BS3 Kimyasal Çapraz Bağlama Testi: Kemirgen Beyninde Kronik Stresin Hücre Yüzeyi GABAA Reseptör Sunumu Üzerindeki Etkisinin Değerlendirilmesi

Özet

BS3 kimyasal çapraz bağlama testi, kronik psikososyal stres koşulları altında fare beyinlerinde azalmış hücre yüzeyi GABA_A reseptör ekspresyonunu ortaya koymaktadır.

Özet

Anksiyete, bilişsel işlevler de dahil olmak üzere hayvan davranışlarını değişken olarak etkileyen bir duygu durumudur. Davranışsal anksiyete belirtileri hayvan krallığında gözlenir ve çok çeşitli stres modalitelerine uyarlanabilir veya uyumsuz tepkiler olarak kabul edilebilir. Kemirgenler, moleküler, hücresel ve devre seviyelerinde anksiyetenin bütünleştirici mekanizmalarını ele alan translasyonel çalışmalar için kanıtlanmış bir deneysel model sunmaktadır. Özellikle, kronik psikososyal stres paradigması, insanlar ve kemirgenler arasında benzer olan anksiyete / depresif benzeri davranışsal fenotipleri taklit eden uyumsuz tepkileri ortaya çıkarır. Önceki çalışmalar, kronik stresin beyindeki nörotransmitter içeriği üzerinde önemli etkileri gösterirken, stresin nörotransmitter reseptör seviyeleri üzerindeki etkisi yeterince çalışılmamıştır. Bu makalede, kronik stres altındaki farelerde nörotransmitter reseptörlerinin nöronal yüzey seviyelerini ölçmek için deneysel bir yöntem sunuyoruz, özellikle duygu ve bilişin düzenlenmesinde rol oynayan gama-aminobütirik asit (GABA) reseptörlerine odaklanıyoruz. Membran geçirimsiz geri dönüşümsüz kimyasal çapraz bağlayıcı bisülfosuccinimidyl suberat (BS3) kullanarak, kronik stresin prefrontal korteksteki GABA_A reseptörlerinin yüzey mevcudiyetini önemli ölçüde azalttığını gösteriyoruz. GABA_A reseptörlerinin nöronal yüzey seviyeleri, GABA nörotransmisyonu için hız sınırlayıcı bir süreçtir ve bu nedenle, deneysel hayvan modellerinde moleküler bir belirteç veya anksiyete / depresif benzeri fenotiplerin derecesinin bir vekili olarak kullanılabilir. Bu çapraz bağlama yaklaşımı, herhangi bir beyin bölgesinde ifade edilen nörotransmiterler veya nöromodülatörler için çeşitli reseptör sistemlerine uygulanabilir ve duygu ve bilişin altında yatan mekanizmaların daha derin bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunması beklenir.

Giriş

Nörotransmitter reseptörleri ya nöronal plazma membran yüzeyinde ya da hücre içi olarak endomembranlarda (örneğin, endozom, endoplazmik retikulum [ER] veya trans-Golgi aparatı) lokalize olur ve nöronlardaki içsel fizyolojik durumlara bağlı olarak veya dışsal sinir ağı aktivitelerine yanıt olarak bu iki bölme arasında dinamik olarak mekik dokumaktadır ^1,2. Yeni salgılanan nörotransmitterler fizyolojik fonksiyonlarını öncelikle yüzey-lokalize reseptör havuzu aracılığıyla ortaya çıkardığından, belirli bir nörotransmitter için yüzey reseptör seviyeleri, nöral devre³ içindeki sinyal kapasitesinin kritik belirleyicilerinden biridir.

Kültürlenmiş nöronlarda yüzey reseptör seviyelerini izlemek için, yüzey biyotinilasyon testi⁴, geçirgen olmayan koşullarda spesifik bir antikora sahip immünofloresan testi⁵ veya genetik olarak pH'a duyarlı floresan optik göstergeyle (örneğin, pHluorin⁾ kaynaşmış bir reseptör transgeninin kullanımı dahil olmak üzere çeşitli yöntemler mevcuttur. Buna karşılık, bu yaklaşımlar in vivo yüzey reseptör seviyelerini değerlendirirken sınırlı veya pratik değildir. Örneğin, yüzey biyotinilasyon prosedürü, nispeten yüksek fiyatı ve avidin konjuge boncuklar üzerindeki biyotinile proteinlerin saflaştırılması için gerekli sonraki adımlar nedeniyle büyük miktarlarda ve in vivo beyin dokularının örnek sayılarını işlemek için pratik olmayabilir. Üç boyutlu beyin mimarisine gömülü nöronlar için, düşük antikor erişilebilirliği veya mikroskop tabanlı nicelemedeki zorluklar, in vivo yüzey reseptör seviyelerini değerlendirmek için önemli bir sınırlama oluşturabilir. Nörotransmitter reseptörlerinin bozulmamış beyinlerdeki dağılımını görselleştirmek için, pozitron emisyon tomografisi gibi non-invaziv yöntemler, reseptör doluluğunu ölçmek ve yüzey reseptör seviyelerini tahmin etmek için kullanılabilir⁷. Bununla birlikte, bu yaklaşım kritik olarak belirli radyo ligandlarının, pahalı ekipmanların ve özel uzmanlığın mevcudiyetine dayanır ve bu da çoğu araştırmacı tarafından rutin kullanım için daha az erişilebilir olmasını sağlar.

Burada, deneysel hayvan beyinlerindeki yüzey reseptör seviyelerini ex vivo olarak ölçmek için suda çözünür, membran geçirimsiz bir kimyasal çapraz bağlayıcı olan bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3^{) 8,9} kullanarak basit, çok yönlü bir yöntem açıklıyoruz. BS3, lizin kalıntılarının yan zincirindeki birincil aminleri hedefler ve birbirine yakın proteinlere kovalent olarak çapraz bağlayabilir. Beyin dilimleri ilgilenilen bir bölgeden taze olarak hazırlandığında ve BS3 içeren bir tamponda inkübe edildiğinde, hücre yüzey reseptörleri komşu proteinlerle çapraz bağlanır ve böylece daha yüksek moleküler ağırlıklı türlere dönüşürken, hücre içi endomembran ile ilişkili reseptörler değiştirilmeden kalır. Bu nedenle, yüzey ve hücre içi reseptör havuzları sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrılabilir ve incelenecek reseptöre özgü antikorlar kullanılarak batı lekesi ile ölçülebilir.

Öngörülemeyen kronik hafif stres (UCMS), kemirgenlerde kronik psikososyal stresi indüklemek için iyi kurulmuş bir deneysel paradigmadır¹⁰. KMYS, GABA ve reseptörleri^10,11 dahil olmak üzere bir dizi nörotransmitter sisteminin modülasyonu yoluyla anksiyete / depresif benzeri davranışsal fenotipleri ve bilişsel eksiklikleri ortaya çıkarır. Özellikle, α5 alt birimi içeren GABA A reseptörü (α5-GABA_AR), hafıza ve bilişsel işlevlerin düzenlenmesinde rol oynar^12,13, bu alt birimin değiştirilmiş fonksiyonlarının UCMS kaynaklı bilişsel eksikliklere olası katılımını düşündürmektedir. Bu protokolde, BS3 çapraz bağlama testini, stressiz kontrol farelerine kıyasla UCMS'ye maruz kalan farelerin prefrontal korteksindeki yüzey eksprese α5-GABA_AR seviyelerini ölçmek için kullandık.

Protokol

Bu protokoldeki tüm hayvan çalışmaları, Ontario Araştırma Hayvanları Yasası (RSO 1990, Bölüm A.22) ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi (CCAC) uyarınca tamamlanmış ve Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvanların hazırlanması

1. Deneylerde kullanılacak hayvan sayılarını belirleyin ve bunları uygun gruplara veya deney kohortlarına bölün. Grup büyüklüğü, cinsiyeti ve istatistiksel gücü hakkında bir tartışma için tartışma bölümüne bakın.
   NOT: Bu protokol fareler için özelleştirilmiştir (C57BL6/J suşu; 2-4 aylık; tipik olarak 20-30 g vücut ağırlığı; kullanılacak eşdeğer sayıda erkek ve dişi).
2. Hayvanları UCMS altına yerleştirin veya daha önce^14'te açıklandığı gibi protokolü izleyerek 5-8 hafta boyunca stresli olmayan koşulları kontrol edin.
3. Son UCMS prosedüründen sonra, reseptör ekspresyonu üzerindeki akut stres etkilerinden kaçınmak için çapraz bağlama testi için kullanmadan önce hayvanların 1 gün boyunca ev kafeslerinde kalmalarına izin verin.

2. Stok çözümlerinin hazırlanması

1. Aşağıdaki çözümleri tahlilden önce talimat verildiği şekilde hazırlayın ve saklayın.
   1. 14.6 g NaCl'yi 40 mL deiyonize suda çözerek 5 M NaCl hazırlayın. Oda sıcaklığında (RT) saklayın.
   2. 3.22 g KCl'yi 40 mL deiyonize suda çözerek 1.08 M KCl hazırlayın. RT'de depolayın.
   3. 3.25 g MgCl 2·6H 2O'yu 40 mL deiyonize suda çözerek 400 mM MgCl₂ hazırlayın. RT'de depolayın.
   4. 3 g glisini 40 mL deiyonize suda çözerek 1 M glisin hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
   5. 10 mL deiyonize suda 1.54 g DTT'yi çözerek 1 M ditiyotreitol (DTT) hazırlayın. Gözenek boyutu 0,2 μm olan bir filtreden geçirin ve 2 mL tüplere aliquot yapın. −20 °C'de saklayın.
   6. %10 Nonidet-P40 (NP-40) değerini deiyonize suda 1:10 (v/v) oranında seyrelterek hazırlayın. RT'de depolayın.
   7. 0,5 M EDTA (pH = 8,0) hazırlayın ve RT'de saklayın.
   8. 1 M HEPES tamponu (pH = 7.2-7.5) hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
   9. 2,5 M veya %45 (w/v) glikoz hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.

3. İş istasyonunun hazırlanması

1. BS3 çapraz bağlama testi gününde, aşağıdaki malzemeleri hayvan diseksiyon odasında toplayın (Şekil 1), buz üzerinde önceden soğutulmuş birkaç öğe ile: bir buz kovası, bir metal sıcaklık bloğu (buz üzerinde önceden soğutulmuş), 50 mL'lik bir konik tüpte buz gibi soğuk PBS ve bir Petri kabında dondurulmuş PBS, PBS ile nemlendirilmiş ve soğutulmuş düz bir yüzeye veya mavi buza yerleştirilmiş filtre kağıdı, buz üzerinde önceden soğutulmuş bir beyin matrisi (tıraş bıçağı yerleştirme için 1 mm aralık), buz üzerinde önceden soğutulmuş tıraş bıçakları (~ 10), diseksiyon aletleri (makas, forseps, kavisli bir prob), bir doku zımbası,% 70 etanol sprey silme kağıdı ve kağıt havlular, pipet uçları (200 μL), bir pipetleyici (P200), bir kronometre, bir not defteri, bir kalem ve mikrosantrifüj tüpleri (1,5 mL).
   1. Tahlilden önce, mikrosantrifüj tüplerini numune bilgileriyle etiketleyin (örneğin, hayvan kimlik numarası, tedavi tipi [UCMS'ye karşı stressiz (NS)], beyin bölgesi, BS3'lü veya BS3'süz, vb.).
      NOT: BS3 çapraz bağlama testleri için, her beyin bölgesinden iki örnek toplanmalıdır; bir numune çapraz bağlama (BS3 ile) ve diğeri çapraz bağlanma olmayan reaksiyon (BS3 olmadan) için bir kontrol olarak kullanılacaktır. Bu nedenle, 12 farede iki beyin bölgesinden (yani, prefrontal korteks [PFC] ve hipokampus [HPC]) örneklemek için, ilk örnekleme için 48 tüp etiketleyin (= 2 örnek × 2 bölge × 12 fare) (bölüm 6'da kullanılacaktır). Daha sonra depolamak üzere 48 tüpten oluşan ek iki seti etiketleyin (her numunenin iki farklı hacmini [100 μL, 300 μL] depolamak için) (bölüm 7'de kullanılacaktır). Bu nedenle, bu kohort boyutu için toplam 144 tüpün etiketlenmesi gerekmektedir.
2. Ek olarak, laboratuvarda aşağıdaki ekipmanların bulunduğundan emin olun: masa üstü soğutmalı mikrosantrifüj, bir sonikatör, bir tüp rotatör (soğuk odada veya buzdolabının içinde kullanılacak [4 °C]), numuneleri depolamak için bir dondurucu (-80 °C) ve numunelerin geçici olarak depolanması için bir kova kuru buz (bölüm 7'de kullanılacaktır)

4. Çalışma çözeltilerinin ve tamponların hazırlanması

NOT: Tahlil sabahında, aşağıdaki çözeltileri hazırlayın. Bu hesaplama, 12 fareden iki beyin bölgesini (yani PFC ve HPC) işlemek için gerekli çözümlere dayanmaktadır.

1. Tablo 1'de belirtildiği gibi yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF, pH = 7.4) hazırlayın. Her bir numune alma tüpüne (adım 3.1.1'de etiketlenen 48 tüp) 750 μL aCSF dağıtın ve tamponu önceden soğutmak için bunları buz üzerindeki metal sıcaklık bloğuna yerleştirin.
2. Lizis tamponunu Tablo 2'de belirtildiği gibi hazırlayın. Buz üzerinde saklayın (numune başına 400 μL kullanılacaktır).
3. 5 mM sodyum sitrat tamponunda (pH = 5.0) 52 mM BS3 stok çözeltisi (26x) hazırlayın.
   1. İlk olarak, 100 mM sitrik asit (stok A) ve 100 mM sodyum sitrat (stok B) hazırlayın.
   2. Stok A ve stok B'yi deiyonize su ile 1:20 oranında seyreltin. Sırasıyla 5 mM sitrik asit (stok C) ve 5 mM sodyum sitrat (stok D) hazırlamak için her biri 1,9 mL suya 100 μL ekleyin.
   3. 5 mM sodyum sitrat tamponu (pH = 5.0) (çözelti E, 1 mL) hazırlamak için 410 μL stok C ve 590 μL stok D'yi karıştırın.
   4. Bir pH gösterge şeridi kullanarak E çözeltisinin pH'ını onaylayın.
   5. BS3 stok çözeltisini (26x) hazırlamak için 24 mg BS3'ü 806.4 μL E çözeltisi içinde 30 s boyunca vorteks yaparak çözün.
   6. Çapraz bağlanmayan numuneler için araç kontrolü olarak kullanmak üzere 1 mL'lik başka bir E çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Diğer her şey hazır olduğunda ve deney başlamak üzereyken BS3 stok çözeltisini hazırlayın. BS3, kullanılıncaya kadar 4 °C'de kurutularak saklanmalıdır. Yeniden yapılandırıldıktan sonra, BS3 sadece yaklaşık ≤3 saat boyunca aktif kalır. 5 mM sodyum sitrat tamponunun (çözelti E) pH'ının zamanla yükseldiği ve BS3 hidrolizinin hızlanmasına neden olduğu bildirildiğinden, E çözeltisinin stok çözeltileri A ve^B9'dan taze olarak hazırlanması önerilir. BS3'ün düşük sıcaklıklarda sınırlı çözünürlüğü nedeniyle, yeniden yapılandırılmış BS3'ü RT'de tutun. yeniden yapılandırılmış BS3'ü 3 saatte kullanın ve yeniden yapılandırılmış BS3'ü dondurmayın / çözmeyin veya yeniden kullanmayın.

5. Beyin dokularının diseksiyonu

NOT: Bu adımdan itibaren, en az iki kişi koordineli bir şekilde birlikte çalışmalıdır. Bir kişi hayvan diseksiyonuna odaklanırken (adım 5.2-5.10 ve adım 6.3), diğer kişi zaman tutucu olarak çalışmalı ve tahlilin koordine edilmesine yardımcı olmalıdır (adım 5.1, adım 6.1, adım 6.2, adım 6.4 ve adım 6.5)

1. Diseksiyon için ilk hayvanı konut alanından diseksiyon odasına getirin.
   NOT: Akut stresörler (örneğin, yeni bir ortam, kan kokusu) beyin protein dinamiklerini etkileyebileceğinden, hayvanlar diseksiyon alanından uzağa yerleştirilmiş ev kafeslerinde tutulmalı ve daha sonra derhal dekapitasyon için diseksiyon odasına ayrı ayrı getirilmelidir.
2. Fareyi servikal çıkık ve ardından kafa kesme ile ötenazi yapın. Beyni kafatasından hızla çıkarın ve 10-15 s boyunca bir Petri kabında buz gibi PBS'ye batırın (Şekil 2).
   NOT: Hayvanlar BS3 deneyleri için uyuşturulmamıştır, çünkü herhangi bir anestezik ajan nörotransmitter reseptörlerinin yüzey sunum seviyesini potansiyel olarak etkileyebilir⁹.
3. Soğutulmuş beyni, beynin ventral tarafı yukarı bakacak şekilde buz üzerindeki beyin matrisine yerleştirin (Şekil 3).
4. Beyni koronal olarak kesmek için ilk tıraş bıçağını koku alma ampulü ile koku alma pedinkülü arasındaki sınırdan yerleştirin (Şekil 4). Üç ila dört ek tıraş bıçağı kullanarak, beynin ön kısmını 1 mm aralıklarla koronal olarak seri olarak kesin.
5. Yerleştirilen tüm tıraş bıçaklarını bir arada tutarak koronal dilimleri beyin matrisinden kaldırın ve beynin arka kısmını beyin matrisinde geride bırakın. Tıraş bıçağını birbirinden ayırmak için forseps kullanın ve beyin dilimi yukarı bakacak şekilde düz, soğutulmuş yüzeye yerleştirin (Şekil 5).
6. İlgilenilen bölgeyi içeren dilimleri tanımlayın. PFC'yi örneklemek için, koku alma pedinkülünü içeren ilk dilimin arkasındaki ikinci ve üçüncü dilimleri seçin.
7. Bir doku zımbası kullanarak ilgilendiğiniz bölgeyi çıkarın (Video 1), soğutulmuş tıraş bıçağının üzerinde bir kenara koyun ve dokuyu eşit olarak ikiye bölün (örneğin; soldan sağ yarımküreye karşı dokular, bir yarısı BS3 çapraz bağlama reaksiyonu için ve diğer yarısı da ilgilenilen hedef protein her iki yarımkürede eşit olarak ifade edilirse, çapraz bağlanma kontrolü için kullanılacaktır).
8. Dokuları ezmek veya taşlamak yerine forsepsin ince ucunu bıçağa karşı çoklu dikey hareketlerle kullanarak her dokuyu tıraş bıçağı üzerinde parçalara ayırın (Video 2). Bu, hücrelerin membran bütünlüğünden ciddi şekilde ödün vermeden BS3 tarafından erişilebilen yüzey alanını en üst düzeye çıkaracaktır. Kıymadan hemen sonra, kıyılmış dokuları uygun tüplere aktarın (bkz. adım 6.3).
9. HPC'yi örneklemek için, beynin arka kısmını matristen çıkarın ve beyni dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde soğutulmuş düz yüzeydeki nemlendirilmiş filtre kağıdına yerleştirin (Şekil 6).
10. Kavisli bir prob ve forseps kullanarak ve dorsal taraftan yaklaşarak (Video 3), HPC'yi (dorsal yarım, ventral yarı veya her ikisi) her iki yarımküreden (BS3 çapraz bağlama için bir yarısı ve diğer yarısı kontrol için) disseke edin. Her dokuyu adım 5.8'deki gibi kıyın ve dokuyu uygun tüplere aktarın (bkz. adım 6.3).
    NOT: Deney koşullarının ve sonuçların tutarlı olması için her hayvan için tüm diseksiyon süresi ~ 5 dakika olarak tutulmalıdır.

6. Çapraz bağlama reaksiyonu

1. Diseksiyon için bir sonraki hayvanı, önceki farenin beyninin diseksiyonu bitmek üzereyken barınma alanından diseksiyon odasına getirin (adım 5.10).
2. Kıyılmış dokular uygun tüplere aktarılmaya hazır olmadan hemen önce buz üzerinde önceden soğutulmuş tüpü 30 μL BS3 çözeltisi (26x) veya araç çözeltisi E ile (adım 4.1'den itibaren) yükseltin. Çapraz bağlanmayan kontrol tüplerinde BS3'ün kirlenmediğinden emin olmak için borular arasındaki pipet uçlarını değiştirin.
3. Kıyılmış dokuları (adım 5.8 ve adım 5.10'dan) uygun tüplere aktarın ve ardından bir sonraki hayvanı diseke etmeye başlayın (adım 5.2)
4. Doku parçalarını daha küçük parçalara ayırmak için tüpü ters çevirin ve karıştırın (Video 4) ve numuneleri soğuk odadaki tüp rotatöründe 30 dakika ila 2 saat boyunca inkübe etmeye başlayın. Her tüp için BS3 inkübasyonunun başlangıç zamanını kaydedin. En uygun inkübasyon süresi için tartışma bölümüne bakın.
5. Tüpü 78 μL 1 M glisin ile yükselterek reaksiyonu söndürün ve numuneyi sabit rotasyonla 4 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Her tüp için söndürmenin başlangıç ve bitiş zamanını kaydedin. Bir sonraki hayvanı getirerek (adım 6.1) ve çapraz bağlamaya yardımcı olarak (adım 6.2) hayvan diseksiyonuna odaklanan kişiye yardım etmeye devam edin.
   NOT: Her numuneye, tüm numunelerde tam olarak aynı zamanlama ile muamele edin. Diseksiyon odası soğuk odadan uzaksa, numune inkübasyonuna katılmak ve soğuk odada söndürmek için üçüncü bir kişinin işe alınması şiddetle tavsiye edilir.

7. Doku lizisi, protein hazırlama ve batı lekesi

1. 10 dakikalık söndürmeden sonra (adım 6.5), numuneleri 2 dakika boyunca 4 ° C'de 20.000 x g'de döndürün ve süpernatanı atın. Üçüncü bir kişi mevcutsa, adım 7.2'ye geçin; Aksi takdirde, numuneleri kuru buz üzerinde dondurun ve tüm hayvanlar için beyin diseksiyonu (bölüm 5) ve çapraz bağlama (bölüm 6) tamamlanana kadar tahlili burada duraklatın.
2. Tüp başına 400 μL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin.
3. Örnekleri buz üzerinde tutarken, örnekleri aralarında 5 s aralıklarla 1 s beş kez sonikleştirin.
4. Çözünmeyen doku kalıntılarını (pelet) dışarı atmak ve süpernatanı kurtarmak için numuneleri 2 dakika boyunca 20.000 x g'de döndürün.
5. Bisinkonik asit (BCA) testini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçmek için süpernatantın 5 μL'sini kullanın.
6. Süpernatantın geri kalanını iki tüpe bölün; Bir tüp sonraki batı lekesi için 100 μL süpernatant içerir ve diğer tüp -80 ° C'de uzun süreli depolama için geri kalanını (~ 300 μL) içerir. Numunelere uygun miktarda 4x SDS numune tamponu (β2-merkaptoetanol ile desteklenmiş) ekleyin ve 10 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe edin.
7. Elektroforez için bir akrilamid jel (SDS-PAGE) üzerinde kuyucuk başına 10-20 μg protein çalıştırın ve daha sonra batı leke analizi için proteinleri poliviniliden florür (PVDF) membranına aktarın.
8. PVDF membranını, RT'de 1 saat boyunca% 0.1 Ara-20 (TBS-T) içeren Tris tamponlu salin içinde çözünmüş% 5 (w / v) yağsız sütte bloke edin.
9. Membranı TBS-T ile iki kez kısaca yıkayın ve gece boyunca 4 ° C'de TBS-T'de seyreltilmiş birincil antikor ile inkübe edin.
10. Birincil antikoru RT'de TBS-T'de her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
11. Membranı, RT'de 1 saat boyunca TBS-T'de seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz konjuge sekonder antikor ile inkübe edin.
12. İkincil antikoru RT'de TBS-T'de her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
13. Membranı gelişmiş kemilüminesans reaktifinde inkübe edin ve jel dokümantasyon aparatını kullanarak sinyali tespit edin.

Sonuçlar

Fare PFC'sindeki yüzey α5-GABA A R seviyelerini değerlendirmek için BS3 çapraz bağlama testinin fizibilitesini göstermek için, SDS-PAGE'de BS3-çapraz bağlı ve çapraz bağlı olmayan protein örneklerinin her biri 10 μg çalıştırdık ve proteinleri bir anti-α5-GABA_AR antikoru (tavşan poliklonal) kullanarak batı lekesi ileanaliz ettik (Şekil 7). Çapraz bağlı olmayan protein örnekleri, ~ 55 kDa'da toplam α5-GABA A R miktarını verirken, BS3-çapra...

Tartışmalar

Kronik psikososyal stresin davranışlar (yani, duygusallık ve bilişsel eksiklikler) ve moleküler değişiklikler (yani, GABAerjik genlerin ekspresyonunun azalması ve GABAerjik nörotransmisyonda eşlik eden eksiklikler) üzerindeki etkisi iyi belgelenmiş olmasına rağmen,¹⁰, bu tür eksikliklerin altında yatan mekanizmaların daha fazla araştırılması gerekmektedir. Özellikle, kronik stresin ER fonksiyonları üzerindeki aşırı yüklenme yoluyla nöronal proteomu önemli ölçüde et...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020
1 M HEPES	Gibco	15630080
10x TBS	Bio-Rad	1706435
2.5 M (45%, w/v) Glucose	Sigma	G8769
2-mercaptoethanol	Sigma	M3148
4x SDS sample buffer (Laemmli)	Bio-Rad	1610747
Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)	Pierce	A39266	No-Weigh Format; 10 x 2 mg
Brain matrix	Ted Pella	15003	For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
Curved probe	Fine Science Tools	10088-15	Gross Anatomy Probe; angled 45
Deionized water	milli-Q	EQ 7000	Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb]
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
Filter paper (3MM)	Whatman	3030-917
Forceps (large)	Fine Science Tools	11152-10	Extra Fine Graefe Forceps
Forceps (small)	Fine Science Tools	11251-10	Dumont #5 Forceps
GABA-A R alpha 5 antibody	Invitrogen	PA5-31163	Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking
GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody	R&D Systems	PPS027	Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat
Glycine	Sigma	W328707
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Bio-Rad	1721019
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O)	Sigma	M2670
Nonidet-P40, substitute (NP-40)	SantaCruz	68412-54-4
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P9541
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340
PVDF membrane	Bio-Rad	1620177
Scissors (large)	Fine Science Tools	14007-14	Surgical Scissors - Serrated
Scissors (small)	Fine Science Tools	14060-09	Fine Scissors - Sharp
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S9888
Sonicator (Qsonica Sonicator Q55)	Qsonica	15338284
Table-top refregerated centrifuge	Eppendorf	5425R
Tissue punch (ID 1 mm)	Ted Pella	15110-10	Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm
Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer	Bio-Rad	10026938
Tube rotator (LabRoller)	Labnet	H5000