello/tessuto di interesse rispetto a quello presente nel pool sanguigno. È quindi necessario dividere il segnale cerebrale per segnale nel pool cuore/sangue. In ambito clinico, le stesse tecniche di analisi delle immagini della soglia Otsu delle vertebre e delle ROI dei tessuti del midollo spinale possono essere utilizzate per la quantificazione. Dati i maggiori volumi di tessuto negli esseri umani rispetto ai topi, l'impatto degli effetti parziali del volume dovrebbe essere significativamente inferiore, portando a una maggiore precisione e annullando la necessità di tecniche ex vivo per confermare i risultati in vivo . L'uso della PET in clinica consentirà ai medici di personalizzare la terapia per ogni paziente in base al carico individuale di cellule B.
L'ARG è particolarmente utile per l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione per consentire una delineazione più accurata della posizione spaziale del legame del tracciante in piccole regioni come il tronco encefalico e il cervelletto. Le stesse sezioni e/o sezioni adiacenti possono essere salvate per le colorazioni immunoistochimiche per confermare la presenza di cellule B. In precedenza abbiamo colorato i tessuti del SNC con CD45R/B220 (Figura supplementare S1) per correlare il numero di cellule B con il segnale PET e ARG 5,9. La colorazione può quindi essere confrontata spazialmente con i risultati dell'ARG per verificare che il segnale del radiotracciante corrisponda al modello di colorazione. I linfociti B possono essere presenti in grappoli o diffusamente in tutto il tronco encefalico; La sensibilità alla PET è sufficientemente elevata per misurare il segnale, il che è incoraggiante per la traduzione clinica. Per l'ARG del midollo spinale, la rimozione del midollo spinale dalle vertebre garantisce che il segnale misurato sia dovuto al legame del tracciante nel tessuto del midollo spinale piuttosto che nel midollo osseo e/o nel sangue, che può oscurare le immagini PET a causa degli effetti parziali del volume.
Analogamente all'ARG, il conteggio gamma ex vivo consente di quantificare il segnale radioattivo nei singoli organi. Per questa particolare tecnica, è importante misurare il peso umido dei tessuti e assicurarsi che si trovino sul fondo delle rispettive provette prima di posizionare le provette nel contatore gamma. Le provette devono essere etichettate con il numero del topo e il tessuto, in modo che venga utilizzata la provetta corretta; La provetta viene quindi pesata su una bilancia calibrata e gli organi vengono inseriti con l'approssimazione del decimo di microgrammo (0,0001 mg). Alcuni tessuti sono estremamente piccoli e la differenza nella massa del tubo prima e dopo sarà dell'ordine di 0,0001 mg. I tessuti devono essere pesati immediatamente dopo la dissezione per evitare la perdita di umidità, che si traduce in una massa inferiore. Dopo la pesatura, i tubi del cervello e del midollo spinale devono essere riempiti con PBS per evitare che si secchino prima di congelare questi tessuti per l'ARG.
L'anticorpo CD19 è stato fornito da Horizon Therapeutics.
Siamo grati per il supporto della struttura di imaging per piccoli animali SCi3 di Stanford e del Dr. Frezghi Habte per la sua assistenza tecnica con la PET/CT. LC-MS viene eseguita dal personale principale della struttura centrale di spettrometria di massa dell'Università di Stanford (SUMS) e apprezziamo il personale per aver fornito questo servizio. Ringraziamo Horizon Therapeutics per aver gentilmente fornito l'anticorpo monoclonale hCD19 e Jodi Karnell in particolare per la sua guida tecnica e il suo supporto. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH NINDS (1 R01 NS114220-01A1).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 mL 50 kDa MWCO Centrifugal filter | MiliporeSigma | UFC505008 | centrifugal filter |
64Cu-CuCl3 | Washington University in St. Louis; University of Wisonsin, Madison; or another vendor | ||
AR-2000 Radio-TLC Imaging Scanner | Eckert & Ziegler | AR-2000 | |
Autoradiography cassette | Cole Palmer | EW-21700-34 | Aluminum, 8" x 10" |
Autoradiography film | GE Life Sciences | 28-9564-78 | Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 x 25 cm, screen only |
Butterfly Needle Catheter | SAI Infusion Technologies | BLF-24 | |
DOTA-NHS-ester | Macrocyclics | B-280 | |
EAE Induction Kit | Hooke Laboratories | EK-2160 | |
Geiger Counter | Ludlum | 14C | |
GNEXT PET/CT Scanner | Sofie | GNEXT | |
Hidex Automatic Gamma Counter | Hidex | AMG | |
HPLC Column | Phenomenex | 00H-2146-K0 | 5 μm SEC-s3000 400 Å, 300 x 7.8 mm |
Illustra NAP-5 column | Cytiva | 17085301 | DNA gravity column |
Image J | NIH | ARG analysis software | |
Low Protein Binding Collection Tubes (1.5 mL) | Thermo Scientific | PI90410 | |
NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840281400 | UV-Vis micro/nano-spectrophotometer |
PCR tubes 0.2 mL, for DNA grade | Eppendorf | 30124707 | |
Typhoon phosphor imager 9410 | GE Healthcare | 8149-30-9410 | |
VivoQuant | Invicro | Version 4 Patch 3 | PET Analysis Software; must purchase brain atlas add-on |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | PI89882 | Desalting column |
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