Saggio di assorbimento degli anticorpi per il monitoraggio dell'endocitosi notch/delta durante la divisione asimmetrica dei progenitori della glia radiale del pesce zebra

Riepilogo

Questo lavoro sviluppa un saggio di assorbimento degli anticorpi per l'imaging della segnalazione Notch/DeltaD intra-lineage nella divisione dei progenitori della glia radiale del cervello embrionale del pesce zebra.

Abstract

La divisione cellulare asimmetrica (ACD), che produce due cellule figlie di destini diversi, è fondamentale per generare diversità cellulare. Negli organi in via di sviluppo sia degli invertebrati che dei vertebrati, i progenitori che si dividono asimmetricamente generano una figlia auto-rinnovante di^{Notch hi} e una figlia differenziante di Notch. Nel cervello embrionale del pesce zebra, i progenitori della glia radiale (RGP) - le principali cellule staminali neurali dei vertebrati - subiscono principalmente ACD per dare vita a un RGP e un neurone differenziante. La chiarezza ottica e la facile accessibilità degli embrioni di zebrafish li rendono ideali per l'imaging time-lapse in vivo per visualizzare direttamente come e quando l'asimmetria della segnalazione Notch viene stabilita durante l'ACD. Studi recenti hanno dimostrato che l'endocitosi dinamica del ligando di Notch DeltaD svolge un ruolo cruciale nella determinazione del destino cellulare durante l'ACD e il processo è regolato dal regolatore di polarità evolutivamente conservato Par-3 (noto anche come Pard3) e dal complesso motorio della dineina. Per visualizzare i modelli di traffico in vivo degli endosomi di segnalazione Notch negli RGP mitotici, abbiamo sviluppato questo test di assorbimento degli anticorpi. Utilizzando il test, abbiamo scoperto la dinamica degli endosomi contenenti DeltaD durante la divisione RGP.

Introduzione

La segnalazione Notch controlla la decisione e il pattern del destino cellulare durante lo sviluppo nei metazoi¹, e studi recenti hanno dimostrato che la segnalazione di Notch nella divisione delle cellule staminali dipende principalmente dal traffico endocitico ^2,3. Notch/Delta endocitosato può attivare la segnalazione Notch nel nucleo e migliorare la trascrizione dei geni bersaglio di Notch ^4,5,6. Il traffico endosomico Notch/Delta direzionale è stato osservato per la prima volta nelle cellule precursori degli organi sensoriali (SOP) della Drosophila durante la sua divisione cellulare asimmetrica (ACD), con conseguente maggiore attività di segnalazione di Notch in pIIa rispetto a pIIb ^7,8. Sono stati applicati saggi di assorbimento degli anticorpi con anticorpi anti-Delta e anti-Notch per monitorare il processo endocitico nelle cellule SOP mitotiche. Gli endosomi Notch/DeltaD si spostano insieme ad una proteina motoria della kinesina verso il fuso centrale durante la citochinesi, e sono traslocati asimmetricamente nella cellula pIIa a causa della matrice antiparallela del fuso centrale asimmetrico all'ultimo momento della divisione cellulare ^3,8. Questi studi hanno fatto luce sui meccanismi molecolari che regolano la divisione asimmetrica nelle cellule SOP di Drosophila, ma non è chiaro se processi endocitici simili si verifichino nei progenitori della glia radiale dei vertebrati (RGP).

Inoltre, i meccanismi molecolari che regolano la segnalazione asimmetrica Notch/DeltaD durante la divisione RGP dei vertebrati non sono ben compresi. Nel pesce zebra, è stato riportato che l'interazione di Notch e Delta facilita l'endocitosi del ligando DeltaD⁹. Non è noto se l'endocitosi DeltaD possa influire sulla scelta del destino cellulare delle cellule figlie nel cervello dei vertebrati in via di sviluppo. Studi recenti dimostrano che l'iniezione di anticorpi anti-DeltaD coniugati fluorescentmente nel tubo neurale potrebbe marcare gli endosomi Sara specificamente nelle cellule neuroepiteliali e gli endosomi Sara contenenti anti-DeltaD segregano preferenzialmente nelle cellule figlie proliferanti¹⁰. È stato suggerito che la segnalazione di Notch dagli endosomi potrebbe regolare il destino delle cellule figlie. Risultati precedenti hanno dimostrato che la maggior parte delle cellule RGP del pesce zebra nel proencefalo in via di sviluppo subiscono ACD e la determinazione del destino delle cellule figlie dipende dalla segnalazione Notch / DeltaD intralineage¹¹. Al fine di chiarire la natura della segnalazione Notch/DeltaD intralineage negli RGP di zebrafish, abbiamo sviluppato il saggio di assorbimento degli anticorpi anti-DeltaD nel cervello in via di sviluppo del pesce zebra. Utilizzando questo protocollo, abbiamo eseguito con successo l'etichettatura in tempo reale e l'imaging del traffico endocitico DeltaD negli RGP mitotici.

L'anticorpo anti-DeltaD marcato con fluorescenza viene internalizzato in modo efficiente negli RGP lungo il ventricolo del proencefalo. Ha notevolmente facilitato la scoperta del traffico direzionale degli endosomi DeltaD nelle RGP^12,13 che si dividono asimmetricamente. Rispetto ai precedenti protocolli di assorbimento degli anticorpi sviluppati per le colture di Drosophila notum e il midollo spinale zebrafish 10, questo protocollo ha raggiunto una marcatura anti-DeltaD duratura e altamente efficiente nello strato cellulare del ventricolo cerebrale, in particolare con meno di¹⁰ nL di miscela di anticorpi microiniettati. L'iniezione del ventricolo posteriore è molto conveniente per applicare il test di assorbimento degli anticorpi nel cervello in via di sviluppo, poiché il ventricolo del cervello posteriore è ben espanso negli embrioni di zebrafish e riempito di liquido cerebrospinale nella fase iniziale di sviluppo¹⁴. Iniettando la miscela di anticorpi nel ventricolo posteriore senza ferire alcun tessuto in via di sviluppo cruciale, il protocollo ha ridotto al minimo il più possibile i possibili danni alla zona di imaging nel proencefalo. Il dosaggio ridotto dell'anticorpo primario iniettato ha anche evitato potenziali effetti collaterali di interferire con la segnalazione endogena Delta-Notch in vivo. Questo protocollo può essere facilmente combinato con altre perturbazioni farmacologiche o genetiche, utilizzato in diversi stadi di sviluppo e possibilmente adattato al cervello adulto e agli organoidi cerebrali 2D / 3D derivati da cellule staminali pluripotenti umane. Nel loro insieme, il protocollo ha permesso di capire come e quando l'asimmetria di segnalazione di Notch viene stabilita durante l'ACD. La sfida principale per il successo dell'implementazione di questo protocollo è quella di ottenere una consegna precisa di concentrazioni appropriate dell'anticorpo in base a specifiche condizioni sperimentali.

Protocollo

Abbiamo utilizzato la linea AB wild type e la linea transgenica Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] per lo studio. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Università della California, San Francisco, USA (numero di approvazione: AN179000).

1. Preparazione di embrioni di zebrafish

1. Prepara vasche di attraversamento dei pesci nel pomeriggio prima delle 17:00, con un pesce selvatico femmina e un pesce maschio Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] usando divisori per separarli in ogni vasca.
2. Rimuovere i divisori prima delle 11:00 da tutti i serbatoi di attraversamento la mattina successiva. Stai zitto e non disturbare il pesce mentre si accoppiano. La deposizione delle uova avviene in genere entro 30 minuti dopo la rimozione dei divisori. Le uova fecondate rimangono sul fondo del serbatoio.
   1. Raccogliere le uova fecondate dai serbatoi con un filtro a rete. Trasferire le uova lavandole in una capsula di Petri piena di acqua d'uovo ed esaminare gli embrioni al microscopio da dissezione con un ingrandimento da 10x a 20x.
3. Trasferire gli embrioni fecondati in una capsula di Petri pulita contenente circa 20 ml di terreno embrionale (100 ml di soluzione madre 1.000x contengono 29,4 g di NaCl, 1,27 g di KCl, 4,85 g di CaCl 2,2H 2 O e 8,13 gdi MgSO_{4,7H 2} O) con pipette Pasteur in vetro di grosso calibro. Mantenere gli embrioni a 28 °C. Conservare 50 embrioni fecondati per capsula di Petri con 30 ml di terreno embrionale a 28,5 °C.
   NOTA: Una coppia di pesci produce normalmente 100-300 embrioni e il tasso di fecondazione e sopravvivenza degli embrioni sani è superiore al 95% per ogni accoppiamento.
4. La mattina seguente, prelevare gli embrioni dall'incubatrice alle 8:00, quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio di sviluppo di ~18-20 ore dopo la fecondazione (hpf). Osservateli al microscopio a epifluorescenza con un ingrandimento 20x, usando inizialmente la luce bianca. A quel tempo, gli embrioni di zebrafish sono allo stadio 20 somite.
   1. Scartare gli embrioni morti che sono torbidi o rotti al microscopio usando una pipetta di vetro.
5. Accendere la lampada fluorescente e scegliere l'impostazione del filtro RFP del microscopio. Quindi, selezionare gli embrioni con forte fluorescenza rossa e trasferirli in un nuovo piatto con acqua d'uovo.
   1. Dechorionate manualmente gli embrioni con due pinze sottili (le punte delle pinze devono essere affilate e non danneggiate) sotto luce bianca (Tabella dei materiali).
   2. Tenere il corion con un paio di pinze e fare una lacrima nel corion con l'altro forcipe. Aprire la lacrima con attenzione usando la pinza e renderla abbastanza grande da consentire all'embrione di passare attraverso spingendo delicatamente l'embrione con le punte delle altre pinze.
6. Trasferire gli embrioni dechorionati in una nuova capsula di Petri con terreno embrionale fresco per un rapido risciacquo prima della microiniezione.

2. Preparazione della microiniezione

1. Utilizzare i capillari (OD da 1,2 mm, ID 0,9 mm, con filamento) per tirare aghi sottili per iniezione su un estrattore. Progettare e ottimizzare il programma di trazione secondo il manuale.
2. Aprire la punta dell'ago con una pinza al microscopio a dissezione stereo. Rendere il diametro della punta intorno a 10 μm e l'angolo di conicità intorno a 30°.
3. Coniugare l'anticorpo monoclonale anti-Dld di topo con l'anti-Mouse-IgG-Atto647N prima dell'iniezione.
   1. Per ogni esperimento di iniezione, miscelare 0,5 μL di anticorpo anti-Dld (0,5 mg/ml) con 2 μL di anticorpo anti-Mouse-IgG-Atto647N (1 mg/ml) pipettando 5-10 volte. Quindi, incubare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti (o su ghiaccio per 2-3 ore).
   2. Dopo l'incubazione, aggiungere 2,5 μL di tampone bloccante (10 mg/mL di IgG di topo) e 0,5 μL di rosso fenolo allo 0,5% alla miscela di anticorpi, e pipettare 10 volte per miscelare accuratamente, per bloccare eventuali anticorpi non coniugati rimasti nella miscela.
      NOTA: Per ogni prova, preparare una miscela extra senza l'anticorpo anti-Dld e usarla come controllo.
4. Preparare l'1% di agarosio a basso punto di fusione nel mezzo embrionale. Riscaldare la miscela contenuta in agarosio a 70 °C fino a quando la miscela diventa trasparente.
   1. Aliquot la soluzione di agarosio in provette da microcentrifuga da 2 ml. Conservare le aliquote in un blocco termico a ~40 °C.
5. Risciacquare l'embrione nella provetta contenente l'1% di agarosio a basso punto di fusione per 3 s.
6. Posizionare l'embrione su un coperchio di plastica di Petri rovesciato insieme a singole gocce di agarosio (~30-40 μL) per montare ciascun embrione separatamente sul coperchio, come mostrato nella Figura 1. Adagiare gli embrioni lateralmente nell'agarosio e mantenere questa posizione fino a quando l'agarosio non si è solidificato a temperatura ambiente.
7. Montare 12 embrioni in tre file uno per uno come sopra. Coprire tutti gli embrioni montati nell'agarosio con mezzo uovo.

3. Microiniezione

1. Metti gli embrioni incorporati sotto lo stereomicroscopio e copri l'agarosio con acqua d'uovo.
2. Impostare l'iniettore di pressione dell'aria insieme ai micromanipolatori, posizionandoli vicino ai microscopi come mostrato nella Figura 1. Utilizzare la bombola di gas in acciaio contenente azoto gassoso (N₂) ad alta pressione come risorsa aria.
   1. Aprire la valvola del gas solo dopo che gli embrioni sono stati montati nell'agarosio. Quindi, caricare frontalmente l'ago di vetro preparato con 2 μL di miscela anticorpale sul micromanipolatore, come mostrato nella Figura 1, quando si utilizza il modulo di riempimento frontale del microiniettore.
   2. Regolare la pressione di ingresso su ~ 80-90 psi e la pressione di iniezione su ~ 20 psi.
3. Calibrare il volume di iniezione utilizzando un micrometro al microscopio, come descritto in precedenza¹⁵. Impostare la durata del tempo di sintonizzazione da 10 ms a 120 ms, in base alle dimensioni dell'apertura dell'ago. Erogare ogni impulso di iniezione toccando la paletta . Regolare il volume di iniezione di ciascuna erogazione a ~4-5 nL.
4. Colpire la punta dell'ago di microiniezione attraverso la piastra dorsale del tetto posteriore al punto di cerniera r0 / r1 e iniettare circa 10 nL (due o tre impulsi) di miscela di anticorpi senza colpire il tessuto cerebrale. Osserva il flusso di fluidi rossi nel ventricolo cerebrale.
   NOTA: Il ventricolo posteriore del cervello posteriore è posteriore al confine del cervello posteriore del mesencefalo. La miscela di anticorpi contenenti rosso fenolo iniettata riempie immediatamente il ventricolo cerebrale dal cervello al proencefalo diffondendosi con liquido cerebrospinale.
5. Dopo l'iniezione, rimuovere rapidamente la punta dell'ago dall'embrione ruotando la manopola del micromanipolatore. Per un'iniezione di successo, il colorante rosso della miscela iniettata rimane stabilmente nel ventricolo cerebrale senza fuoriuscire nell'agarosio circostante.
6. Spostare la piastra di montaggio sotto il microscopio per individuare un altro embrione montato in una posizione adatta per le ripetizioni.
   1. Dopo aver iniettato da sei a otto embrioni, sbucciare l'agarosio con un coltello microchirurgico per rilasciare gli embrioni dall'agarosio incorporato. Trasferire gli embrioni microiniettati in un piatto fresco con 30 ml di terreno embrionale e metterli a temperatura ambiente per le fasi successive.

4. Montaggio e imaging live time-lapse

1. Dopo 30 minuti, trasferire gli embrioni selezionati a 10 ml di terreno embrionale. Aggiungere 420 μL di tricaina stock (4 mg/ml) a 10 mL di terreno embrionale per anestetizzare gli embrioni.
2. Per montare gli embrioni, preparare agarosio a basso punto di fusione allo 0,8% contenente la stessa concentrazione di tricaina nella provetta. Conservare le aliquote in un blocco termico a ~40 °C.
3. Utilizzare una pipetta di vetro per immergere gli embrioni iniettati nell'agarosio caldo per 3 s. Quindi, rimuovere immediatamente gli embrioni dall'agarosio con la stessa pipetta di vetro e posizionare gli embrioni al centro di piatti di coltura con fondo di vetro da 35 mm con una goccia di agarosio dal tubo. Metti solo un embrione per goccia sul vetro.
4. Orientare delicatamente gli embrioni con una sonda di fibre o una punta di carico per mantenere il lato dorsale del cervello embrionale il più vicino possibile al fondo di vetro. Sintonizza delicatamente la posizione dell'embrione per estendere l'embrione senza arricciarsi mentre l'agarosio si solidifica gradualmente.
5. Successivamente, controlla la posizione dell'embrione capovolgendo il piatto inferiore di vetro. Assicurarsi che l'intero proencefalo dorsale con gli embrioni correttamente montati possa essere visto al microscopio.
6. Aggiungere 2-3 mL di terreno embrionale preriscaldato a 28,5 °C contenente tricaina per coprire l'embrione. Posizionare correttamente il piatto sullo stadio a temperatura controllata del microscopio confocale, come mostrato nella Figura 1. Regolare la temperatura della camera di imaging a 28,5 °C. L'embrione è ora pronto per l'imaging.
7. Esegui immagini live time-lapse con un intervallo di tempo fisso utilizzando un obiettivo di immersione in acqua 40x.
   1. Utilizzare il software di imaging e controllo del microscopio (μMANAGER: https://micro-manager.org/)¹⁶.
   2. Selezionare i canali di imaging di 564 nm e 647 nm per l'imaging della fluorescenza di membrana del pesce zebra transgenico MyR-Tdtomato e dell'anti-Dld-Atto647N endosomiale nella cellula (Figura 1).
   3. Impostare la potenza del laser al 30% per entrambi i canali. Utilizzare un tempo di esposizione per piano z di 200 ms per ciascun canale.
   4. Per ogni embrione di zebrafish montato, utilizzare uno z-step di scansione di 1 μm per 20 piani z in totale e un ciclo di scansione di 100 intervalli di tempo.
   5. Impostare l'intervallo di tempo tra ogni ciclo di scansione a 20 s e la modalità di scansione come canale, sezione.

Risultati

Nella Figura 2A, gli embrioni iniettati con Atto647N, senza legarsi con l'anticorpo primario, hanno mostrato fluorescenza di fondo nel ventricolo cerebrale. Pochissime particelle fluorescenti inghiottite possono essere osservate nelle cellule. Gli embrioni di zebrafish iniettati anti-Dld-Atto647N hanno mostrato grandi quantità di particelle fluorescenti internalizzate nella maggior parte delle cellule del proencefalo in via di sviluppo (Figura 2A, pannello di d...

Discussione

Abbiamo sviluppato un test di assorbimento degli anticorpi per la marcatura e l'imaging del traffico endosomiale Notch/Delta nei progenitori della glia radiale del pesce zebra ad alta efficienza. Rispetto ai precedenti metodi utilizzati per tracciare l'anticorpo anti-DeltaD marcato^{nelle cellule} SOP 7,8 di Drosophila^, il nostro metodo ha utilizzato la microiniezione invece dell'incubazione dei campioni nell'anticorpo coniugato. Gli anticorpi anti-Dld coniugati flu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm glass bottom culture dish	MatTek corporation	P35GC-1.5-10-C
air pressure injector	Narishige	IM300
Anti-Mouse-IgG-Atto647N	Sigma-Aldrich	50185
CaCl2.2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament	World Precision Instruments	1B120F-6
CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield	Nikin	N/A	Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal.
Dumont Medical Tweezers Style 5	Thomas Scientific	72877-D
Flaming-Brown P897 puller	Sutter Instruments	N/A	https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
KCl	Millipore	529552
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	M2773
micromanipulators	World Precision Instruments	WPI M3301R
Mouse anti-Dld	Abcam	AB_1268496
Mouse IgG blocking buffer from Zenon	Thermofisher Scientific	Z25008
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290
Stemi 2000	Zeiss	N/A
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
UltraPureTM low melting point agarose	Invitrogen	16520050