Ablazione del gambo oculare per aumentare la maturazione ovarica nei granchi del fango

Riepilogo

Due protocolli di ablazione del peduncolo oculare (cioè approcci di cauterizzazione e chirurgia) sono stati eseguiti su granchi femmina anestetizzata. L'ablazione del gambo oculare dei granchi del fango ha accelerato la maturazione delle ovaie senza diminuire il tasso di sopravvivenza.

Abstract

I granchi del fango (Scylla spp.) sono specie di crostacei commercialmente importanti che possono essere trovati in tutta la regione del Pacifico indo-occidentale. Durante la coltura, l'induzione della maturazione ovarica è importante per soddisfare la domanda dei consumatori di granchi di fango maturi e accelerare la produzione di semi. L'ablazione del gambo oculare è uno strumento efficace per migliorare la maturazione ovarica nei granchi del fango. Tuttavia, non esiste un protocollo standard per l'ablazione del gambo oculare dei granchi del fango. In questo studio vengono descritte due tecniche di ablazione del gambo oculare: cauterizzazione (l'uso di metallo caldo per ablare il gambo oculare di un granchio anestetizzato) e chirurgia (la rimozione del gambo oculare usando forbici chirurgiche). Prima dell'ablazione del peduncolo oculare, le femmine sessualmente mature (CW > 86 mm) sono state anestetizzate usando una borsa del ghiaccio (-20 ° C) con acqua di mare. Quando la temperatura dell'acqua ha raggiunto i 4 °C, la borsa del ghiaccio è stata rimossa dall'acqua. L'acqua di mare corrente (temperatura ambiente: 28 °C) è stata utilizzata per il recupero dall'anestesia immediatamente dopo l'ablazione del peduncolo oculare. La mortalità non si è verificata durante o dopo il processo di ablazione del peduncolo oculare. Il protocollo di ablazione del gambo oculare qui presentato ha accelerato la maturazione ovarica dei granchi del fango.

Introduzione

Tutte e quattro le specie di granchio del fango appartenenti al genere Scylla sono specie di crostacei commercialmente importanti in acquacoltura ^1,2. La crescita dei crostacei, compresi i granchi del fango, e la loro trasformazione dalla fase prematura (sub-adulta o pubertale) alla fase sessualmente matura (adulta) avviene attraverso un processo di muta che comporta lo spargimento periodico di esoscheletri più vecchi e più piccoli. La larghezza del carapace (CW), i chelipedi e le morfologie dei lembo addominale sono ampiamente utilizzati per determinare la maturità sessuale di Scylla spp. ^3,4,5. Il processo di muta è regolato dall'azione di vari ormoni e richiede un'enorme quantità di energia⁶. Oltre al normale processo di muta, la perdita degli arti, volontariamente o indotta da fattori esterni, accelera la muta dei granchi senza influire sul loro tasso di sopravvivenza ^7,8,9. Pertanto, l'autotomia degli arti è comunemente usata per l'induzione della muta nell'industria dell'allevamento di granchi di fango a guscio molle ^7,9.

L'ablazione unilaterale o bilaterale del gambo oculare è per lo più popolare nei gamberi d'acqua dolce e nei gamberetti marini per la maturazione delle gonadi e la produzione di semi^10,11,12,13. Le tecniche comuni di ablazione del gambo oculare nei crostacei includono quanto segue: (i) legatura alla base del gambo oculare usando una corda^14,15; ii) cauterizzazione del peduncolo oculare mediante pinze calde o dispositivi di elettrocauterizzazione¹⁶; iii) rimozione o pizzicamento diretto del gambo oculare per lasciare una ferita aperta¹²; e (iv) rimozione del contenuto del gambo oculare attraverso l'incisione dopo aver tagliato la porzione distale dell'occhio con un rasoio¹⁷. Gli organi X del gambo oculare sono importanti organi endocrini nei crostacei in quanto regolano gli ormoni iperglicemici dei crostacei (CHH), gli ormoni che inibiscono la muta (MIH) e gli ormoni inibitori della vitellogenesi (VIH)6,18,19,20,21,22. Gli organi X del gambo oculare (o il complesso della ghiandola del seno) sintetizzano e rilasciano ormoni che inibiscono le gonadi (GIH), noti anche come ormoni che inibiscono la vitellogenesi (VIH), appartenenti alla famiglia degli ormoni neuropeptidici⁶. L'ablazione unilaterale o bilaterale del parlato oculare riduce la sintesi di GIH, determinando la dominanza degli ormoni stimolanti (cioè gli ormoni stimolanti le gonadi, GSH) e l'accelerazione del processo di maturazione ovarica nei crostacei^23,24,25,26. Senza l'influenza di GIH dopo l'ablazione del gambo oculare, le femmine di crostaceo dedicano la loro energia allo sviluppo ovarico²⁷. È stato riscontrato che l'ablazione unilaterale del gambo oculare è sufficiente per l'induzione della maturazione ovarica nei crostacei¹¹ e che il gambo oculare ablato di gamberetti e granchi può rigenerarsi dopo diverse mute²⁸. Ci sono quattro stadi di sviluppo ovarico registrati in Scylla spp.: i) immaturo (stadio-1), ii) maturazione precoce (stadio-2), iii) pre-maturazione (stadio-3) e iv) completamente maturo (stadio-4)^29,30. Lo stadio ovarico immaturo si trova nelle femmine immature. Dopo la muta puberale e l'accoppiamento, l'ovaio immaturo inizia a svilupparsi e infine matura (stadio-4) prima di deporre le^{uova 31}.

Un protocollo di ablazione del gambo oculare è essenziale per lo sviluppo dei riproduttori di granchi del fango e la produzione di semi. Nel mercato alimentare globale, i granchi di fango maturi con ovaie completamente mature (stadio-4) piuttosto che granchi con un contenuto muscolare più elevato sono preferiti dai consumatori e, quindi, hanno un valore commerciale più elevato, persino superiore ai maschi di grandi dimensioni. Non esiste un protocollo completo per l'ablazione del gambo oculare dei granchi del fango. Il protocollo di ablazione del gambo oculare in questo lavoro riduce al minimo lo stress utilizzando granchi completamente anestetizzati e riduce al minimo le lesioni fisiche al personale da morsi di granchio. Questo protocollo è facile ed economico. Qui presentiamo un protocollo per l'ablazione del peduncolo oculare di Scylla spp. che può indurre la maturazione della gonade. Sono state testate due tecniche di ablazione del peduncolo oculare (cauterizzazione e chirurgia) e le loro efficienze sono state confrontate in base al tasso di sviluppo gonadico delle femmine di granchi del fango.

Protocollo

Questo protocollo segue il Codice di condotta malese per la cura e l'uso di animali per scopi scientifici delineato dalla Laboratory Animal Science Association of Malaysia. Il sacrificio dei campioni sperimentali è stato fatto secondo la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, revised 1978). Granchi del fango femmina sessualmente prematuri (granchio del fango arancione S. olivacea) sono stati raccolti dal mercato locale (5 ° 66 ′ 62 ′ N, 102 ° 72 ′ 33 ′ E) nelle zone umide di Setiu in Malesia. La specie di granchio del fango è stata identificata in base alle caratteristiche morfologiche¹.

1. Raccolta e disinfezione dei campioni

1. Raccogliere granchi del fango femmina sani, attivi e prematuri (Figura 1).
   NOTA: I granchi femmina prematuri hanno lembi addominali triangolari e di colore chiaro insieme a una gamma CW di 80-85 mm.
2. Lavare i granchi con acqua di rubinetto clorata (acqua dolce) per rimuovere detriti e parassiti osmofili.
3. Immergere i granchi in 150 ppm di formaldeide con 20 ppt di salinità per 30 min.
4. Mantenere un'aerazione continua e delicata con airstones durante il trattamento con formaldeide. La fonte di aerazione può provenire da una linea di aerazione centrale o da una pompa di aerazione per acquari.
5. Lavare i granchi con acqua di mare corrente per rimuovere eventuali residui di formaldeide.

Figura 1: Morfologia addominale delle femmine di granchi del fango utilizzate per identificare le fasi di maturazione sessuale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Acclimatazione

1. Trasferire ogni femmina disinfettata in un serbatoio circolare separato da 32 litri.
2. Allevare le femmine per 3 giorni in 20 ppt di salinità e continuare a nutrirsi due volte al giorno (mattina 09:00 e sera 20:00) con pesce marino tritato a circa il 4%-5% del peso corporeo del granchio.
3. Rimuovere il mangime in eccesso e non consumato sifonando prima della poppata mattutina.
4. Scambia il 10% dell'acqua di mare che alleva granchi (20 ppt) al giorno.

3. Muta indotta per la maturità sessuale

1. Tagliare tutte le gambe tranne le gambe da nuoto usando forbici sterilizzate.
   1. Prendi il granchio con una rete a paletta e tieni il granchio con cura. Tagliare prima entrambi i chelipedi e poi le gambe che camminano alla seconda articolazione usando le forbici. Il granchio automatizzerà automaticamente le appendici danneggiate. L'anestesia non è richiesta per l'autotomia degli arti.
2. Lavare il granchio in acqua dolce subito dopo l'autotomia degli arti.
3. Trasferire singolarmente i granchi autotomizzati in cesti di plastica perforati (28 cm L x 22 cm L x 7 cm A) e metterli in una vasca in fibra di vetro (305 cm L x 120 cm L x 60 cm A).
   NOTA: Due cestini possono essere legati e agganciati insieme. Il cesto superiore viene utilizzato come copertura in modo che il granchio non possa fuoriuscire dal cesto.
4. Utilizzare un sistema di acquacoltura a ricircolo (RAS) con salinità di 20 ppt e una profondità dell'acqua di almeno 10 cm per garantire che l'intero cestello di plastica sia immerso.
5. Continuare a nutrire il granchio femmina autotomizzato con pesce marino tritato due volte al giorno al 5% -7% del peso corporeo del granchio.
6. Allevare i granchi fino a quando non maturano sessualmente attraverso la muta (35 giorni).
   NOTA: La muta indotta può essere saltata per la maturazione ovarica commerciale e la produzione di semi con granchi del fango femmina maturi selvatici. Le femmine mature raccolte in natura devono essere acclimatate e sottoposte direttamente all'anestesia da shock freddo e alla successiva ablazione del gambo oculare.

4. Anestesia

1. Seleziona femmine sessualmente mature con un lembo addominale di forma ovale di colore scuro con un CW >86 mm (Figura 1).
2. Prendi i granchi con una rete a paletta e tienili individualmente in piccoli acquari per l'anestesia.
3. Dopo 5 minuti di periodo di acclimatazione, aggiungere 2-fenossietanolo (2-PE) a 2 ml / L in ciascun acquario e consentire 15 minuti di trattamento anestesiologico.
4. Assicurati che i granchi siano completamente anestetizzati dalla mancanza di movimento spontaneo.

5. Ablazione del gambo oculare

1. Tecnica di cauterizzazione
   1. Eseguire tutte le procedure sopra un tavolo e in un'area aperta.
   2. Prendi un'asta di metallo nichel-acciaio a testa piatta (ad esempio, un cacciavite) con un manico di legno o plastica e copri il manico con un asciugamano di cotone bagnato.
   3. Sterilizzare due pinze chirurgiche in acciaio inossidabile in autoclave.
   4. Preparare il 70% di etanolo in un flacone spray e tenerlo lontano da qualsiasi fonte legata al fuoco, come la fiamma ossidrica e il cacciavite rovente. Avere carta velina pronta per l'uso.
      NOTA: L'etanolo è altamente infiammabile. Mantenere una distanza di sicurezza dalle fonti di fuoco.
   5. Collegare saldamente una fiamma ossidrica a una bombola di gas (butano).
      ATTENZIONE: Seguire le istruzioni riportate sulla fiamma ossidrica e sulla bombola del gas. Assicurarsi che la fiamma ossidrica sia spenta quando si collega con la bombola del gas. Leggere e seguire tutte le precauzioni di sicurezza antincendio menzionate sulla bombola del gas.
   6. Indossare guanti di cotone spessi per evitare lesioni da oggetti caldi.
   7. Sottoporre la punta dell'asta metallica al fuoco della fiamma ossidrica fino a quando l'asta metallica è rosso vivo.
   8. Coprire il granchio anestetizzato con un asciugamano di cotone bagnato.
      NOTA: Coprire le antenne del granchio per evitare danni inutili.
   9. Tieni un occhio del granchio con una pinza sterilizzata.
      NOTA: Sterilizzare la pinza in autoclave per il primo utilizzo e disinfettare utilizzando etanolo al 70% per l'uso successivo su altri granchi.
   10. Tenere la punta piatta di metallo rovente sull'occhio del granchio e premere leggermente per circa 10-15 s fino a quando il gambo oculare diventa di colore arancione o rosso-arancio. Fare attenzione quando si esegue questo passaggio per evitare danni alle strutture adiacenti.
       NOTA: Sono necessarie due persone per eseguire l'ablazione del gambo oculare seguendo il metodo di cauterizzazione: una per tenere il granchio e un'altra per eseguire la procedura di ablazione.
   11. Disinfettare la pinza con spray etanolo al 70% per garantire che non vi sia contaminazione incrociata tra i granchi.
       NOTA: eseguire questo passaggio solo attendendo almeno 5 minuti dopo la procedura di ablazione del peduncolo oculare per assicurarsi che le pinze siano raffreddate prima della disinfezione utilizzando etanolo al 70% per prevenire potenziali rischi di incendio.
   12. Dopo aver eseguito l'ablazione del gambo oculare su tutti i granchi, immergere l'asta metallica calda in acciaio nichelato (cacciavite) nell'acqua del rubinetto.
   13. Disinfettare l'asciugamano prima del riutilizzo. È possibile utilizzare più asciugamani per risparmiare tempo.
       NOTA: Lavare l'asciugamano con acqua del rubinetto e immergerlo in 30 ppm di acqua clorata per 5 minuti. Quindi, lavare nuovamente l'asciugamano con acqua di rubinetto e immergerlo in una soluzione di tiosolfato di sodio da 1 g / L.
   14. Tenere la fiamma ossidrica in un luogo sicuro dopo averla spenta e attendere che ritorni alla temperatura ambientale (circa 30 minuti) prima di scollegarla.
2. Tecnica chirurgica
   1. Eseguire la procedura in un'area ben ventilata.
   2. Sterilizzare due forbici chirurgiche e pinze in autoclave.
   3. Versare 50 ml di etanolo al 70% in un becher di vetro da 100 ml.
   4. Indossare guanti di cotone spessi.
   5. Tenere il granchio anestetizzato e coprirlo con un asciugamano di cotone bagnato.
   6. Tieni un occhio del granchio con una pinza sterilizzata.
   7. Tagliare rapidamente il gambo oculare usando forbici chirurgiche sterilizzate.
      NOTA: L'emolinfa può essere persa dalla parte ferita del granchio.
   8. Immergere le forbici e le pinze in etanolo al 70% dopo ogni utilizzo e asciugarle con carta velina prima di riutilizzarle.

6. Cura post-anestesia

1. Preparare 20 ppt di acqua di mare filtrata e conservare in un serbatoio sopraelevato con aerazione continua.
2. Collegare un tubo flessibile con il serbatoio aereo per il flusso d'acqua gravitazionale.
3. Subito dopo l'ablazione del gambo oculare, posizionare il granchio nel cestello e sottoporlo all'acqua di mare corrente (temperatura dell'acqua ambiente: 28 °C) dalla vasca sopraelevata.
4. Mantenere l'acqua di mare che scorre e monitorare il granchio fino a quando non può muoversi spontaneamente, il che indica il recupero dall'anestesia.
   NOTA: l'acqua di mare può essere preparata in un serbatoio di terra e una pompa dell'acqua sommergibile può essere utilizzata per il flusso d'acqua.
5. Tenere i granchi singolarmente in 20 ppt di acqua di mare con aerazione in un acquario per 30 minuti per ulteriori osservazioni.
   NOTA: I granchi recuperati saranno coltivati individualmente nel successivo processo di coltura dei riproduttori.

7. Osservazione della maturazione ovarica

1. Allevamento di riproduttori
   1. Trasferire i granchi maturi in singole vasche circolari da 32 litri.
   2. Continuare a nutrirsi con pesce marino tritato (congelato a -20 °C) due volte al giorno (mattina 09:00 e sera 20:00) e rimuovere il mangime non consumato prima della poppata mattutina.
   3. Allevare i riproduttori singolarmente per 30 giorni con una salinità di 20 ppt.
   4. Rimuovere le feci e scambiare il 10% dell'acqua di mare (20 ppt) al giorno.
2. Dissezione
   1. Pulire un vassoio da dissezione, forbici e pinze con etanolo al 70%.
   2. Anestetizzare le femmine individualmente con il metodo di anestesia ad immersione 2-PE.
   3. Seleziona casualmente le femmine appena mature (dopo la muta delle femmine premature) che non hanno subito l'ablazione oculare per confermare i loro stadi gonadici.
   4. Sacrificare individualmente tutte le femmine sperimentali ablate dagli occhi e identificare gli stadi di maturazione delle gonadi. Distruggi i gangli toracici del granchio usando un punteruolo sterile affilato. Rimuovere prima il carapace superiore e poi l'epatopancreas per rendere visibile l'ovaio. Osservare il colore dell'ovaio e identificare lo stadio di maturazione ovarica (Figura 2).
3. Identificazione delle fasi di maturazione ovarica
   1. Osservare il colore dell'ovaio ad occhio nudo o sotto uno stereomicroscopio.
   2. Identificare le fasi di maturazione ovarica in base alla colorazione³⁰: l'immaturo (stadio-1) mostra un colore bianco traslucido o crema; la maturazione precoce (stadio-2) mostra un colore da pallido a giallastro chiaro; iii) la prestagionatura (fase 3) presenta un colore da giallo ad arancio chiaro; e (iv) il completamente maturo (stadio-4) mostra un colore da arancione scuro a rossastro.

Risultati

Maturazione delle gonadi
Tessuti ovarici bianco crema (ovaie immature, stadio 1) sono stati trovati nel 100% delle femmine sezionate (n = 6) prima di eseguire l'ablazione del gambo oculare (Figura 2). Il tasso di maturazione delle gonadi dei granchi femmina ablati con gambo oculare (n = 63; 31 femmine con la tecnica di cauterizzazione e 32 femmine con la tecnica chirurgica) era più alto rispetto ai granchi femmina che non sono stati sottoposti ad ablazione del gambo ocul...

Discussione

Questo protocollo è stato sviluppato per l'ablazione del peduncolo oculare del granchio del fango, Scylla spp., e può essere applicato come metodo efficace per indurre la maturazione delle gonadi. Questo protocollo può essere facilmente replicato per la maturazione ovarica commerciale dei granchi del fango e può essere implementato per ridurre il periodo di latenza (tempo da una deposizione all'altra) nella produzione di semi di granchio del fango.

L'ablazione del gambo oculare de...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aeration tube	Ming Yu Three	N/A	aquarium and pet shop
Airstone	Ming Yu Three	N/A	aquarium and pet shop
Autoclave machine	HIRAYAMA MANUFACTURING CORPORATION	N/A	MADE IN JAPAN
Bleaching powder (Hi-Chlon 70%)	Nippon Soda Co.Ltd,Japan	N/A	N/A
Blow torch	MR D.I.Y. Group Berhad	N/A	N/A
Circular tank (32L)	BEST PLASTIC INDUSTRY SDN. BHD.	N/A	N/A
Cotton hand gloves (thick)	MR D.I.Y. Group Berhad	N/A	N/A
Cotton towel	MR D.I.Y. Group Berhad	N/A	N/A
Digital thermometer	Hanna Instrument	HI9814	Hanna Instruments GroLine Hydroponics Waterproof pH / EC / TDS / Temp. Portable Meter HI9814
Digital Vernier Caliper	INSIZE Co., Ltd.	N/A
Dissecting tray	Hatcheri AKUATROP	N/A	Research Center of Universiti Malaysia Terengganu
Dropper bottle/Plastic Pipettes Dropper	Shopee Malaysia	N/A	N/A
Ethanol 70%	Thermo Scientific Chemicals	033361.M1	Diluted to 70% using double distilled water
Fiberglass tank (1 ton)	Hatcheri AKUATROP	N/A	Research Center of Universiti Malaysia Terengganu
Fine sand	N/A	N/A	collected from Sea beach of Universiti Malaysia Terengganu
First Aid Kits	Watsons Malaysia	N/A	N/A
Flat head nickel steel metal rod (Screw driver)	MR D.I.Y. Group Berhad	N/A	N/A
Formaldehyde	Thermo Scientific Chemicals	119690010
Gas cylinder (butane gas) for blow  torch	MR D.I.Y. Group Berhad	N/A	N/A
Gas lighter gun (long head)	MR D.I.Y. Group Berhad	N/A	N/A
Glass beaker (100 mL))	Corning Life Sciences	1000-100
Ice bag	Watsons Malaysia	N/A	N/A
Perforated plastic baskets	Eco-Shop Marketing Sdn. Bhd.	N/A	N/A
PVC pipe 15mm	Bina Plastic Industries Sdn Bhd (HQ)	N/A	N/A
Refractometer	ATAGO CO.,LTD.
Refrigerator	Sharp Corporation Japan	N/A	Chest Freezer SHARP 110L - SJC 118
Scoop net	MR D.I.Y. Group Berhad		N/A
Seawater	Hatcheri AKUATROP	N/A	Research Center of Universiti Malaysia Terengganu
Siphoning pipe	MR D.I.Y. Group Berhad	N/A	N/A
Spray bottle	Mr. DIY Sdn Bhd	N/A	N/A
Stainless surgical forceps	N/A	N/A	N/A
Stainless surgical scissors	N/A	N/A	N/A
Submersible water pump	AS	N/A	model: Astro 4000
Tincture of iodine solution  (Povidone Iodine)	Farmasi Fajr Sdn Bhd	N/A	N/A
Tissue paper	N/A	N/A
Transparent plastic aquarium	Ming Yu Three	N/A	aquarium and pet shop
Waterproof table	Hatcheri AKUATROP	N/A	Research Center of Universiti Malaysia Terengganu