Un metodo visivo sensibile per la rilevazione di batteri che producono idrogeno solforato

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare i batteri che producono idrogeno solforato con un protocollo modificato utilizzato per la precipitazione del solfuro di bismuto (BS). I principali vantaggi di questo metodo sono che è facile da valutare e non richiede attrezzature specializzate.

Abstract

L'idrogeno solforato (H₂S) è un gas tossico prodotto dai batteri nella proteolisi degli amminoacidi e delle proteine contenenti zolfo che svolge un ruolo importante nella salute umana. Il test di produzione di H₂S è uno dei più importanti test di identificazione biochimica batterica. I metodi tradizionali non sono solo noiosi e dispendiosi in termini di tempo, ma anche inclini all'inibizione della crescita batterica a causa dell'effetto tossico dei sali di metalli pesanti nel mezzo contenente zolfo, che spesso porta a risultati negativi. Qui, abbiamo stabilito un metodo semplice e sensibile per rilevare H₂S nei batteri. Questo metodo è una versione modificata della precipitazione del solfuro di bismuto (BS) che utilizza piastre di microtitolazione trasparenti a 96 pozzetti. La coltura batterica è stata combinata con una soluzione di bismuto contenente L-cisteina e coltivata per 20 minuti, al termine della quale è stato osservato un precipitato nero. Il limite di rilevamento visivo per H 2 S era di_0,2mM. Sulla base del cambiamento di colore visivo, è possibile ottenere il rilevamento semplice, ad alto rendimento e rapido dei batteri che producono H₂S. In sintesi, questo metodo può essere utilizzato per identificare la produzione di H₂S nei batteri.

Introduzione

I batteri che producono idrogeno solforato possono utilizzare aminoacidi e proteine contenenti zolfo per produrre idrogeno solforato (H₂S). La produzione di H₂S si verifica di solito nei batteri della famiglia Enterobacteriaceae gram-negativi e anche nei membri di Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. e Shewanella spp.1. Questi batteri hanno la capacità di ridurre il solfato in idrogeno solforato (H₂S) per ottenere energia. L'idrogeno solforato è stato implicato nello sviluppo della resistenza batterica ai farmaci. H 2 S protegge i batteri dalla tossicità delle specie reattive dell'ossigeno (ROS), antagonizzando così l'effetto antibatterico degli antibiotici ^2,3. H₂S ha anche un importante effetto fisiologico nel mantenimento dell'omeostasi. A livelli sovrafisiologici, H₂S ha dimostrato di essere profondamente tossico per il corpo. Nel corpo umano, H₂S ha un altro ruolo come molecola di segnalazione del gas che è coinvolta in una varietà di processi fisiologici e patologici. H₂S può regolare la funzione sistolica del cuore e svolge un importante ruolo fisiologico nel rilassare i vasi sanguigni, inibendo il rimodellamento vascolare e proteggendo il miocardio ^4,5. H₂S svolge anche un ruolo importante nella regolazione del sistema nervoso e del tratto digestivo ^6,7. È stato riscontrato che, quando esposti ad antibiotici battericidi, i batteri producono specie reattive letali dell'ossigeno (ROS) che portano alla morte cellulare 8,9,10,11.

Come test biochimico comune nei corsi di laboratorio microbiologici, il test dell'idrogeno solforato è un importante esperimento nell'identificazione di batteri, in particolare batteri della famiglia Enterobacteriaceae. Allo stato attuale, il test dell'idrogeno solforato viene solitamente eseguito su un gran numero di aminoacidi contenenti zolfo e mezzo di acetato di piombo inoculati con i batteri da testare. Dopo un periodo di incubazione (2-3 giorni), i risultati vengono giudicati osservando se il terreno di coltura o la striscia di carta di acetato di piombo è annerita a causa della produzione di acetato di piombo¹¹. Tuttavia, questi metodi tradizionali non sono solo noiosi e dispendiosi in termini di tempo, ma anche inclini all'inibizione della crescita batterica a causa dell'effetto tossico dei sali di metalli pesanti nel mezzo contenente zolfo, che spesso porta a risultati negativi. È stato stabilito un metodo basato sul bismuto per la rilevazione di H₂S^12,13. H₂S può reagire con il bismuto, formando precipitazioni di solfuro di bismuto nero. Al fine di condurre una riforma per questo test biochimico, è necessario stabilire un metodo semplice e rapido senza effetti collaterali sulla crescita batterica. Qui, abbiamo impostato un metodo semplice per la rilevazione di batteri che producono idrogeno solforato coltivati in un ambiente in vitro utilizzando il solfuro di bismuto come substrato in un formato di piastra di microtitolazione a 96 pozzetti.

Protocollo

1. Ceppi batterici

NOTA: Per questo esperimento, sono stati utilizzati nove ceppi standard, tra cui Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris e Klebsiella pneumoniae (Tabella 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa e Proteus vuigaris possono produrre H₂S, come delineato nella letteratura precedente¹.

1. Preparazione della coltura batterica
   1. Trasferire una colonia batterica di Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 e Klebsiella pneumoniae da una piastra di agar Luria-Bertani (LB) a 100 ml di terreno LB e coltura a 37 °C per 12-16 ore fino a quando la concentrazione batterica è di circa 1 x 10⁹ cellule/ml (come indicato da OD₆₀₀ = 1).
   2. Trasferire una colonia batterica di Fusobacterium nucleatum e Proteus vuigaris da piastre di agar di brodo di soia tripticase (TSB) a 100 ml di terreno TSB e coltura a 37 °C anaerobicamente per 24 ore fino a quando la concentrazione batterica è di circa 1 x 10⁹ cellule/ml (come indicato da OD₆₀₀ = 1).

2. Saggio di rilevamento H₂S

1. Test di produzione di idrogeno solforato
   1. Mescolare 100 μL di coltura batterica con 100 μL di soluzione di bismuto appena preparata (pH 8,0; 10 mM di cloruro di bismuto (III), 0,4 M di trietanolammina-HCl, 20 mM di piridossale 5-fosfato monoidrato, 20 mM EDTA e 40 mM di L-cisteina) nelle piastre di microtitolazione a 96 pozzetti e coltura per 20 minuti a 37 °C. Per ogni ceppo batterico, eseguire l'analisi in triplice copia.
   2. Dopo 20 minuti, controlla il cambio di colore. Se il colore della soluzione cambia da giallo chiaro a nero, ciò indica che il batterio è in grado di produrre H₂S. Ripetere questa misurazione 3x.
2. Sensibilità del metodo
   1. Determinare la sensibilità del metodo utilizzando diverse concentrazioni di idrosolfuro di sodio (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM e 0 mM, miscelati con la soluzione BS ¹⁴.
   2. Determinare la presenza di HS−/S²⁻ osservando la formazione di un precipitato nero di BS. Assegna un punteggio al colore dei pozzetti utilizzando una scala visiva da nessuna produzione di colore (-) alla produzione di colore nero più scuro (++++++).

Risultati

Rilevamento di batteri produttori di idrogeno solforato
Le prestazioni del test H₂S sono state studiate utilizzando colture pure di ceppi batterici selezionati, come elencato nella Tabella 1. I risultati hanno indicato che Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa e Proteus vuigaris possono produrre H₂S con precipitato BS nero, mentre Salmonella paratyphi A, Staphylococcu...

Discussione

Il test di produzione di idrogeno solforato è uno dei test fenotipici convenzionali per l'identificazione e la differenziazione dei ceppi batterici. Molte specie batteriche possono produrre idrogeno solforato nel loro ambiente naturale, come l'acqua acquatica. Queste specie batteriche includono Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., alcuni ceppi di Klebsiella sp., Escherichia coli e alcune specie di Clostridia anaerobici^15,16...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bismuth (III)chloride	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	7787-60-2
EDTA	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd	60-00-4
Enterococcus faecalis	ATCC	19433
Fusobacterium nucleatum	ATCC	25586
Klebsiella pneumoniae	ATCC	43816
L-cysteine	Amresco	52-90-4
Proteus vuigaris	CMCC	49027
Salmonella paratyphi A	CMCC	50001
Salmonella paratyphi B	CMCC	50094
Staphylococcus aureus	ATCC	25923
Triethanolamine-HCl	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.	637-39-8