Microiniezione di zigote per la creazione di alleli knock-in e flox a cassetta genica nei topi

Riepilogo

Il presente protocollo descrive la microiniezione di zigote di CRISPR-Cas9 e DNA del donatore per produrre in modo efficiente topi knock-in e floxed con cassette geniche.

Abstract

La tecnologia CRISPR-Cas ha permesso la generazione rapida e senza sforzo di topi geneticamente modificati. In particolare, topi e topi mutanti puntiformi sono prontamente prodotti dall'elettroporazione di fattori CRISPR (e donatori di DNA oligo a singolo filamento) nello zigote. Al contrario, i topi knock-in e floxed con cassetta genica (>1 kb) sono generati principalmente dalla microiniezione di fattori CRISPR e donatori di DNA a doppio filamento negli zigoti. Le tecnologie di modifica del genoma hanno anche aumentato la flessibilità della produzione di topi geneticamente modificati. È ora possibile introdurre le mutazioni previste nelle regioni genomiche bersaglio in una serie di ceppi di topi inbred benefici. Il nostro team ha prodotto oltre 200 linee di topi knock-in su cassetta genetica e oltre 110 linee di topi floxed mediante microiniezione di zigote di CRISPR-Cas9 a seguito di richieste da diversi paesi, incluso il Giappone. Alcuni di questi editing del genoma utilizzavano ceppi inbred BALB/c, C3H/HeJ e C57BL/6N, tuttavia la maggior parte utilizzava C57BL/6J. A differenza del metodo di elettroporazione, l'editing del genoma mediante microiniezione di zigote in vari ceppi consanguinei di topi non è così facile. Tuttavia, i topi knock-in e floxed su singoli background genetici inbred sono critici quanto i modelli murini genetici umanizzati, fluorescenti e knockout condizionali. Pertanto, questo articolo presenta il protocollo per la microiniezione di zigote di fattori CRISPR e donatori di DNA a doppio filamento in topi C57BL / 6J per la generazione di topi knock-in e floxed con cassette geniche. Questo articolo si concentra esclusivamente sull'iniezione nucleare piuttosto che sull'iniezione citoplasmatica. Oltre alla microiniezione di zigote, delineiamo la tempistica per il processo di produzione e le tecniche periferiche come l'induzione della superovulazione e il trasferimento di embrioni.

Introduzione

I topi knock-in, in cui i geni esogeni previsti vengono introdotti nei loci bersaglio, sono ampiamente utilizzati in molti studi in vivo come topi umanizzati dal gene, topi reporter fluorescenti e topi driver Cre ^1,2. Quando le mutazioni knock-in sono indotte dall'editing del genoma negli zigoti di topo, il DNA a singolo filamento (donatori di DNA oligo a singolo filamento, ssODN) o DNA a doppio filamento (dsDNA) viene utilizzato come DNA donatore ^2,3. ssODN è usato principalmente per eliminare frammenti genetici relativamente corti inferiori a 200 bp⁴. È possibile inserire frammenti più lunghi di 1 kb di DNA usando ssODN lunghi (lsODN)^5,6, tuttavia la loro preparazione richiede molto tempo. Quando vengono utilizzati donatori di dsDNA, è possibile generare topi knock-in con cassetta genica (>1 kb) senza laboriosa preparazione del DNA del donatore⁷.

Il vantaggio principale dell'utilizzo di ssODN è che l'elettroporazione⁸ può generare topi knock-in. Tuttavia, i donatori di dsDNA devono essere introdotti direttamente nel nucleo mediante microiniezione di zigote. Il knock-in simultaneo in due siti è necessario per creare topi floxed, in cui ogni sequenza loxP viene eliminata a monte e a valle del gene bersaglio. Ci sono due modi per generare topi floxati mediante l'editing del genoma negli zigoti di topo: usando due ssODN indipendenti, ciascuno con un singolo sito loxP, o usando un singolo dsDNA (o lsDNA) con una sequenza floxata; Il primo è molto inefficiente 9,10,11. L'editing del genoma utilizzando donatori di dsDNA è l'approccio più semplice per produrre topi knock-in e floxed con cassette geniche se l'ambiente è favorevole alla microiniezione di zigote.

Inizialmente, miscele di Cas9 mRNA e sgRNA o vettori DNA che codificano sgRNA e Cas9 sono utilizzati per l'editing del genoma negli zigoti di topo^12,13. Poiché le proteine Cas9 stabili e di alta qualità sono ora disponibili a basso costo, l'introduzione della ribonucleoproteina crRNA-tracrRNA-Cas9 (RNP) negli zigoti di topo¹⁴ è diventata popolare. Recentemente, topi knock-in sono stati generati con elevata efficienza introducendo il crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP e il DNA del donatore in entrambi i pronuclei degli zigoti di topo in una fase del ciclo cellulare in cui è più probabile che si verifichi knock-in¹⁵. Pertanto, il presente protocollo descrive le tecniche per produrre vari tipi di topi knock-in con questo metodo.

Ci sono molti ceppi inbred utili di topi da laboratorio¹⁶. La modificazione genetica all'interno del background inbred può ignorare l'influenza del background genetico sul fenotipo. Questo articolo descrive un metodo per indurre mutazioni knock-in e floxed nella cassetta genica dello zigote della linea di topi inbred più comunemente usata, il C57BL/6J¹⁷. Inoltre, vengono discussi anche i tempi per la generazione di topi geneticamente modificati e le tecniche periferiche utilizzate, compresa l'induzione della superovulazione e il trasferimento di embrioni.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti umanamente con l'approvazione del Comitato istituzionale per gli esperimenti sugli animali dell'Università di Tsukuba, secondo i regolamenti per gli esperimenti sugli animali dell'Università di Tsukuba e le linee guida fondamentali per la corretta conduzione degli esperimenti sugli animali e delle attività correlate negli istituti di ricerca accademici sotto la giurisdizione del Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, sport, scienza e tecnologia del Giappone. Topi C57BL/6J di entrambi i sessi, di età compresa tra 10 e 25 settimane, sono stati utilizzati come donatore di zigote. I topi ICR (di età superiore alle 10 settimane) sono stati utilizzati come topi riceventi. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).

1. Conferma dell'attività di scissione del crRNA in un sistema cell-free

1. Sciogliere 2 nmol di crRNA (secco) e 20 nmol di tracrRNA (secco) rispettivamente in 25 μL e 250 μL di acqua priva di RNasi (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Le sequenze target CRISPR che si prevedeva avessero un'elevata attività di scissione e il minor numero possibile di off-target vengono selezionate utilizzando CRISPOR (vedere Tabella dei materiali). Nel caso di knock-in di cassette geniche, indirizzare la sequenza attraverso il sito di inserimento. Gli esoni da floxare sono stati selezionati utilizzando il KOnezumi (vedi Tabella dei materiali).
2. Amplificare il frammento di DNA (circa 0,5-1 kb) contenente il sito bersaglio mediante PCR genomica⁹. Purificare questo amplicone PCR con il comune kit di estrazione del prodotto PCR (vedere Tabella dei materiali).
3. Preparare 10 μL di miscela CRISPR (100 ng/μL di crRNA, 150 ng/μL di tracrRNA e 1 ng/μL di Cas9 nel Cas9 Nuclease Reaction Buffer, vedere Tabella dei materiali). Per costruire il complesso CRISPR-Cas9, posizionare la miscela CRISPR in un blocco termico a 37 °C per 30 minuti.
4. Aggiungere il volume totale (10 μL) della miscela CRISPR al prodotto PCR (10 μL, 20 ng/μL) descritto al punto 1.2 e incubare a 37 °C per 1 ora. Aggiungere 1 μL di RNasi (500 ng/μL) per degradare il crRNA e il tracrRNA a 37 °C per 30 minuti, poiché gli RNA devono essere assenti durante l'elettroforesi. Eseguire l'elettroforesi dei campioni di cui sopra utilizzando colorante di carico contenente sodio dodecilsolfato (2% p/v).
   NOTA: In rari casi, si osservano crRNA senza attività di scissione. In questi casi, si consiglia di riprogettare il progetto di modifica del genoma.

2. Preparazione della miscela di crRNA, tracrRNA, proteina Cas9 e DNA del donatore per microiniezione di zigote

1. Preparare la soluzione CRISPR (50 ng/μL di crRNA, 200 ng/μL di tracrRNA e 200 ng/μL di Cas9 in acqua priva di RNasi). Preparare una soluzione di DNA del donatore (20 ng/μL di vettore di DNA plasmidico autocostruito).
   1. Filtrare la soluzione di DNA del donatore attraverso un filtro a siringa sterile con una dimensione dei pori di 0,22 μm. Mescolare volumi uguali di soluzione CRISPR e soluzione di DNA di donatore filtrato. Assicurarsi che la concentrazione finale di ciascuno sia 25 ng/μL di crRNA, 100 ng/μL di tracrRNA, 100 ng/μL di Cas9 e 10 ng/μL di DNA del donatore. Questa miscela sarà in seguito denominata RNPD.
      NOTA: Quando si tagliano due siti, come durante la produzione di topi floxed, la concentrazione di ciascun crRNA deve essere di 25 ng/μL. Il DNA del donatore è un DNA plasmidico circolare e può essere purificato con un comune mini kit di colonne spin di preparazione (vedi Tabella dei materiali). La soluzione preparata deve essere posta su ghiaccio e utilizzata per la microiniezione il prima possibile.

3. Ottenere zigoti di topi mediante accoppiamento naturale

1. Iniettare 5 UI di gonadotropina sierica della cavalla gravida (PMSG; vedere Tabella dei materiali) per via sottocutanea in topi femmina C57BL/6J (10-25 settimane di età) 3 giorni prima della microiniezione. Circa 46-48 ore dopo, somministrare 5 UI di gonadotropina corionica umana (hCG, vedi Tabella dei materiali) per via intraperitoneale. Co-ospitare i topi femmina trattati con PMSG e hCG con topi maschi C57BL / 6J e controllare i tappi vaginali la mattina seguente.
   NOTA: È possibile ottenere circa 15-25 zigoti da un topo femmina C57BL/6J. La sequenza temporale è illustrata nella Figura 1.
2. Preparare due piastre di Petri da 35 mm per la coltura dello zigote, come mostrato nella Figura 2. Metterli nell'incubatore (37 °C, 5% CO₂) fino all'uso. Questi possono essere conservati durante la notte.
3. Eutanasia i topi femmina con tappi vaginali confermati dalla dislocazione cervicale e, usando piccole forbici, incidere attraverso la pelle addominale e lo strato muscolare dalla linea mediana dell'addome inferiore a sotto le costole.
   NOTA: Seguire le raccomandazioni del comitato etico animale locale per l'eutanasia.
4. Raccogliere gli ovidotti e metterli in una goccia da 20 μL di terreno M2 contenente 0,75 mg/ml di ialuronidasi (vedi Tabella dei materiali) sul coperchio della capsula di Petri. Prelevare un ovidotto con una pinza a punta fine e perfondere circa 50 μL di terreno M2 con ialuronidasi attraverso le fimbrie.
   NOTA: In questo momento, gli zigoti sono vagamente circondati da numerose cellule cumuliformi.
5. Dopo 30 s, raccogliere zigoti morfologicamente normali con una piccola quantità di terreno usando un capillare di vetro e lavarli trasferendoli in goccioline medie M16 fresche. Trasferire gli zigoti lavati in una capsula di Petri (Figura 2) per il pooling.
   NOTA: la sequenza temporale è illustrata nella Figura 1. Gli zigoti morfologicamente normali hanno un pronucleo maschile e femminile e due corpi polari che non hanno gravemente compromesso la forma sferica¹⁵. La morfologia dello zigote varia considerevolmente tra ceppi e specie.
6. Ripetere i passaggi 3.3 e 3.4 fino a recuperare tutti gli zigoti. Circa 100 zigoti possono essere raggruppati in una goccia M16 nel piatto di coltura. Conservare il piatto nell'incubatore (37 °C, 5% CO₂) fino alla microiniezione.

4. Preparazione dell'ago per microiniezione

1. Tirare alcune pipette di vetro utilizzando l'estrattore di pipette programmabile (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Gli aghi per microiniezione devono avere una punta sottile e una lunga conicazione. Se l'estrattore ha un programma per la produzione di aghi per l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi, lo stesso programma può essere utilizzato per produrre aghi per microiniezione.
2. Rompere la punta dell'ago di microiniezione colpendo la sfera di vetro attaccata alla punta della microforgiatura. Assicurarsi che la dimensione della punta dell'ago per microiniezione abbia un diametro di circa 1 μm. Controllare le dimensioni della punta al microscopio con un ingrandimento di 1000x.
3. Piegare l'ago per microiniezione a circa 2-3 mm dalla punta usando una microforgia.
   NOTA: l'angolo della piegatura dipende dalla configurazione del micromanipolatore. Troppa flessione ridurrà l'efficacia dell'impulso piezoelettrico.

5. Microiniezione di zigote

1. Iniettare 1-1,5 cm del liquido operativo (corpo inerziale necessario affinché l'effetto piezoelettrico faccia dei fori in alternativa al mercurio, vedere Tabella dei materiali) al centro dell'ago di microiniezione e collegarlo al supporto del microiniettore manuale con l'attuatore piezoelettrico.
   1. Inoltre, collegare l'ago di tenuta al supporto del microiniettore manuale opposto. Spostare il liquido operativo sulla punta dell'ago di microiniezione con pressione graduale. Fissare entrambi i supporti del microiniettore manuale sul micromanipolatore.
      NOTA: Il liquido operativo che esce dalla punta dell'ago di microiniezione può essere osservato al microscopio con un ingrandimento di 50x. Dopo aver regolato la quantità di liquido emesso, è possibile osservare gli spruzzi di liquido quando vengono applicati gli impulsi piezoelettrici, confermando che gli impulsi piezoelettrici sono efficaci. Se ciò non può essere confermato, preparare nuovamente l'ago per microiniezione.
2. Preparare una camera di iniezione con tre goccioline: (1) 10 μL di terreno M2; (2) 5 μL di polivinilpirrolidone (PVP) al 12% in mezzo M2; e (3) una miscela da 5 μL di crRNA, tracrRNA, proteina Cas9 e soluzione di DNA del donatore (RNPD). Coprire le goccioline con olio minerale nello stesso modo del punto 3.2 e posizionare la camera di iniezione sullo stadio del microscopio invertito.
   1. Sotto il microscopio invertito con un ingrandimento di 50x, abbassare la pipetta di microiniezione nella goccia PVP del 12%. Aspirare ed erogare PVP al 12% per pulire l'interno della punta dell'ago di microiniezione e trasferirlo alla goccia di RNPD.
3. Mettere il microiniettore manuale a pressione negativa e aspirare la soluzione di RNPD nell'ago per microiniezione. Attendere alcuni minuti fino a quando non viene aspirato un volume sufficiente; Sotto un microscopio ingrandito 50x, riempire l'intero interno dell'ago di microiniezione con liquido.
   1. Interrompere l'assunzione e consentire l'espulsione graduale della soluzione di RNPD impostando il microiniettore manuale a pressione positiva. Spostare la punta dell'ago di microiniezione nell'olio.
      NOTA: ruotare la manopola del microiniettore manuale in senso antiorario per l'inalazione. Per fermare l'inalazione, ruotare la manopola in senso orario e aumentare gradualmente la pressione osservando al microscopio. La soluzione RNPD verrà gradualmente drenata. Il movimento del livello del liquido nell'ago di microiniezione consente la conferma del deflusso.
4. Inserire 50 zigoti nella goccia M2 e abbassare delicatamente la pipetta di tenuta nella stessa goccia. Trasferire l'ago per microiniezione alla goccia M2 contenente zigoti. Passare a un obiettivo 20x e concentrarsi sulla punta della pipetta di microiniezione.
   NOTA: Mettere il maggior numero di zigoti che possono essere iniettati in 10 minuti.
5. Tieni uno zigote e concentrati sul pronucleo muovendo il micromanipolatore. Inserire l'ago per microiniezione nello zigote e avvicinare la punta al pronucleo. Una volta che la punta raggiunge la membrana del pronucleo, applicare l'impulso piezoelettrico (intensità: 6-10, velocità: 1) per perforare.
   1. Quando l'ago di microiniezione perfora il pronucleo, iniettare la soluzione di RNPD e osservare il gonfiore del pronucleo. Una volta che il pronucleo è completamente gonfiato, estrarre rapidamente l'ago. Eseguire la stessa procedura su entrambi i pronuclei femminili e maschili.
      NOTA: L'inflazione del pronucleo per iniezione può essere chiaramente vista al microscopio. Il grado di questa inflazione è difficile da verbalizzare, ma può essere confermato facendo riferimento a rapporti precedenti¹⁵.
6. Spostare lo zigote iniettato in un'altra posizione all'interno della goccia M2 per identificare gli zigoti prima e dopo l'iniezione.
7. Ripetere i passaggi 5.5-5.6 fino a quando tutti gli zigoti nella goccia M2 sono stati iniettati. Dopo l'iniezione, trasferire gli zigoti in un piatto M16 fresco.
8. Selezionare lo zigote sopravvissuto 10 minuti dopo l'iniezione. Rimuovere gli zigoti lisati danneggiati dall'iniezione e distribuire zigoti sopravvissuti a ciascuna goccia nel piatto M16. Ogni goccia deve contenere 20-24 zigoti per una femmina pseudogravida. Ciò riduce il tempo in cui il piatto M16 viene esposto all'ambiente esterno all'incubatore durante il trasferimento dell'embrione.
   NOTA: In condizioni ottimali di iniezione, il tasso di sopravvivenza è del 90% -95%. Ciò dipende dalle dimensioni della punta dell'ago, dalla forza dell'impulso piezoelettrico e dalla pressione di deflusso della soluzione RNPD.

6. Trasferimento dell'embrione nell'ovidotto

1. Per ottenere topi pseudogravidi, accoppiare ogni topo ICR femmina nella fase di proestro con un topo ICR maschio vasoligato. Controlla le spine il giorno seguente.
   NOTA: Circa 15 topi pseudogravidi sono ottenuti da 20 coppie di accoppiamento.
2. Somministrare tre tipi di agenti anestetici misti (0,2 mg/kg di medetomidina, 4,0 mg/kg di midazolam e 2,5 mg/kg di butorfanolo, vedere Tabella dei materiali) per via sottocutanea alle femmine di topo pseudogravide. Confermare l'anestesia appropriata con una diminuzione della frequenza respiratoria e la scomparsa dei riflessi di ritiro del pizzico della coda e del pedale posteriore. Applicare unguento oftalmico per lubrificare gli occhi secondo le raccomandazioni del comitato etico animale locale.
3. Dopo aver rasato la regione dorsale del topo in posizione prona e disinfettato l'area chirurgica tre volte, alternando uno scrub a base di iodio o clorexidina e alcool, incidere la pelle dorsale di circa 1 cm lungo la colonna vertebrale con piccole forbici da dissezione.
4. Spostare la ferita dell'incisione dorsale su un lato ventralmente, incidere lo strato muscolare attraverso il quale l'ovaio può essere visto, afferrare il grasso sopra l'ovaio con una pinzetta e ritirare l'ovaio, l'ovidotto e l'utero.
   1. Fissare il grasso con un morsetto serrefine (vedi Tabella dei materiali). Posizionare i tessuti riproduttivi su una garza sterile per evitare il contatto diretto con il mantello.
5. Nell'ordine seguente, posizionare una piccola quantità di terreno di coltura (M2 o M16), alcune bolle d'aria come marcatore e gli zigoti in una pipetta per il trasferimento.
   NOTA: Trasferire circa 10-12 zigoti per ovidotto.
6. Fare un'incisione usando un micro taglio (vedi Tabella dei materiali) tra l'ampolla e le fimbrie dell'ovidotto (giusto il tempo necessario per consentire alla pipetta di vetro di entrare), introdurre gli zigoti nell'incisione e contemporaneamente confermare che la bolla d'aria è stata introdotta.
7. Eseguire l'impianto nell'altro ovidotto in modo simile (fase 6.6).
8. Suturare la pelle esterna con autoclip (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Non suturare lo strato muscolare inciso a meno che la ferita da incisione non sia inevitabilmente grande. La dimensione ideale dello strato muscolare inciso dovrebbe essere inferiore a 2-3 mm. Se l'incisione è superiore a 5 mm, lo strato muscolare deve essere suturato utilizzando un ago e un filo di sutura sterilizzati (vedi Tabella dei materiali).

7. Recupero degli animali

1. Somministrare atipamezolo cloridrato (0,3 mg/kg) per via sottocutanea ai topi.
   NOTA: Seguire le raccomandazioni del comitato etico animale locale per l'analgesia post-operatoria.
2. Quindi, mettere i topi in gabbia e tenerli caldi su una piastra calda a 37 ° C.
3. Dopo che i topi sono stati svegliati, tenerli al caldo per circa 2 ore. Dopo aver confermato che non vi è stato alcun comportamento anomalo dei topi, riportare le gabbie al rack di allevamento.

Risultati

I risultati di produzione di topi knock-in e floxed con cassetta genica che utilizzano questo protocollo sono mostrati nella Tabella 1 e nella Tabella 2. I geni bersaglio non sono stati dichiarati perché ogni linea di topo modificata dal genoma è attualmente utilizzata in un progetto indipendente e non pubblicato. Invece, sono state descritte le regioni cromosomiche bersaglio.

Le analisi di genotipizzazione sono state eseguite utilizzando un metodo precedentemente riportato¹⁸. In questo metodo di genotipizzazione, i topi in cui il DNA del donatore viene inserito in siti cromosomici non intenzionali non vengono conteggiati come individui positivi, anche se viene indotto l'editing del genoma desiderato. Quindi, è stata mostrata l'efficienza produttiva dei topi fondatori che sono veramente utili per scopi reali, piuttosto che l'efficienza dell'editing del genoma stesso.

L'efficienza mediana di produzione di 13 topi knock-in con cassette geniche indipendenti è stata del 20,8%, con un massimo del 39,5% e un minimo del 7,9% (Tabella 1). Questa efficienza è stata considerata sufficientemente pratica. Tutti i geni embrionali letali non sono stati presi di mira durante il knock-in della cassetta genica. Il tasso mediano di natalità in questa condizione di targeting genico non letale è stato del 34,0% (massimo 43,3% e minimo 15,9%). Poiché questo è paragonabile al tasso di natalità nel trasferimento di embrioni senza manipolazione genetica, abbiamo ritenuto improbabile che la tossicità degli elementi di modifica del genoma introdotti e il danno fisico della microiniezione di zigote influenzino lo sviluppo embrionale.

L'efficienza produttiva mediana dei 10 topi floxed indipendenti è stata del 7,7%, con un massimo del 20,7% e un minimo del 2,1% (Tabella 2). Sebbene le funzioni di diversi geni bersaglio fossero sconosciute, il tasso di natalità mediano era del 30,2%, con un massimo del 43,8% e un minimo del 17,3%. Questo tasso era paragonabile a quello dei topi knock-in con cassetta genica, suggerendo che l'operazione di microiniezione ha un effetto trascurabile sullo sviluppo embrionale dei topi floxed.

Figura 1: Cronologia della microiniezione di zigote. Il colore bianco e scuro mostra rispettivamente il ciclo chiaro e scuro. I topi sono stati mantenuti sotto un ciclo di 14 ore di luce / 10 ore di buio. PMSG: gonadotropina sierica della cavalla gravida; hCG: gonadotropina corionica umana Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Preparazione di piatti di coltura. (A) Piatto di coltura per gli zigoti prima dell'iniezione. Posizionare due gocce di M16 medio (20-25 μL per ciascuna) in una capsula di Petri di plastica da 35 mm. (B) Piatto di coltura per gli zigoti dopo l'iniezione. Posizionare 10 gocce (10-20 μL per ogni goccia) di M16 in una capsula di Petri di plastica da 35 mm. Le gocce sono ricoperte di olio minerale (3 ml). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Regione cromosomica mirata	Numero di						Lunghezza inserimento knock-in (kb)	Omologia lunghezza braccio (kb)
	Embrioni		Neonati	Esaminati (svezzamenti)	Knock-in senza rTG	rTGc
	Iniettato	Trasferito						5' braccio	3' braccio
2qE2	349	331	114 (34,4%)a	114	9 (7,9%)b	5 (4,4%)d	1.0	1.0	1.0
2qE2	231	215	78 (36,3%)a	74	15 (20,3%)b	23 (31,1%)d	2.2	1.0	1.1
5qG2	288	262	90 (34,4%)a	81	19 (23,5%)b	18 (22,2%)d	1.6	2.0	2.0
6qB1	278	259	58 (22,4%)a	46	11 (23,9%)b	11 (23,9%)d	4.2	1.2	1.0
6qE3 [ROSA26]	295	277	97 (35,0%)a	23	2 (8,7%)b	4 (17,4%)d	6.5	1.1	3.0
6qE3 [ROSA26]	246	219	87 (39,7%)a	83	22 (26,5%)b	18 (21,7%)d	5.8	1.1	3.0
7qF5	279	268	116 (43,3%)a	114	45 (39,5%)b	44 (38,6%)d	1.4	3.1	1.0
11qB4	405	353	56 (15,9%)a	47	8 (17,0%)b	12 (25,5%)d	1.7	1.0	0.8
11qD	310	294	100 (34,4%)a	98	15 (15,3%)b	76 (77,6%)d	1.0	1.8	2.4
12qE	368	320	86 (26,9%)a	84	12 (14,3%)b	19 (22,6%)d	3.4	1.1	1.3
12qF1	315	265	76 (28,7%)a	72	17 (23,6%)b	28 (38,9%)d	1.0	1.1	1.1
14qE5	256	215	48 (22,3%)a	48	11 (22,9%)b	21 (43,8%)d	3.1	1.0	0.9
14qE5	287	285	85 (29,8%)a	72	15 (20,8%)b	19 (26,4%)d	2.6	1.0	0.9

Tabella 1: Produzione di topi knock-in mediante microiniezione. La tabella mostra il tasso di natalità e l'efficienza della produzione di topi che portano l'allele knock-in previsto senza (W / O) integrazione casuale (rTG) del DNA del donatore. È stato possibile ottenere topi con l'allele knock-in previsto in tutti i progetti. a: Numero di neonati/Numero di embrioni trasferiti; b: Numero di alleli knock-in trasportati topi/numero di topi esaminati; c: non è certo se ci sia un allele voluto; d: Numero di topi trasportati dall'allele rTG/numero di topi esaminati; rTG: integrazione casuale del vettore donatore. W/O: senza.

Regione cromosomica mirata	Numero di					Lunghezza floxed (KB)	Omologia lunghezza braccio (kb)
	Embrioni		Neonati	Esaminati (svezzamenti)	floxed W/O rTG
	Iniettato	Trasferito					5' braccio	3' braccio
3qC	325	313	93 (29,7%)a	87	9 (10,3%)b	1.3	1.2	1.1
4qB1	210	200	36 (18,0%)a	29	6 (20,7%)b	1.6	1.2	0.9
4qC4	272	256	112 (43,8%)a	100	5 (5,0%)b	2.4	1.0	1.4
5qF	143	137	40 (29,2%)a	40	6 (15,0%)b	1.8	1.0	1.1
5qF	255	227	80 (35,2%)a	76	2 (2,6%)b	1.3	1.1	0.9
9qE3.1	289	261	80 (30,7%)a	77	9 (11,7%)b	1.2	1.2	1.2
10qB3	284	269	88 (32,7%)a	78	3 (3,8%)b	1.3	1.1	0.9
10qC1	243	231	40 (17,3%)a	38	4 (10,5%)b	2.1	1.0	1.3
14qE5	390	372	139 (37,4%)a	135	5 (3,7%)b	1.1	0.8	0.9
17qA3.3	383	374	99 (26,5%)a	95	2 (2,1%)b	2.1	0.6	0.8

Tabella 2: Produzione di topi Floxed mediante microiniezione. La tabella mostra il tasso di natalità e l'efficienza della produzione di topi che portano l'allele flox previsto senza (W / O) integrazione casuale (rTG) del DNA del donatore. È stato possibile ottenere topi con l'allele flox previsto in tutti i progetti. a: numero di neonati/numero di embrioni trasferiti; B: Numero di topi portatori di alleli flox/numero di topi esaminati. rTG: integrazione casuale di o vettore donatore; W/O: senza.

Discussione

Nel presente studio, zigoti di topo C57BL / 6J freschi (non congelati-scongelati), ottenuti dall'accoppiamento naturale, sono stati utilizzati per la produzione di topi di editing del genoma. Iniettando crRNA-tracrRNA-Cas9 e DNA donatore (RNPD) in entrambi i pronuclei di questi zigoti in una fase del ciclo cellulare in cui è più probabile che si verifichi knock-in, sono stati generati topi knock-in e floxed con un alto tasso di natalità e una sufficiente efficienza di editing del genoma. L'attuale studio rafforza l'estensibilità del metodo SPRINT-CRISPR¹⁵, dove garantisce una sufficiente efficienza knock-in anche nel background genetico C57BL / 6J e può essere applicato alla produzione di topi floxed.

L'elettroporazione è un metodo altamente generalizzato per produrre topi modificati dal genoma a causa del basso costo dei dispositivi sperimentali e della facilità di apprendimento della tecnica⁸. Inoltre, il metodo i-GONAD¹⁹, in cui l'editing del genoma viene eseguito con embrioni preimpianto esistenti nell'ovidotto, non richiede un topo ricevente. Rispetto a questi metodi, il metodo attuale qui presentato è costoso e richiede tempo quando si prepara e si mantiene un ambiente sperimentale in termini sia di hardware che di software. Tuttavia, una volta che le strutture sperimentali sono state istituite, complessi topi knock-in e floxed possono essere prodotti con solo elementi CRISPR disponibili in commercio (crRNA, tracrRNA e proteina Cas9) e una semplice, piccola quantità di vettore plasmidico circolare da utilizzare come DNA donatore. Ciò significa che molte linee di topi complessi modificati dal genoma possono essere prodotte senza la necessità di lunghi (o relativamente costosi) lsODN ^5,6 o di vettori virali adeno-associati²⁰ per prepararsi.

A differenza del metodo originale SPRINT-CRISPR¹⁵, sono stati utilizzati zigoti freschi (congelati-scongelati). Quando si ottengono zigoti freschi mediante accoppiamento naturale, gli errori tecnici possono essere ignorati che possono verificarsi durante la fecondazione in vitro o il congelamento e lo scongelamento. Inoltre, il processo di manipolazione embrionale può essere completato in circa mezza giornata (Figura 1) seguendo l'approccio attuale. D'altra parte, alcune limitazioni del presente metodo includono il requisito di molti topi maschi, il controllo allentato dei tempi di fecondazione e la limitata capacità di prevedere completamente il numero di zigoti per la microiniezione. Rispetto al metodo originale SPRINT-CRISPR, questo metodo può avere un tasso di natalità più elevato (Tabella 1). Nonostante ciò, non si può concludere che il metodo attuale sia migliore in termini di tasso di natalità a causa delle differenze nei conduttori dell'esperimento, nei geni bersaglio, nei background genetici e nei tempi di conferma dell'embrione.

Come mostrato nella Tabella 1, un gran numero di topi nella maggior parte dei progetti di knock-in della cassetta genica avevano alleli di integrazione casuali. L'integrazione casuale deve essere eliminata perché può portare a interruzioni non intenzionali dei geni endogeni e all'espressione ectopica dei transgeni. La sfida per il futuro è trovare condizioni sperimentali che riducano il numero di eventi di integrazione casuali pur mantenendo un'efficienza knock-in sufficiente.

Quasi tutto l'editing del genoma dello zigote di topo che utilizza effettori di editing del genoma che provocano rotture del doppio filamento del DNA è probabile che induca mutazioni non intenzionali nei siti bersaglio ^9,21. I risultati di queste mutazioni non intenzionali sul bersaglio non sono descritti qui perché non siamo in una situazione in cui la prossima generazione di topi può essere gestita al fine di presentare prove chiare di loro. Il modo migliore per escludere la preoccupazione di confusione causata da mutagenesi non intenzionale sul bersaglio è quello di ottenere la prossima generazione di topi accoppiando i fondatori con topi wild-type piuttosto che incrociare i fondatori. In linea di principio, i topi N1 risultanti da questo incrocio sono wild-type (WT) su un lato dell'allele, quindi se viene rilevato l'allele knock-in (KI) previsto, sono eterozigoti WT / KI. Pertanto, la mutagenesi on-target non è un problema critico nel topo da laboratorio, che ha un ciclo di vita relativamente veloce ed è un animale prolifico. Tuttavia, saranno necessari ulteriori miglioramenti quando questa tecnologia sarà applicata a mammiferi relativamente grandi.

È stato confermato che questa tecnologia può produrre topi knock-in con cassette geniche in ceppi inbred diversi da C57BL/6J, ma un numero sufficiente di progetti non è protetto e i dati sono altamente variabili. Per questo motivo, queste informazioni non sono incluse nel presente studio. Si ritiene che saranno necessari ulteriori studi su questo argomento per far progredire la genetica dei topi e la ricerca sui modelli di malattia.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole Hydrochloride	ZENOAQ	-
Autoclip Wound Clip	BD	427631
Autoclip Wound Clip Applier	BD	427630
Butorphanol	Meiji Seika Pharma	-
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory Japan	-	older than 10 weeks old
Calibrated Pipet, 100ul	Drummond Scientific Company	2-000-100	for collecting zygote and embryo transfer
Cas9	Thermo Fisher Scientific	A36499
Cas9 Nuclease Reaction Buffer	NEB	B7203
CellTram 4r  oil	Eppendorf	5196000030
CRISPOR		http://crispor.tefor.net/	web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system
crRNA	IDT	-
Gel/PCR Extraction Kit	FastGene	FG-91302
hCG	ASKA Animal Health	-
Hyaluronidase	Merck Sigma-Aldrich	H3884
ICR mice	Jackson Laboratory Japan	-	older than 10 weeks old, weight 28 G or more
Inverted microscope	Leica
KOnezumi		https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html	a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice
M16 medium	Merck Sigma-Aldrich	M7292
M2 medium	Merck Sigma-Aldrich	M7167
Medetomidine	ZENOAQ	-
Micro shears	Natsume Seisakusho	MB-54-1
Microforge	Narishige	MF-900	for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle
Micromanipulator units	Narishige
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-1000	programmable pipette puller
Midazolam	Maruishi Pharmaceutical	-
MILLEX-GV 0.22 µm filter	Merck Millipore	SLGV033R
Mineral oil	Nacalai	26114-75	for zygote culture and injection chamber
Petri dish (35mm, untreated)	Iwaki	1000-035	for zygote culture
PIEZO micromanipulator	PRIME TECH	PMM-150
Plasmid Mini Kit	FastGene	FG-90502	mini prep spin column kit
PMM Operation Liquid	PRIME TECH	KIT-A	operation liquid for microinjection
PMSG	ASKA Animal Health	-
Polyvinylpyrrolidone	Merck Sigma-Aldrich	P5288
RNase	QIAGEN	19101
RNase Free Water	IDT	-	tracrRNA Accessory Reagents
Serrefine clamp	Natsume Seisakusho	C-18
Sodium dodecyl sulfate	SIGMA	151-21-3
Suture needle with thread	Natsume Seisakusho	C11-60B2
Thin wall borosilicate glass without filament	Sutter Instrument	B100-75-10	for microinjection needle and holding pipette
tracrRNA	IDT	-