Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول تحريض الالتهام الذاتي في الجسم الدهني ليرقات ذبابة الفاكهة عن طريق استنفاد المغذيات ويحلل التغيرات في الالتهام الذاتي باستخدام سلالات الذباب المعدلة وراثيا.

Abstract

الالتهام الذاتي هو عملية الهضم الذاتي الخلوية. يسلم البضائع إلى الجسيمات الحالة للتحلل استجابة للضغوط المختلفة ، بما في ذلك الجوع. يرتبط خلل الالتهام الذاتي بالشيخوخة والأمراض البشرية المتعددة. يتم الحفاظ على آلية الالتهام الذاتي بشكل كبير - من الخميرة إلى البشر. يوفر الجسم الدهني اليرقي لذبابة الفاكهة ، وهو نظير للكبد الفقاري والأنسجة الدهنية ، نموذجا فريدا لمراقبة الالتهام الذاتي في الجسم الحي. يمكن أن يحدث الالتهام الذاتي بسهولة عن طريق تجويع المغذيات في جسم الدهون اليرقية. يتم حفظ معظم الجينات المرتبطة بالالتهام الذاتي في ذبابة الفاكهة. تم تطوير العديد من سلالات الذباب المعدلة وراثيا التي تعبر عن علامات الالتهام الذاتي الموسومة ، مما يسهل مراقبة الخطوات المختلفة في عملية الالتهام الذاتي. يتيح التحليل النسيلي مقارنة وثيقة لعلامات الالتهام الذاتي في الخلايا ذات الأنماط الجينية المختلفة في نفس قطعة الأنسجة. يفصل البروتوكول الحالي إجراءات (1) توليد استنساخ جسدي في جسم الدهون اليرقية ، (2) تحفيز الالتهام الذاتي عن طريق تجويع الأحماض الأمينية ، و (3) تشريح جسم الدهون اليرقية ، بهدف إنشاء نموذج لتحليل الاختلافات في الالتهام الذاتي باستخدام علامة البلعمة الذاتية (GFP-Atg8a) والتحليل النسيلي.

Introduction

الالتهام الذاتي هو عملية "الأكل الذاتي" التي تسببها ضغوط مختلفة ، بما في ذلك تجويع الأحماض الأمينية1. الالتهام الذاتي الكبير (المشار إليه فيما يلي باسم الالتهام الذاتي) هو أكثر أنواع الالتهام الذاتي المدروسة جيدا ويلعب دورا لا غنى عنه في الحفاظ على التوازن الخلوي2. يرتبط خلل الالتهام الذاتي بالعديد من الأمراض البشرية3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بعض الجينات المرتبطة بالالتهام الذاتي هي أهداف محتملة لعلاج الأمراض المختلفة4.

يتم تنظيم الالتهام الذاتي بطريقة متطورة للغاية5. عند الجوع ، تقوم أغشية العزل بعزل المواد السيتوبلازمية لتشكيل البلعمة الذاتية مزدوجة الغشاء6. ثم تندمج البلعمة الذاتية مع الإندوسومات والليزوزومات لتكوين البرمائيات والليزوزومات. بمساعدة الإنزيمات المائية الليزوزومية ، تتحلل محتويات السيتوبلازم المبتلع ، ويتم إعادة تدوير العناصر الغذائية7.

الالتهام الذاتي هو عملية محفوظة تطوريا8. ذبابة الفاكهة الميلانية هي نموذج رائع لدراسة عملية الالتهام الذاتي في الجسم الحي. يؤدي تجويع الأحماض الأمينية بسهولة إلى الالتهام الذاتي في أنسجة الجسم الدهنية الذبابة ، وهو نظير للكبد البشري والأنسجة الدهنية9. تؤدي العيوب في الالتهام الذاتي إلى تعطيل أنماط النقاط المميزة للعديد من البروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي ، مثل Atg8 و Atg9 و Atg18 و Syx17 و Rab7 و LAMP1 و p62 ، من بين أمور أخرى10. لذلك ، فإن تحليل أنماط علامات الالتهام الذاتي هذه سيساعد في تمييز حدوث عيوب الالتهام الذاتي وخطوة الالتهام الذاتي المعيبة. على سبيل المثال ، البروتين الشبيه باليوبيكويتين Atg8 هو علامة الالتهام الذاتي الأكثر استخداما11. في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، تم تطوير سلالات معدلة وراثيا مع بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الموسوم Atg8a بنجاح12. ينتشر GFP-Atg8a في السيتوسول والنوى في الخلايا المغذية. عند الجوع ، تتم معالجة GFP-Atg8a وتعديلها بواسطة فوسفاتيديل إيثانولامين (PE) وتشكل نقطة ، والتي تسمي أغشية العزل والبلعمة الذاتية المطورةبالكامل 13,14. من خلال الفحص المجهري الفلوري المباشر ، يمكن ملاحظة تحريض الالتهام الذاتي بسهولة كزيادة في تكوين النقاط GFP-Atg815. لن تتشكل Atg8a puncta استجابة للمجاعة في وجود عيب في بدء الالتهام الذاتي. نظرا لأنه يمكن إخماد GFP-Atg8a وهضمه بواسطة انخفاض درجة الحموضة في الجسيمات الذاتية ، فقد تزداد أرقام GFP-Atg8a puncta إذا تم حظر الالتهام الذاتي في المراحلالمتأخرة 16.

نظرا لأن الالتهام الذاتي حساس للغاية لتوافر التغذية17 ، فإن الاختلافات الطفيفة في ظروف الثقافة غالبا ما تؤدي إلى اختلافات في الأنماط الظاهرية. لذلك ، فإن التحليل النسيلي ، وهو طريقة تحلل الخلايا الطافرة مقابل خلايا التحكم من النوع البري في نفس النسيج ، له ميزة كبيرة في تشريح عيوب الالتهام الذاتي18. من خلال الاستفادة من هدف التعرف على flippase / flippase (FLP / FRT) بوساطة إعادة التركيب الخاصة بالموقع بين الكروموسومات المتماثلة ، يتم تصنيع الذباب الذي يحمل أنسجة الفسيفساء بسهولة19,20. تشكل الخلايا البرية المحيطة بالخلايا الطافرة تحكما داخليا مثاليا لتجنب الاختلافات الفردية21.

تصف الدراسة الحالية كيفية تحفيز الالتهام الذاتي عن طريق تجويع الأحماض الأمينية وتوليد أنسجة الجسم الدهنية الفسيفسائية التي تعبر عن GFP-Atg8a. يمكن استخدام هذه البروتوكولات لتحليل الاختلافات في الالتهام الذاتي بين الحيوانات المستنسخة الطافرة.

Protocol

1. عبور ذبابة الفاكهة ووضع البيض

  1. إدخال 3 ذكور (النمط الجيني hsFLP ubiRFP FRT19A ؛ cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) و 15 أنثى (النمط الجيني y 'w * Mu FRT19A / FM7 ، Kr GFP ) ذباب بالغ (انظر جدول المواد) في قنينة استزراع (مع دقيق الذرة القياسي / دبس السكر / أجار ذبابة الفاكهة الوسطى عند 25 درجة مئوية) للتزاوج.
    ملاحظة: يجب إعداد قوارير استزراع متعددة من نفس التهجين لضمان وجود يرقات كافية لمزيد من التجارب. سلالة الذبابة الذكور مع النمط الجيني hsFLP ubiRFP FRT19A ؛ cgGal4 UAS-GFP-Atg8a يحمل موقع FRT في كروموسوم X بالقرب من السنترومير (FRT19A). كما أنه يعبر عن FLP عند صدمة الحرارة عند 37 درجة مئوية. يتم إدخال جين محوري مع تعبير RFP في كل مكان على الكروموسوم X. يتم التعبير عن GFP-Atg8a تحت سيطرة cgGal4 في جسم الدهون اليرقية22. سلالة الذبابة الأنثوية مع النمط الجيني y 'w * Mu FRT19A / FM7 ، Kr GFP تحمل طفرة قاتلة (Mu) و FRT19A على كروموسوم X. يظهر مخطط العبور التفصيلي في الشكل 1.
  2. لوضع البيض ، نقل الذباب إلى قارورة ثقافة جديدة. في 48 ساعة بعد المقدمة ، اضغط على قارورة "التزاوج" حتى يذهل الذباب وينزل على الوسائط في قاعدة القارورة.
    1. افصل قارورة "التزاوج" وقم بتغطية فمها بقارورة مقلوبة غير موصولة بوسائط جديدة (قارورة ثقافة جديدة). بعد ذلك ، انقل الذباب إلى قارورة الثقافة الطازجة عن طريق قلب القوارير والنقر عليها.
    2. قم بتوصيل قارورة الثقافة الطازجة (مع الذباب المنقول) وتخلص من قارورة الثقافة القديمة. ضع قارورة الاستزراع الطازجة هذه في حاضنة 25 درجة مئوية لوضع البيض على الوسائط الطازجة.
      ملاحظة: التسخين المسبق لقوارير الاستزراع الطازجة إلى 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل عملية نقل الذباب سيساعد الذباب على التكيف مع البيئة الجديدة بسرعة وتسريع وضع البيض.
  3. إزالة الذباب بعد 6 ساعات من وضع البيض. إذا كانت هناك حاجة إلى تكرار التجارب ، فقم بنقل هذه الذباب إلى قارورة استزراع أخرى (كما هو موضح في الخطوة 1.2). خلاف ذلك ، تخلص من الذباب عن طريق إلقائه في قارورة تحتوي على 75 ٪ من الإيثانول).
    1. احتضان القارورة مع الأجنة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للحث على شفط FLP. بعد ذلك ، ضعها في حاضنة 25 درجة مئوية واسمح للأجنة بالاستمرار في النمو.
      ملاحظة: يمكن تأكيد التكوين الناجح للمستنسخات الطافرة لاحقا من خلال التصوير. يشير غياب إشارات RFP إلى الحيوانات المستنسخة المتحولة.

2. تجويع الأحماض الأمينية يحفز الالتهام الذاتي

  1. باستخدام ملعقة مختبرية ، استخرج الوسائط التي تحتوي على اليرقات النامية في طبق بتري بعد 75 ساعة من وضع البيض. أضف 3 مل من 1x PBS إلى الطبق وافصل برفق وسائط الاستزراع واليرقات باستخدام ملقط طويل. حدد 10 إلى 15 يرقة ثالثة مبكرة.
    ملاحظة: يجب اختيار اليرقات الثالثة المبكرة بعناية. مرحلة تطور اليرقات أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا البروتوكول. نظرا لتقييد مدة وضع البيض ، من المتوقع أن تكون معظم اليرقات في قارورة الاستزراع في المرحلة الثالثة المبكرة بحلول 75 ساعة من الحضانة. ومع ذلك ، قد تؤدي وصفات وسائط الاستزراع المختلفة إلى اختلافات في توقيت نمو اليرقات. معايير التمييز بين اليرقات الثالثة المبكرة هي طول الجسم ، ووجود spiracles الأمامي والخلفي ، وكذلك خطافات الفك السفلي لجهاز الفم23.
  2. املأ آبار لوحة بقعة منخفضة زجاجية ذات 9 آبار (انظر جدول المواد) ب 1x PBS. ضع اليرقات الثالثة المنفصلة في الآبار باستخدام ملقط طويل واغسل اليرقات جيدا لإزالة جميع بقايا الوسائط.
  3. خذ 5 مل من محلول السكروز 20٪ (في 1x PBS) في قنينة فارغة وضع اليرقات الثالثة النظيفة في هذا المحلول باستخدام ملقط طويل. احتضان هذه القارورة في حاضنة 25 درجة مئوية لمدة 6 ساعات قبل حصادها للتشريح.
    ملاحظة: يعمل محلول السكروز 20٪ (في 1x PBS) كوسط تجويع يعاني من نقص الأحماض الأمينية.

3. تشريح اليرقات الداخلية الثالثة ومعالجة عينات الأنسجة

  1. شحذ زوجين من ملقط # 5 (انظر جدول المواد) بالتساوي على كلا الجانبين بحجر شحذ.
  2. أضف 400 ميكرولتر من 1x PBS في كل بئر من لوحة بقعة الاكتئاب الزجاجية ذات 9 آبار وانقل اليرقات إلى الآبار باستخدام ملقط طويل. ضع يرقة واحدة في بئر مع توجيه الجانب الظهري (الجانب مع القصبة الهوائية) لأعلى.
    1. امسك بشرة اليرقة بملقطين # 5 في منتصف جذع اليرقات وافتح البشرة برفق. ستظل الأجسام الدهنية المكشوفة ، إلى جانب الأنسجة الداخلية لليرقات الأخرى ، متصلة بجثة اليرقة. سحب ما يكفي لفضح الأعضاء الداخلية قدر الإمكان. كرر هذه الخطوة لجميع اليرقات.
      ملاحظة: تحتوي كل يرقة على قطعتين كبيرتين من الجسم الدهني على طول جذع الجسم. أنسجة الجسم الدهنية عبارة عن طبقة أحادية بيضاء وغير شفافة ومسطحة يمكن تمييزها بسهولة تحت مجهر التشريح24.
  3. نقل جثة اليرقات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA). احتضان لمدة 30 دقيقة على 25 درجة مئوية دون رج الأنابيب.
    تحذير: 4٪ PFA سام. ارتداء القفازات والأقنعة للحماية.
    ملاحظة: يوصى بإعداد 4٪ PFA في 1x PBS buffer. مسحوق PFA لا يذوب في 1x PBS على الفور. ومن ثم ، يجب تحضين الخليط عند 65 درجة مئوية في حاضنة طوال الليل أو رجه بشكل متقطع لمدة 45 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  4. بعد 30 دقيقة من حضانة الذبيحة بنسبة 4٪ PFA ، قم بإخراج محلول PFA ، وأضف 500 ميكرولتر من 1x PBS في الأنبوب ، وهز الأنبوب برفق على دوار مسطح لمدة 10 دقائق قبل التخلص من محلول 1x PBS (كرر 3x).
  5. باستخدام ملقط طويل ، انقل جثة اليرقات الثابتة والمغسولة إلى بئر في لوحة بقعة 9 منخفضة مملوءة ب 1x PBS. باستخدام # 5 ملقط ، قم بإزالة جميع أنسجة الجسم غير الدهنية.
  6. استخدم # 5 ملقط لتركيب قطع الجسم الدهني على شريحة مجهرية باستخدام 80٪ من الجلسرين كوسيط تثبيت ووضع غطاء في الأعلى.
    ملاحظة: قبل التركيب ، تحقق من الرقم الهيدروجيني للجلسرين بنسبة 80٪ (باستخدام أوراق الأس الهيدروجيني ، الرقم الهيدروجيني = 7 هو الأمثل) لحماية إشارة GFP. تساعد وسائط التركيب (انظر جدول المواد) مع DAPI في 80٪ من الجلسرين في تصوير نوى خلايا الجسم الدهنية. هذه الشرائح مستقرة لمدة 1 أسبوع عند تخزينها في الظلام عند 4 °C.

النتائج

في ظل ظروف التغذية ، ينتشر البروتين الشبيه باليوبيكويتين الموسوم ب GFP ، GFP-Atg8a ، داخل الخلايا. عند الجوع ، فإنه يشكل puncta الأخضر وتسمية البلعمة الذاتية. بمجرد اندماج البلعمة الذاتية مع الليزوزومات ، يتم إخماد GFP في الليزوزومات الذاتية الحمضية ، وتختفي النقط الخضراء. إذا لم يتم تحفيز الالتهام ...

Discussion

يصف هذا البروتوكول طرق (1) توليد الذباب الذي يحمل مستنسخات متحولة في أجسام الدهون اليرقية ، (2) تحفيز الالتهام الذاتي من خلال تجويع الأحماض الأمينية ، و (3) تشريح أجسام الدهون اليرقية. من أجل توليد الحيوانات المستنسخة بنجاح في أجسام الدهون اليرقات ، يجب تنفيذ الخطوات الحاسمة التالية بجد. (1) يع...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نحن ممتنون ل THFC و BDSC لتوفير سلالات الذباب. يتم دعم الدكتور تونغ تشاو من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32030027 ، 91754103 ، 92157201) وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية. نشكر المرفق الأساسي في معهد علوم الحياة (LSI) على تقديم الخدمات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-150-C
#5 ForcepsDumontRS-5015
9 Dressions Spot platePYREX7220-85
Fluorescence MicroscopeNikonSMZ1500
GlycerolSangon BiotechA100854-0100
KClSangon BiotechA610440-0500Composition of 1x PBS solution
KH2PO4Sangon BiotechA600445-0500Composition of 1x PBS solution
Laboratory spatulaFisher14-375-10
Long forcepsR' DEERRST-14
Microscope cover glassCITOTEST80340-1130
Microscope slidesCITOTEST80302-2104
Na2HPO4Sangon BiotechA501727-0500Composition of 1x PBS solution
NaClSangon BiotechA610476-0005Composition of 1x PBS solution
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
Petri dishCorning430166
Standard cornmeal/molasses/agar fly foodTong Lab-made
Stereo microscopeNikonSMZ745
SucroseSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.10021418
Vectashield antifade mounting medium with DAPIVectorlabratoryH-1200-10Recommended mounting medium
Fly stocks
y'w* Iso FRT19ATong Lab's fly stocks
y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFPTong Lab's fly stocks
y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFPTong Lab's fly stocks
hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8aTong Lab's fly stocks

References

  1. Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
  2. Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
  3. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  4. Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
  5. Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
  6. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
  7. Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
  8. Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
  9. Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
  10. Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
  11. Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
  12. Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
  13. Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
  14. Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
  15. Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
  16. Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
  17. Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
  18. Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
  19. Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
  20. Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
  21. Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
  22. Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
  23. Demerec, M. . Biology of Drosophila. , (1965).
  24. Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
  25. Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
  26. Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
  27. Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
  28. Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
  29. Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
  30. Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved