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要約

2つの眼球アブレーションプロトコル(すなわち、焼灼および 手術アプローチ)が、麻酔をかけられた雌のカニに対して実施された。マッドクラブのアイトークアブレーションは、生存率を低下させることなく卵巣の成熟を早めました。

要約

マッドクラブ(Scylla 属)は、インド西太平洋地域全体で見られる商業的に重要な甲殻類種です。培養中、卵巣成熟の誘導は、成熟したマッドクラブに対する消費者の需要を満たし、種子生産を早めるために重要です。アイトークアブレーションは、マッドクラブの卵巣成熟を促進するための効果的なツールです。ただし、マッドクラブのアイトークアブレーションに関する標準的なプロトコルはありません。この研究では、焼灼(麻酔をかけたカニの眼球を切除するための溶銑の使用)と手術(外科用ハサミを使用した眼球の除去)の2つの眼球アブレーション技術について説明します。眼球アブレーションの前に、性的に成熟した女性(CW > 86 mm)を海水の入ったアイスバッグ(-20°C)を使用して麻酔しました。水温が4°Cに達した時点で、アイスバッグを水から取り出した。眼球焼灼直後の麻酔からの回復には流す海水(周囲温度:28°C)を用いた。眼球切除術の過程または経過後に死亡率は発生しなかった。ここで紹介するアイトークアブレーションプロトコルは、マッドクラブの卵巣成熟を加速させました。

概要

Scylla属に属する4つのマッドクラブ種はすべて、水産養殖において商業的に重要な甲殻類種です1,2。マッドクラブを含む甲殻類の成長、および時期尚早(亜成体または思春期)段階から性的に成熟した(成体)段階へのそれらの変化は、古くてより小さな外骨格の定期的な脱落を含む脱皮プロセスを通じて起こります。甲羅の幅(CW)、頬骨、および腹部皮弁の形態は、Scyll a sppの性的成熟を決定するために広く使用されています。3,4,5。脱皮のプロセスは、さまざまなホルモンの作用によって調節されており、膨大な量のエネルギーを必要とします6。通常の脱皮プロセスに加えて、自発的にまたは外的要因によって誘発される四肢の喪失は、生存率に影響を与えることなくカニの脱皮を促進します7,8,9。したがって、四肢の解剖術は、ソフトシェルマッドクラブ養殖業における脱皮誘導に一般的に使用されています7,9。

片側または両側の眼茎アブレーションは、生殖腺の成熟と種子生産のために淡水エビと海産エビで主に人気があります10,11,12,13。甲殻類における一般的な眼球切除技術には、以下が含まれる:(i)紐14,15を用いた眼球基部での結紮;(ii)熱い鉗子または電気焼灼装置16を使用した眼茎の焼灼;(iii)開いた傷を残すために眼茎を除去または直接つまむこと12;(iv)かみそり17で眼の遠位部を切開して眼球内容物を除去する工程。アイトークX器官は、甲殻類の高血糖ホルモン(CHH)、脱皮阻害ホルモン(MIH)、および硝子体形成阻害ホルモン(VIH)を調節するため、甲殻類の重要な内分泌器官です6,18,19,20,21,22。アイトークX器官(または副鼻腔腺複合体)は、神経ペプチドホルモンファミリーに属する生殖腺阻害ホルモン(GIH)を合成して放出します6。片側または両側の眼球アブレーションはGIH合成を減少させ、刺激ホルモン(すなわち、生殖腺刺激ホルモン、GSH)の優勢をもたらし、甲殻類の卵巣成熟プロセスの加速をもたらします23,24,25,26。眼球切除後のGIHの影響がなければ、雌の甲殻類は卵巣の発達にエネルギーを捧げます27。甲殻類の卵巣成熟の誘導には片側眼茎切除で十分であり11、エビやカニの切除された眼茎は数回の脱皮後に再生できることがわかっています28。Scylla属に記録されている卵巣の発達段階は4つあります:i)未熟(ステージ1)、ii)早熟(ステージ2)、iii)前成熟(ステージ3)、およびiv)完全に成熟(ステージ4)29,30。未熟卵巣期は未熟女性に見られます。思春期の脱皮と交尾の後、未熟な卵巣は発達し始め、最終的に成熟し(ステージ4)、産卵します31。

アイトークアブレーションプロトコルは、マッドクラブの繁殖資源の開発と種子の生産に不可欠です。世界の食品市場では、筋肉含有量の高いカニではなく、完全に成熟した卵巣(ステージ4)を持つ成熟したマッドクラブが消費者に好まれているため、大型のオスよりもさらに高い商品価値を持っています。マッドクラブのアイトークアブレーションのための完全なプロトコルはありません。この作業のアイトークアブレーションプロトコルは、完全に麻酔をかけられたカニを使用することでストレスを最小限に抑え、カニに刺されたことによる人員の身体的傷害を最小限に抑えます。このプロトコルは簡単で費用対効果に優れています。本稿では、生殖巣の成熟を誘導するス キュラ 属の眼茎切除のプロトコールを提示する。眼球焼灼術の2つの技術(焼灼と手術)をテストし、メスのマッドクラブの性腺発達率に基づいてそれらの効率を比較しました。

プロトコル

このプロトコルは、マレーシア実験動物科学協会によって概説された科学的目的のための動物の世話と使用のためのマレーシアの実施規範に従います。実験サンプルの犠牲は、実験動物の世話と使用のための国立衛生研究所ガイド(NIH出版物第8023号、1978年改訂)に従って行われました。性的に早産の雌の泥ガニ(オレンジ色の泥ガニ S.olivacea)は、マレーシアのセティウ湿地の地元の市場(5°66′62′N、102°72′33′′E)から収集されました。マッドクラブの種は、形態学的特徴に基づいて同定されました1。

1.サンプルの収集と消毒

  1. 健康で活動的で時期尚早のメスのマッドクラブを収集します(図1)。
    注:時期尚早の雌のカニは、三角形で明るい色の腹部フラップを持ち、CW範囲は80〜85mmです。
  2. カニを塩素化された水道水(淡水)で洗って、破片や浸透圧性寄生虫を取り除きます。
  3. カニを塩分濃度20pptの150ppmのホルムアルデヒドに30分間浸します。
  4. ホルムアルデヒド処理中は、エアストーンで継続的かつ穏やかな通気を維持します。曝気源は、中央曝気ラインまたは水槽曝気ポンプのいずれかからであり得る。
  5. 流れる海水でカニを洗い、残留ホルムアルデヒドを取り除きます。

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図1:性的成熟段階を特定するために使用された雌のマッドクラブの腹部形態。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2.順応

  1. 消毒した各メスを別々の32 L円形タンクに移します。
  2. 雌を20pptの塩分で3日間飼育し、カニの体重の約4%〜5%で刻んだ海産魚を1日2回(朝09:00 amと夕方20:00 pm)与え続けます。
  3. 朝の餌の前に吸い上げて、余分な食べ残しの餌を取り除きます。
  4. カニ飼育海水の10%(20ppt)を毎日交換します。

3.性的成熟のための誘発脱皮

  1. 滅菌ハサミを使用して水泳脚を除くすべての脚を切ります。
    1. スクープネットでカニを捕まえ、カニを慎重に持ちます。最初に両方の頬骨を切り、次にハサミを使用して第2関節の歩行脚を切ります。カニは損傷した付属物を自動的に自動トマイズします。四肢の解剖術には麻酔は必要ありません。
  2. 四肢の解剖直後に淡水でカニを洗います。
  3. 手足の自動トーミズされたカニを個別に穴あきプラスチックバスケット(長さ28 cm x 幅22 cm x 高さ7 cm )に移し、グラスファイバータンク(長さ305 cm x 幅120 cm x 高さ60 cm )に入れます。
    注意: 2つのバスケットを結んでクリップで留めることができます。トップバスケットは、カニがバスケットから逃げないようにカバーとして使用されます。
  4. 塩分濃度20ppt、水深10cm以上の再循環養殖システム(RAS)を使用して、プラスチックバスケット全体が水没するようにします。
  5. 四肢オートトミズされたメスのカニに、カニの体重の5%〜7%で1日2回、刻んだ海産魚を与え続けます。
  6. 脱皮によって性的に成熟するまで(35日)カニを育てます。
    注:誘発された脱皮は、野生の成熟した雌のマッドクラブによる商業的な卵巣の成熟と種子の生産のためにスキップすることができます。野生から収穫された成熟した雌は順応し、直接冷震麻酔とそれに続く眼球切除を受けなければなりません。

4.麻酔

  1. CW >86 mmの暗い楕円形の腹部皮弁を持つ性的に成熟した女性を選択します(図1)。
  2. スクープネットでカニを捕まえ、麻酔のために小さな水槽に個別に保管してください。
  3. 5分間の順応期間の後、2-フェノキシエタノール(2-PE)を2 mL / Lで各水槽に加え、15分間の麻酔治療を行います。
  4. 自発的な動きの欠如によってカニが完全に麻酔されていることを確認してください。

5.アイトークアブレーション

  1. 焼灼技術
    1. すべての手順は、テーブルの上と空きスペースで実行します。
    2. 木製またはプラスチック製のハンドルが付いた平らな頭のニッケル鋼の金属棒(ドライバーなど)を取り、濡れた綿タオルでハンドルを覆います。
    3. オートクレーブで2つのステンレス製外科用鉗子を滅菌します。
    4. スプレーボトルに70%エタノールを準備し、ブロートーチや赤いホットドライバーなどの火災関連の発生源から遠ざけてください。ティッシュペーパーを使用する準備をしてください。
      注:エタノールは非常に可燃性です。火源から安全な距離を保ってください。
    5. ブロートーチをガスボンベ(ブタン)にしっかりと接続します。
      注意: ブロートーチとガスボンベの指示に従ってください。ガスボンベに接続するときは、ブロートーチのスイッチがオフになっていることを確認してください。ガスボンベに記載されているすべての火災安全上の注意を読み、それに従ってください。
    6. 高温物による怪我を防ぐために、厚い綿の手袋を着用してください。
    7. 金属棒が真っ赤になるまで、金属棒の先端をトーチの火にさらします。
    8. 麻酔をかけたカニを濡れた綿タオルで覆います。
      注意: 不必要な損傷を避けるために、カニのアンテナを覆います。
    9. 滅菌した鉗子でカニの片目を持ちます。
      注:初めて使用する場合はオートクレーブで鉗子を滅菌し、その後他のカニに使用する場合は70%エタノールを使用して消毒します。
    10. 赤熱した金属の平らな先端をカニの目に持ち、目茎がオレンジ色または赤みがかったオレンジ色に変わるまで約10〜15秒間わずかに押します。隣接する構造物への損傷を避けるために、この手順を実行するときは注意してください。
      注:焼灼法に従って眼茎アブレーションを実行するには、カニを保持する人とアブレーション手順を実行する人の2人が必要です。
    11. カニ間の相互汚染がないことを確認するために、70%エタノールスプレーで鉗子を消毒します。
      注意: このステップは、眼球アブレーション手順の後、少なくとも5分間待ってから、潜在的な火災の危険を防ぐために70%エタノールを使用して消毒する前に鉗子が冷却されていることを確認するために実行してください。
    12. すべてのカニにアイトークアブレーションを行った後、熱いニッケル鋼の金属棒(ドライバー)を水道水に浸します。
    13. 再利用する前にタオルを消毒してください。時間を節約するために複数のタオルを使用できます。
      注意: タオルを水道水で洗い、30ppmの塩素水に5分間浸します。その後、タオルを再度水道水で洗い、1 g / Lのチオ硫酸ナトリウム溶液に浸します。
    14. 電源を切った後、トーチを安全な場所に保管し、環境温度(約30分)に戻るまで待ってから切断してください。
  2. 手術技術
    1. 換気の良い場所で手順を実行してください。
    2. オートクレーブで2つの外科用ハサミと鉗子を滅菌します。
    3. 50 mLの70%エタノールを100 mLのガラスビーカーに注ぎます。
    4. 厚い綿の手袋を着用してください。
    5. 麻酔をかけたカニを持ち、濡れた綿タオルで覆います。
    6. 滅菌した鉗子でカニの片目を持ちます。
    7. 滅菌した手術用ハサミを使用して眼球をすばやく切断します。
      注:カニの負傷部分から血リンパが失われる可能性があります。
    8. 使用するたびにハサミと鉗子を70%エタノールに浸し、ティッシュペーパーを使用して乾燥させてから再利用してください。

6.麻酔後のケア

  1. 20pptのろ過海水を準備し、連続通気のあるオーバーヘッドタンクに保管します。
  2. 重力水流のためにオーバーヘッドタンクにフレキシブルパイプを接続します。
  3. アイトークアブレーションの直後にカニをバスケットに入れ、頭上のタンクから流れる海水(周囲水温:28°C)にカニをさらします。
  4. 海水の流れを保ち、麻酔からの回復を示す自発的に動くことができるまでカニを監視します。
    注:海水は地上タンクで準備でき、水中ポンプを使用して水流を行うことができます。
  5. カニを個別に20pptの海水に入れ、水槽で30分間通気して観察します。
    注:回収されたカニは、その後の家畜養殖プロセスで個別に培養されます。

7.卵巣成熟の観察

  1. 家畜飼育
    1. 成熟したカニを個々の32 L円形タンクに移します。
    2. 刻んだ海産魚(-20°Cで冷凍)を1日2回(朝09:00 amと夕方20:00 pm)給餌を続け、朝の給餌の前に食べ残しを取り除きます。
    3. 20pptの塩分で30日間、個別に飼育します。
    4. 糞を取り除き、毎日海水の10%(20 ppt)を交換します。
  2. 解剖
    1. 解剖トレイ、はさみ、鉗子を70%エタノールで清掃します。
    2. 2-PE浸漬麻酔法で女性を個別に麻酔します。
    3. 性腺の段階を確認するために、眼球アブレーションを経ていない新しく成熟した女性(未熟な女性の脱皮後)をランダムに選択します。
    4. すべての眼茎切除実験雌を個別に犠牲にし、生殖腺の成熟段階を特定します。鋭い滅菌千枚通しを使用してカニの胸部神経節を破壊します。最初に上部の甲羅を取り除き、次に肝膵臓を取り除き、卵巣を見えるようにします。卵巣の色を観察し、卵巣の成熟段階を特定します(図2)。
  3. 卵巣成熟段階の識別
    1. 肉眼または実体顕微鏡で卵巣の色を観察します。
    2. 着色30に基づいて卵巣の成熟段階を特定します:未熟(ステージ1)は半透明またはクリーミーな白色を示します。早熟(ステージ2)は淡い黄色がかった色を示します。(iii)前成熟(ステージ3)は黄色から淡橙色を示す。(iv)完全に成熟した(ステージ4)は、濃いオレンジ色から赤みがかった色を示します。

結果

生殖腺の成熟
クリーム状の白い卵巣組織(未熟卵巣、ステージ1)は、眼茎アブレーションを行う前に、解剖された女性(n = 6)の100%に見られました(図2)。眼茎切除雌ガニ(n=63、焼灼術31頭、手術法32頭)の生殖巣成熟率は,眼茎切除を行わなかった雌ガニ(n=31)と比較して30日飼育後に高かった(図3)。成熟前の卵巣の割合が最も高かった(ステー...

ディスカッション

本プロトコールはマッドクラブ Scylla 属の眼茎切除術のために開発されたもので、生殖腺の成熟を誘導する効率的な方法として応用できる。このプロトコルは、マッドクラブの商業的卵巣成熟のために容易に複製することができ、マッドクラブ種子生産における潜伏期間(ある産卵から別の産卵までの時間)を短縮するために実施することができる。

甲殻類(すなわち...

開示事項

どの著者も利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、マレーシア教育省の支援を受け、マレーシアの高等教育センターオブエクセレンス(HICoE)プログラムの下で、マレーシアトレンガヌ大学熱帯水産養殖水産研究所に認定されました(Vot No. 63933およびVot No. 56048)。我々は、マレーシア・トレンガヌ大学及びサヤップ・ジャヤSdn. Bhd.のプライベート・パートナーシップ研究助成金(Vot. No. 55377) を通じた 支援に感謝する。マレーシア科学大学からコール・ワイホ、ハナフィア・ファザンの非常勤アカデミックフェローの地位も認められています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Aeration tube Ming Yu ThreeN/Aaquarium and pet shop
AirstoneMing Yu ThreeN/Aaquarium and pet shop
Autoclave machineHIRAYAMA MANUFACTURING CORPORATIONN/AMADE IN JAPAN
Bleaching powder (Hi-Chlon 70%)Nippon Soda Co.Ltd,JapanN/AN/A
Blow torch MR D.I.Y. Group BerhadN/AN/A
Circular tank (32L)BEST PLASTIC INDUSTRY SDN. BHD. N/AN/A
Cotton hand gloves (thick) MR D.I.Y. Group BerhadN/AN/A
Cotton towelMR D.I.Y. Group BerhadN/AN/A
Digital thermometerHanna InstrumentHI9814Hanna Instruments GroLine Hydroponics Waterproof pH / EC / TDS / Temp. Portable Meter HI9814
Digital Vernier CaliperINSIZE Co., Ltd.N/A
Dissecting trayHatcheri AKUATROP N/AResearch Center of Universiti Malaysia Terengganu
Dropper bottle/Plastic Pipettes DropperShopee MalaysiaN/AN/A
Ethanol 70%Thermo Scientific Chemicals033361.M1Diluted to 70% using double distilled water
Fiberglass tank (1 ton)Hatcheri AKUATROP N/AResearch Center of Universiti Malaysia Terengganu
Fine sandN/AN/Acollected from Sea beach of Universiti Malaysia Terengganu
First Aid KitsWatsons MalaysiaN/AN/A
Flat head nickel steel metal rod (Screw driver)MR D.I.Y. Group BerhadN/AN/A
FormaldehydeThermo Scientific Chemicals119690010
Gas cylinder (butane gas) for blow  torchMR D.I.Y. Group BerhadN/AN/A
Gas lighter gun (long head)MR D.I.Y. Group BerhadN/AN/A
Glass beaker (100 mL))Corning Life Sciences1000-100
Ice bag Watsons MalaysiaN/AN/A
Perforated plastic baskets Eco-Shop Marketing Sdn. Bhd.N/AN/A
PVC pipe 15mmBina Plastic Industries Sdn Bhd (HQ)N/AN/A
RefractometerATAGO CO.,LTD.
RefrigeratorSharp Corporation JapanN/AChest Freezer SHARP 110L - SJC 118
Scoop netMR D.I.Y. Group BerhadN/A
SeawaterHatcheri AKUATROP N/AResearch Center of Universiti Malaysia Terengganu
Siphoning pipeMR D.I.Y. Group BerhadN/AN/A
Spray bottleMr. DIY Sdn BhdN/AN/A
Stainless surgical forceps N/AN/AN/A
Stainless surgical scissors N/AN/AN/A
Submersible water pump ASN/Amodel: Astro 4000
Tincture of iodine solution  (Povidone Iodine)Farmasi Fajr Sdn BhdN/AN/A
Tissue paper N/AN/A
Transparent plastic aquariumMing Yu ThreeN/Aaquarium and pet shop
Waterproof tableHatcheri AKUATROP N/AResearch Center of Universiti Malaysia Terengganu

参考文献

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