Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Genetics
प्रतिदीप्ति-सक्रिय न्यूक्लियस सॉर्टिंग का उपयोग करके वसा ऊतकों के साथ एडिपोसाइट्स-विशिष्ट एटीएसी-सेक
हम उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एटीएसी-सेक) के साथ ट्रांसपोसेज-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, विशेष रूप से परमाणु फ्लोरेसेंस लेबलिंग के साथ ट्रांसजेनिक रिपोर्टर चूहों से अलग वसा ऊतकों के साथ न्यूक्लियस सॉर्टिंग का उपयोग करके एडिपोसाइट्स पर।
उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एटीएसी-सेक) के साथ ट्रांसपोसेज-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख एक मजबूत तकनीक है जो जीनोम-वाइड क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी प्रोफाइलिंग को सक्षम बनाती है। यह तकनीक जैविक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला में जीन अभिव्यक्ति के नियामक तंत्र को समझने के लिए उपयोगी रही है। यद्यपि एटीएसी-सेक को विभिन्न प्रकार के नमूनों के लिए संशोधित किया गया है, लेकिन वसा ऊतकों के लिए एटीएसी-सेक विधियों के प्रभावी संशोधन नहीं हुए हैं। वसा ऊतकों के साथ चुनौतियों में जटिल सेलुलर विषमता, बड़ी लिपिड सामग्री और उच्च माइटोकॉन्ड्रियल संदूषण शामिल हैं। इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो ट्रांसजेनिक रिपोर्टर न्यूक्लियर टैगिंग और ट्रांसलेटिंग राइबोसोम एफिनिटी प्यूरीफिकेशन (एनयूटीआरएपी) माउस से वसा ऊतकों के साथ प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक छंटाई को नियोजित करके एडिपोसाइट-विशिष्ट एटीएसी-सेक की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल न्यूक्लियस इनपुट और अभिकर्मकों की मात्रा को कम करते हुए न्यूनतम बर्बाद अनुक्रमण पढ़ने के साथ उच्च गुणवत्ता वाले डेटा का उत्पादन करता है। यह पेपर माउस वसा ऊतकों से अलग एडिपोसाइट नाभिक के उपयोग के लिए मान्य एटीएसी-सेक विधि के लिए विस्तृत चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल विभिन्न जैविक उत्तेजनाओं पर एडिपोसाइट्स में क्रोमैटिन गतिशीलता की जांच में सहायता करेगा, जो उपन्यास जैविक अंतर्दृष्टि की अनुमति देगा।
वसा ऊतक, जो लिपिड अणुओं के रूप में अतिरिक्त ऊर्जा के भंडारण के लिए विशिष्ट है, चयापचय विनियमन के लिए एक महत्वपूर्ण अंग है। एडिपोसाइट्स गठन और रखरखाव का सख्त नियंत्रण वसा ऊतक समारोह और पूरे शरीर की ऊर्जा होमियोस्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण है। कई ट्रांसक्रिप्शनल नियामक एडिपोसाइट भेदभाव, प्लास्टिसिटी और फ़ंक्शन के नियंत्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं; इनमें से कुछ नियामकों को मनुष्यों में चयापचय संबंधी विकारों में फंसाया गया है 2,3. जीन अभिव्यक्ति और एपिजेनोमिक विश्लेषण के लिए उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तकनीकों में हालिया प्रगति ने एडिपोसाइट्स जीव विज्ञान 4 के आणविक नियामकों की खोज को और सुवि....
इस एटीएसी-सेक प्रोटोकॉल का उपयोग करके वसा ऊतक का विश्लेषण करने के लिए, हमने एडिपोक-न्यूट्रैप चूहों को उत्पन्न किया जिन्हें चाउ आहार खिलाया गया था; फिर हमने फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके एपिडीडिमल सफे.......
इस काम को IUSM शोआल्टर रिसर्च ट्रस्ट फंड (H.C.R.), मधुमेह और मेटाबोलिक रोग पायलट और व्यवहार्यता अनुदान (H.C.R.), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज (R01DK129289 से H.C.R.), और अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन जूनियर फैकल्टी अवार्ड (7-21-JDF-056 से H.C.R.) द्वारा समर्थित किया गया था।
....| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio 5 |
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