種子発芽に及ぼす複合塩ストレスの影響の解析とトウガラシの耐 塩性分析

要約

以下の論文は、6つの混合塩濃度に応じて塩分耐性の違いを持つ2つのコショウ品種の種子発芽、苗の成長、および生理学的指標を測定するためのプロトコルを示しています。このプロトコルは、コショウ品種の耐塩性を評価するために使用できます。

要約

発芽段階におけるトウガラシ(トウガラシL.)の耐塩性と生理的メカニズムを決定するために、耐塩性に大きな違いがある紅天湖101および新郷8品種を研究材料として採用しています。_Na2CO3、NaHCO3、NaCl、_CaCl2、MgCl2、MgSO4、および_Na2SO4の等しいモル比を使用して導出された0、3、5、10、15_、および20 g / Lの6つの混合塩濃度が使用されます。それらの効果を決定するために、種子の発芽、苗の成長、生理機能の関連する指標を測定し、メンバーシップ関数分析を使用して耐塩性を総合的に評価します。その結果,混合塩濃度が増加するにつれて,2品種の発芽ポテンシャル,発芽指数,発芽率,種子発芽活力指数,根長,根生加重は有意に減少し,相対塩分率は徐々に増加することが示された。胚軸の長さと地上の新鮮重量は最初に増加し、次に減少しますが、マロンジアルデヒド(MDA)、プロリン(Pro)含有量、カタラーゼ(CAT)、ペルオキシダーゼ(POD)、およびスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)活性は減少してから増加します。Hongtianhu 101種子の発芽電位、発芽指数、発芽率、種子発芽活力指数、根長、根の新鮮重量、MDAおよびPro含有量、およびCAT活性は、ここで使用したすべての塩濃度で新郷8のそれらよりも高くなっています。ただし、胚軸の長さ、地上の新鮮重量、および相対塩分率は、新郷8よりも紅天湖101の方が低くなっています。耐塩性の総合評価により、2つのメンバーシップ関数インデックスの合計加重値は、最初に増加し、次に混合塩濃度が増加するにつれて減少することが明らかになりました。メンバーシップ関数値が最も高い5 g/Lと比較して、3 g/L、10 g/L、および15 g / Lの塩濃度下での指数は、それぞれ4.7%-11.1%、25.3%-28.3%、および41.4%-45.1%減少します。本研究では,トウガラシの耐塩性品種の育種に関する理論的指針と,耐塩性・耐塩性栽培に関わる生理的メカニズムの解析を行う。

概要

塩分濃度は、世界中の作物生産性の主要な制限要因です¹。現在、世界の灌漑地の19.5%近く、乾燥地の2.1%が塩分の影響を受けており、農地の約1%が毎年塩水アルカリ地に退化しています。2050年までに、耕作可能な土地の50%が塩類化の影響を受けると予想されています^2,3。海岸近くまたは沿岸周辺の自然の岩石風化や塩辛い雨水などの自然要因に加えて、急速な表面蒸発、低降雨量、および不合理な農業管理方法が土壌塩類化のプロセスを悪化させています。土壌塩類化は植物の根の成長を阻害し、植物の根から葉への水と栄養素の吸収と輸送を減らします。この阻害は、生理的な水不足、栄養の不均衡、およびイオン毒性をもたらし、作物の生産性を低下させ、作物収量を完全に失います。耕作地の塩類化は、世界の農産物生産に影響を与える最も重要な非生物的ストレス要因の1つになりつつあります⁴。塩ストレスは農業に利用できる耕作地を減少させ、将来の農産物の需要と供給の間に大きな不均衡をもたらす可能性があります。したがって、土壌塩類化が作物の成長と生理学的および生化学的メカニズムに及ぼす影響を調査することは、耐塩性品種の育種、塩分土壌の持続可能な利用、および農産物の安全性に役立ちます。

コショウ(トウガラシ) は、その高い栄養価と薬効のために世界中に植えられています。たとえば、カプサイシンはコショウのスパイシーな風味の原因となるアルカロイドです。カプサイシンは、痛みの緩和、体重減少、心血管系、消化管系、呼吸器系の改善、およびその他のいくつかの用途に使用できます⁵。コショウはまた、生理活性物質、特にさまざまな抗酸化化合物(カロチノイド、フェノール、フラボノイド)とビタミンC⁶が豊富です。現在、コショウは中国最大の栽培面積を持つ野菜作物であると報告されており、年間植栽面積は1.5 x 10⁶ ヘクタールを超え、それによって中国の総野菜栽培面積の8%〜10%を占めています。コショウ産業は中国最大の野菜産業の1つになり、最高の生産額⁷を持っています。しかし、コショウの栽培は、さまざまな生物学的(害虫や真菌)および非生物的ストレス、特に塩ストレスにさらされることが多く、種子の発芽、成長、および発達に直接悪影響を及ぼし、コショウ果実の収量と品質が低下します⁸。

種子の発芽は、植物と環境の間の相互作用の最初の段階です。種子の発芽は、周囲の培地の変動、特に土壌塩ストレスに非常に敏感であり、生理学と代謝に逆の影響を及ぼし、最終的には作物の正常な成長、発達、および形態形成を乱す可能性があります⁹。以前の研究では、塩ストレス下でのコショウ種子の発芽と苗の成長が広範囲に調査されました。しかし、ほとんどの研究では、ストレス誘発の唯一の塩としてNaClを使用していました^10,11,12。しかし、土壌塩害は、主にナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩の解離によって生じるNa+、^Ca2+、^Mg2+、Cl-、_CO3 2-、および_SO4^2-イオン毒性によるものです。イオン間の相乗効果と拮抗作用により、作物の成長と発達に対する混合塩と単一塩の影響はかなり異なる場合があります。しかし、コショウ種子の発芽と混合塩の成長の対応する特性はまだ不明です。そこで本研究では,耐塩性の差が著しい2種類のトウガラシを材料として用いた。7つの塩を等モル混合した後のコショウ種子の発芽、成長、および生理学的および生化学的指標に対するさまざまな塩濃度の影響を分析することで、塩分ストレスに対するコショウ種子発芽の応答メカニズムを明らかにすることができます。それはまた、強いコショウの苗を栽培するための理論的基礎、ならびに塩水耕作地での高収量および高品質の栽培を提供することができる。

プロトコル

注:ここでは、種子塩耐性評価の参照方法として役立つ、異なる混合塩ストレス下でのコショウ種子の発芽と苗の成長の応答特性と内部メカニズムを評価するためのプロトコルを提示します。

1. 実験準備

1. 耐塩性の強いHongtianhu 101と耐性の低いXinxiang 8の栽培品種用の作物種子を準備します。
2. 種子消毒試薬として0.2%KMnO₄溶液を調製する。まず、KMnO 4を4.0g秤量し、次に蒸留水2,000mLを加えます。
   注:過マンガン酸カリウムは通常、その強い酸化のために不安定です。従って、使用直前に調製される。
3. 炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウムを含む7つの塩を用いて混合塩を調製^する13。混合塩の総質量比のそれぞれ14.8%、11.7%、8.2%、15.5%、13.3%、16.7%、および19.8%を順次占める、それぞれ同じモル量を添加する。
4. 直径9 cmのペトリ皿(使い捨て)とろ紙(中速定性ろ紙)を準備します。
   注意: ペトリ皿の材質は変更できます。ただし、シャーレとろ紙の直径は同じでなければなりません。

2.種子の浸漬と発芽の準備

1. 種子の最適化のために、各品種から一貫したサイズと完全な粒子を持つコショウの種子を選択し、Hongtianhu 101とXinxiang 8の種子の平均直径はそれぞれ4.2 mmと3.7 mmです。テスト ワークロードに従って選択されたシードの総数を計算します。
2. 種子消毒のために、選択したコショウの種子を0.2%KMnO₄ 溶液に15分間浸してから、蒸留水で5回すすぎます。
3. 種子を浸すには、滅菌した種子を蒸留水に移し、24時間浸します。種子を蒸留水で数回すすぎ、さらに使用するために乾燥させます。
   注:作物によって種子の浸漬時間は異なる場合があります。

3.種子の発芽と苗の成長

1. 0(対照)、3、5、10、15、および20 g / Lの6つの濃度の混合塩を準備します。 導電率計を使用して塩溶液の導電率を測定します。溶液導電率のEC値は、それぞれ0.092、3.05、4.73、8.33、11.53、および15.22 ms/cmです。
2. 種子の準備のために、2層のろ紙でペトリ皿に40コショウの種を均等に置きます。6つの実験的処理のために種子を準備し、各処理を5回繰り返します。
3. 種子の発芽のために、6つの混合塩濃度の適量をペトリ皿に加えて、ろ紙が湿っていることを確認します。種子を28°C、湿度80%の空気インキュベーターに入れて、暗所で発芽させます。
4. 種子の発芽後、播種後14日間、インキュベーター内で苗を光(光強度約450ルクス、光サイクル12/12時間)で成長させ続けます。苗の成長段階での温度と湿度は、発芽段階で使用されるものと同じでなければなりません。
5. 12時間ごとに培養皿に溶液を補充して湿ったろ紙を保持し、24時間ごとに対応する濃度の混合塩溶液でろ紙を完全に洗浄して、シャーレ内の混合塩濃度を一定に保ちます。
   注:湿った種子に添加する塩溶液の量は、種子の発芽および成長段階に応じて調整できます。培養皿中の塩溶液を一定濃度に維持するために多くの方法が利用可能です。この実験で説明した方法に加えて、蒸留水を重量で添加する戦略を使用することができる。

4.指標の測定と計算

1. 種子発芽指数の決定
   1. 播種後毎日発芽率を決定し、幼根を破る種皮が発芽マーカーとして種子直径の長さの半分に達する。
   2. 次の式を使用して、発芽率、発芽可能性、相対塩率、発芽指数、および種子発芽活力指数を計算します。
      発芽率(%)=(播種後7日目の正常発芽種子数/試験種子数)×100
      発芽電位(%)=(播種後3日目の正常発芽種子数/試験種子数)×100
      相対食塩率(%)=(対照発芽率-処理発芽率)/対照発芽率×100
      播種後7日目の種子発芽率を用いて算出
      発芽指数 (GI) = ∑ [Gt/Dt]
      ここで、Gtは播種後の一定期間(t)における種子発芽数を指し、Dtは対応する発芽日数を指します。
      種子発芽活力指数 (VI) = GI x S
      ここで、S はルートの長さです。
2. 苗成長指数の決定
   1. 播種後14日目に、各シャーレから代表的な苗を無作為に10本選び、根の長さと胚軸の長さを測定します。
   2. ナイフを使用して、コショウの苗を2つの部分に分けます:幼根と地上の部分。拭いて苗から水を取り除き、苗を別々に計量して新鮮な重量を決定します。
3. コショウ中の抗酸化酵素活性、マロンジアルデヒド(MDA)レベル、およびプロリン(Pro)含有量を次のように測定します。
   1. コショウの苗を保存するために、播種後14日目の各処理から代表的な全コショウの苗(約24.0 g)を選択します。表層水分を除去した後、直ちに苗を液体窒素中で1分間凍結し、超低温(-80°C)の冷蔵庫に保管する。
      注:いくつかの指標を再テストする必要がある場合に備えて、超低温冷蔵庫に保管されているコショウ苗のサンプル数は十分なはずです。
   2. 三重に集めた各処理から約1.0gの苗サンプルを回収します。苗サンプルを遠沈管に入れ、液体窒素を加え、粉砕ロッドを使用してサンプルを粉砕し、苗の生理学的指標を決定します。決定された指標と測定スキームを以下に示します。
   3. 因子¹⁴ごとに市販のキット(分光光度法ベース)を用いて苗保護酵素活性(ペルオキシダーゼ[POD]、カタラーゼ[CAT]、スーパーオキシドジスムターゼ[SOD])、マロンジアルデヒド(MDA)、プロリン(Pro)含量を求めた。
      注:以前の観察では、15 g / Lと20 g / Lの混合塩濃度の間で塩ストレスに違いはないことが明らかになりました。その結果、5つの塩濃度(0、3、5、10、および15 g / L)のみが測定されます。
4. メンバーシップ関数法を用いた耐塩性の総合評価
   注:メンバーシップ関数は、定性的評価を定量的評価¹⁵に変換するファジィ数学法を使用して、塩害の影響を受けるさまざまな生理学的指標を評価します。
   1. Zhoubin Liuらによる次の式を使用してメンバーシップ関数の値を計算します¹⁵:
      Ri = (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
      特性が耐塩性と負の相関がある場合は、次を使用して逆メンバーシップ関数を計算します。
      Ri = 1 - (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
      各生理指標のメンバーシップ値を累積し、Xiはある形質の測定値、XmaxとXminはそれぞれXiの最大値と最小値、Riはその形質のメンバーシップ値です。
   2. 次の関連指標を含めます:種子発芽特性(発芽電位、発芽率、発芽指数、および種子発芽活力指数)、発芽段階での苗成長特性(根長、胚軸長、根の新鮮重量、および地上の新鮮重量)、MDA、Pro、およびメンバーシップ関数値の計算のための保護酵素活性(CAT、POD、SOD)。メンバーシップ関数の値は、各インジケーターから取得されます。
5. スプレッドシートとSPSSソフトウェア(バージョン22.0)を使用してテストデータを分析および処理し、多重比較に最小有意差(LSD)法を適用して有意差を特定します。ピアソンの相関分析を使用して、複合塩ストレス下でのコショウの種子発芽と苗の生理学的指標との相関を調査します。

結果

種子発芽特性
混合塩濃度が増加するにつれて、Hongtianhu 101とXinxiang 8の発芽電位と発芽指数は大幅に減少します。どちらの品種も、塩濃度が0〜3 g / Lから急激に低下し、塩濃度が3〜20 g / Lからゆっくりと着実に低下しています(図1A、B)。2品種の発芽率は混合塩濃度が増加するにつれて徐々に減少し、品種の相対塩率は徐々に増加します。塩濃度...

ディスカッション

この研究方法は、実験結果の精度に影響を与える4つの重要なステップで構成されています。第一に、高塩濃度溶液中の溶質含有量の増加による混合塩の溶解不良、および塩化カルシウムなどの試薬の溶解度が低いため、水に可溶化することがより困難であるため、計量された試薬は乳鉢で完全に粉砕する必要があります。さらに、試薬は、容量を決定する前に超音波 を介して 溶解す?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride	Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Centrifugal machine	Shanghai Luxianyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., China	TGL-16M
Centrifuge tube	None	None
Conductivity meter	Shanghai Instrument&Electronics Science Instrument Co., Ltd., China	DDSJ-308F
Constant temperature and humidity box	Ningbo Laifu Technology Co., Ltd.,China	PSX-280H
Digital display vernier caliper	Deli Group Co., Ltd.,China	DL90150
Electronic balance	Mettler Toledo Instruments (Shanghai) Co., Ltd.,China	ME802E/02
Filter paper	Hangzhou Fuyang North Wood Pulp and Paper Co., Ltd.,China	GB/T1914-2017
Grinding rod	None	None
Hongtianhu  101	Seminis Seed (Beijing) Co., Ltd.,China	11933955/100147K1-137
Ice machine	Shanghai Kehuai Instrument Co., Ltd., China	IM150G
Liquid nitrogen	None	None
Magnesium chloride	Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Magnesium sulfate	Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Petri dish	Jiangsu Yizhe Teaching Instrument Co., Ltd.,China	I-000163
Pocket knife	None	None
Potassium permanganate (KMnO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Pure water equipment	Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.,China	UPT-I-20T
Sodium bicarbonate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium carbonate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium chloride	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium sulfate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Test kit	Suzhou Keming, Biotechnology Co., Ltd, Suzhou.,China	Spectrophotometer method
Ultra-low temperature freezer	SANYO Techno Solution TottoriCo.,Ltd.	MDF-382
Ultraviolet visible spectrophotometer	Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd., China	760CRT
Xinxiang 8	Jiangxi Nongwang High Tech Co., Ltd.,China	GPD Pepper 2017(360013)