Extensión de la vida útil de los neutrófilos con CLON-G y un ensayo de muerte espontánea in vitro

Resumen

Este protocolo detalla la preparación de CLON-G para extender la vida útil de los neutrófilos a más de 5 días y proporciona un procedimiento confiable para evaluar la muerte de neutrófilos con citometría de flujo y microscopía de fluorescencia confocal.

Resumen

El promedio de vida de un neutrófilo es inferior a 24 h, lo que limita la investigación básica sobre neutrófilos y la aplicación de estudios de neutrófilos. Nuestra investigación previa indicó que múltiples vías podrían mediar la muerte espontánea de los neutrófilos. Se desarrolló un cóctel dirigiéndose simultáneamente a estas vías, caspasas-permeabilización de membrana lisosomal-oxidante-necroptosis inhibición más factor estimulante de colonias de granulocitos (CLON-G), que prolongó la vida útil de los neutrófilos a más de 5 días sin comprometer significativamente la función de los neutrófilos. Al mismo tiempo, también se desarrolló un protocolo confiable y estable para evaluar y evaluar la muerte por neutrófilos. En este trabajo, mostramos que CLON-G puede prolongar la vida útil de los neutrófilos in vitro a más de 5 días, y exhibimos el alargamiento de la vida útil de los neutrófilos con FACS y microscopía de fluorescencia confocal. Este informe presenta procedimientos para la preparación de CLON-G y muestra un ensayo de muerte espontánea in vitro de neutrófilos, que puede utilizarse para el estudio de neutrófilos y para interrogar posteriormente la muerte de neutrófilos, proporcionando así un recurso confiable para la comunidad de neutrófilos.

Introducción

Se sabe que los neutrófilos comprenden un arsenal de abundantes gránulos citoplasmáticos, nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa, enzimas antimicrobianas y varios orgánulos que defienden contra los microbios invasores; Además, son altamente móviles y son las primeras células reclutadas en el sitio de inflamación, lo que significa que los neutrófilos son la primera línea de defensa del sistema inmune innato ^1,2. Por lo tanto, la terapia de transfusión de granulocitos se ha convertido en un tratamiento clínico prometedor para las infecciones relacionadas con neutropenia para aumentar transitoriamente la inmunidad de los neutrófilos ^3,4,5. Descubrimientos recientes han demostrado claramente que los neutrófilos también funcionan como efectores multifacéticos en muchos escenarios fisiopatológicos⁶. El promedio de vida de un neutrófilo es inferior a 24 h y, por lo tanto, la investigación básica sobre neutrófilos y la aplicación de estudios de neutrófilos son tremendamente difíciles debido a las limitaciones relacionadas con la manipulación genética estable y el almacenamiento a largo plazo 7,8,9,10,11 . Hay algunas líneas celulares que pueden mostrar parcialmente algunas funciones de neutrófilos, como HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 y células madre pluripotentes inducidas¹². Estas líneas celulares pueden lograr una edición y criopreservación de genes efectivas; Sin embargo, todavía difieren enormemente de los neutrófilos primarios y, por lo tanto, no pueden recapitular fielmente las funciones de los neutrófilos¹³. Por lo tanto, la mayor parte de la investigación en este campo todavía se basa en neutrófilos primarios recién aislados. El campo todavía se basa en la generación de ratones knock-out condicionales costosos y lentos para investigar funciones genéticas específicas en neutrófilos, pero actualmente no existen modelos humanos.

Habiendo puesto nuestro esfuerzo en explorar los procesos heterogéneos involucrados en la muerte de neutrófilos y las múltiples vías que regulan estos procesos^14,15, recientemente se ha descrito un nuevo tratamiento denominado CLON-G (caspasas-permeabilización de membrana lisosomal-inhibición de la necroptosis oxidante más factor estimulante de colonias de granulocitos) ¹⁶. CLON-G consiste en Q-VD-oph (quinolyl-valyl-O-methylaspartil-[-2,6-difluorophenoxy]-methyl ketone), Hsp70 (proteína de choque térmico 70), DFO (deferoxamina), NAC (N-acetilcisteína), Nec-1s (necrostatina-1s) y G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos). La muerte espontánea de neutrófilos está mediada por múltiples vías, incluyendo apoptosis, necroptosis y piroptosis. Q-VD-oph inhibe la apoptosis de los neutrófilos como un inhibidor de pan-caspasa al dirigirse a la caspasa 1, caspasa 3, caspasa 8 y caspasa^{9 17}. La necroptosis de neutrófilos depende de una vía de señalización que involucra la proteína quinasa-1 que interactúa con el receptor (RIPK1) y la proteína similar al dominio de la quinasa de linaje mixto (MLKL)¹⁸. Como inhibidor de RIPK1, los Nec-1 inhiben la necroptosis de los neutrófilos. Hsp70 y DFO pueden inhibir la permeabilización de la membrana lisosomal (LMP), lo que podría inducir la apoptosis de neutrófilos¹⁹ y la piroptosis²⁰. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) desempeñan un papel vital en la muerte de neutrófilos al mediar LMP¹⁹ y apoptosis²¹ e inhibir las señales de supervivencia²². Como antioxidante que puede reducir la acumulación de ROS, NAC retrasa la muerte de neutrófilos. Como factor de crecimiento, el G-CSF activa las señales de supervivencia de los neutrófilos e inhibe la apoptosis inducida por calpaína^23,24. Al dirigirse simultáneamente a múltiples vías de muerte espontánea de neutrófilos, la vida útil de los neutrófilos puede extenderse efectivamente a más de 5 días sin comprometer su función. El tratamiento con CLON-G amplía las posibilidades de preservación, transporte y manipulación de genes de neutrófilos, lo que puede acelerar la investigación en la comunidad de neutrófilos. Mientras tanto, con base en el conocimiento de la muerte de neutrófilos, los protocolos actualmente aprobados para los ensayos de muerte celular pueden causar daños inesperados a los neutrófilos¹⁴, por lo que estos protocolos se han refinado para ser más apropiados para los estudios de neutrófilos. Este informe proporciona protocolos detallados para el cultivo de neutrófilos con CLON-G y un ensayo de muerte celular in vitro de neutrófilos de ratón utilizando citometría de flujo e imágenes de fluorescencia. CLON-G es eficaz tanto en neutrófilos de ratón como humanos; Sin embargo, aquí se demuestran las muestras de ratón para simplificar este protocolo. La concentración de NAC es de 1 mM para neutrófilos de ratón y de 10 μM para neutrófilos humanos. Hsp70 es específico de la especie y, por lo tanto, debe utilizarse de acuerdo con la fuente del neutrófilo. Para este protocolo, no importa si los neutrófilos se aíslan de la sangre periférica o de la médula ósea y cómo se aíslan.

Para el presente estudio, se aislaron neutrófilos de médula ósea de ratón para lograr suficientes neutrófilos para los experimentos, ya que se pueden obtener aproximadamente 1 x 10 7-1.5 x 10⁷ neutrófilos de la médula ósea, mientras que solo se pueden aislar 1 x 10 6 neutrófilos de la sangre periférica de un solo ratón C57BL /⁶ de 8-12 semanas de edad (de cualquier sexo). La centrifugación por gradiente se llevó a cabo para evitar posibles daños y activación por la estimulación mecánica de la clasificación FACS o la clasificación MACS.

Protocolo

El Boston Children's Hospital y el Comité Estatal de Cuidado y Uso de Animales del Laboratorio Clave de Hematología Experimental (SKLEH) aprobaron y supervisaron todos los procedimientos. La Figura 1 muestra un diagrama de flujo del cultivo de neutrófilos con CLON-G y el ensayo de muerte in vitro .

1. Extensión de la vida útil de los neutrófilos con CLON-G

NOTA: Todas las operaciones y materiales mencionados deben ser estériles. Asegúrese de que todas las soluciones estén bien mezcladas y distribuidas de manera uniforme.

1. Preservación de los componentes CLON-G
   1. Disolver 50 mg de Q-VD-oph (ver Tabla de materiales) a una concentración final de 100 mM añadiendo 973,7 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), y pipetear el líquido hasta que la mezcla se vuelva clara. Alícuota 50 μL por tubo y conservar a −20 °C.
      PRECAUCIÓN: El DMSO es un líquido químico dañino. Use una bata de laboratorio, gafas protectoras y una máscara para evitar el contacto con la piel, el contacto visual y la inhalación.
   2. Descongele Hsp70 (ver Tabla de materiales) a 4 °C y reduzca el contenido del vial. Alícuota 1 μL de Hsp70 por tubo sobre hielo y conservar a −80 °C.
      NOTA: Hsp70 es una proteína; El almacenamiento ultrafrío es necesario para mantenerlo estable. Evite el ciclo de congelación-descongelación.
   3. Disolver 1 mg de DFO (ver Tabla de Materiales) con 7,61 ml RPMI 1640 para obtener un stock de 200 μM. Alícuota 500 μL por tubo, y conservar a −20 °C.
   4. Disuelva 0,1 g de NAC (consulte la Tabla de materiales) con 2,5 ml de RPMI 1640 en un tubo de centrífuga de 15 ml y ajuste el pH a 7-7,4 con NaOH. Agregue RPMI 1640 a un volumen final de 3.06 ml para hacer un stock NAC de 200 mM. Filtrarlo con una unidad de filtrado de 0,2 μm. Alícuota 500 μL por tubo y conservar a −20 °C.
      NOTA: Disolver NAC en esta alta concentración no es fácil, y el vórtice puede ayudar a disolverlo. El rojo fenol en RPMI 1640 es una indicación perfecta del pH; cuando el NAC acaba de disolverse, el color es amarillento; Ajústalo hasta que se vuelva rosado. Las soluciones madre NAC son estables hasta 1 mes a -20 °C.
   5. Disuelva 10 mg de Nec-1s (ver Tabla de materiales) a 20 mM con 1.8 ml de DMSO, y pipete la mezcla hasta que se aclare. Alícuota 50 μL por tubo y conservar a −20 °C. Proteger de la luz.
   6. Disuelva 250 μg de G-CSF (ver Tabla de materiales) a 200 μg/ml con 1,25 ml de RPMI 1640. Alícuota 50 μL por tubo y conservar a 4 °C.
2. Preparación de 2x medio de cultivo CLON-G
   1. Prepara el medio básico. Agregue 39.5 ml de RPMI 1640, 10 ml de suero bovino fetal (FBS) y 0.5 ml de estreptococo (antibióticos) a un tubo de 50 ml para hacer RPMI 1640 con 20% FBS y 1% PS como medio básico.
      NOTA: Esta alta concentración de FBS se utiliza para proporcionar el cultivo prolongado de neutrófilos, que puede ser mayor de 5 días. Si el tiempo de cultivo es de 1-2 días, 10% -15% FBS es suficiente.
   2. Descongele todas las soluciones madre de los componentes CLON-G en hielo.
   3. Diluir 1 μL de Hsp70 a 20 μM añadiendo 606 μL del medio básico. Diluir 1 μL de 200 μg/mL G-CSF a 20 μg/ml añadiendo 9 μL del medio básico.
   4. Añadir 976 μL de medio básico a un tubo de centrífuga de 15 ml. Agregue 1 μL de Q-VD-oph (100 mM), 10 μL de DFO (200 μM), 1 μL de Hsp70 (20 μM), 10 μL de NAC (200 mM), 1 μL de Nec-1s (20 mM) y 1 μL de G-CSF (20 μg / mL) para hacer 1 ml de medio 2x CLON-G.
      NOTA: El medio 2x CLON-G debe utilizarse inmediatamente después de prepararlo. Se puede almacenar el 2x CLON-G temporalmente a 4 °C. Los restos de 20 μM Hsp70 deben desecharse.
3. Cultivo de neutrófilos
   1. Aislar neutrófilos de ratón por centrifugación de gradiente después de un informe anterior²⁵. Resuspender los neutrófilos de ratón aislados en el medio básico (1 millón de células/100 μL).
      NOTA: Evite activar los neutrófilos manipulándolos suavemente. Evite la formación de espuma durante todo el proceso.
   2. Agregue 500 μL de medio 2x CLON-G, 400 μL del medio básico y 100 μL de la suspensión celular a placas de cultivo no tisulares de 24 pocillos (consulte la Tabla de materiales) y pipetear suavemente de tres a cuatro veces.
      NOTA: Las altas concentraciones de los componentes en el medio 2x CLON-G podrían dañar los neutrófilos; Evite sumarlos sin el medio básico. La placa de cultivo no cultivada en tejidos es necesaria para evitar la adhesión de neutrófilos.
   3. Colocar la placa de cultivo en una incubadora a 37 °C y al 5 % de_CO2 sin problemas.
      NOTA: No es necesario cambiar el medio celular dentro de los 7 días. Las concentraciones finales de la composición CLON-G son 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s y 10 ng/mL G-CSF.
   4. Tinción de los neutrófilos cultivados con tinción compuesta de Wright Giemsa (ver Tabla de materiales) y analícelos con un microscopio óptico (Figura 2A-D). Alternativamente, teñir con anticuerpos APC-CD11b y PE-Cy7-Ly6G, y analizar con citometría de flujo (Figura 2E-I) como se describió anteriormente²⁶.

2. Ensayo de muerte espontánea in vitro de neutrófilos

1. Análisis de citometría de flujo
   1. Cultivo aislado de neutrófilos a una densidad de 1 millón de células/ml en el medio básico a 37 °C y 5% de_CO2. La placa de cultivo de 24 pocillos no se cultiva en tejidos. Agregue 1 ml de medio celular por pocillo.
   2. Disolver 1 g de CaCl 2 con 45 mL de solución salina para obtener 200 mM de CaCl₂. Filtrarlo con una unidad de filtrado de 0,2 μm. Conservar a 4 °C.
   3. Prepare la mezcla de tinción. Agregue 7 μL de solución salina por muestra a un tubo de 1,5 ml y agregue 0,4 mg/ml de FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml de yoduro de propidio (PI) y 200 mM de solución de CaCl₂ a 1 μL cada uno por muestra. Mezclar bien. Use la solución inmediatamente después de la preparación.
   4. Pipetear suavemente el medio celular de cinco a siete veces para mezclar bien, seguido de transferir 100 μL a un tubo de citometría de flujo en los puntos de tiempo deseados.
      NOTA: Evite la formación de espuma durante todo el proceso.
   5. Vortex contando cuentas (ver Tabla de materiales) para mezclarlas bien. Pipetear 10 μL de las perlas de conteo bien mezcladas al mismo tubo de citometría de flujo que en el paso 2.1.4.
   6. Añadir 10 μL de la mezcla de tinción preparada (paso 2.1.3) al tubo de citometría de flujo. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos lejos de la luz.
   7. Agregue 100 μL de solución salina al tubo y mezcle bien para asegurar la distribución uniforme de las perlas y células de conteo.
   8. Realizar análisis de citometría de flujo del medio celular. Recopile las celdas a una tasa baja con ~ 400 eventos / s. Vincular las celdas APC-PE-Cy7- a FSC-A y SSC-A, y compuerta las celdas intactas con posiciones FSC-A y SSC-A medianas a FITC-Annexin-V y PE-PI; la población de Annexin-V^−PI− se clasifica como células sanas.
      NOTA: Las siguientes ecuaciones determinan el número total de células sanas por muestra y la viabilidad de los neutrófilos:
      Número total de células sanas por muestra²⁷ = (1.000/número de perlas de conteo) × número de población de Annexin-V^{−PI− ×} 10
      Viabilidad de neutrófilos = número total de células sanas en el momento indicado/número total de células sanas en el momento cero
2. Ensayo de imagen fluorescente
   1. Cultivo aislado de neutrófilos a una densidad de 1 millón de células/ml en el medio básico a 37 °C y 5% de_CO2 en una placa confocal con 2 mL de medio celular por placa.
      NOTA: Un microscopio de fluorescencia confocal tiene la mejor calidad de imagen, pero cualquier microscopio de fluorescencia que tenga 488/561/DIC es suficiente para apoyar este experimento.
   2. Saque el plato suavemente en el punto de tiempo indicado. Agregue 10 μL de 0,4 mg/ml de FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml PI y 200 mM CaCl₂ a la placa de manera uniforme. Manchar a temperatura ambiente durante 5 min.
      NOTA: Evite agitar durante todo el proceso. Agregue los agentes de tinción de manera uniforme y suave.
   3. Capture imágenes de fluorescencia a 488 (anexina-V)/561 (PI)/canales DIC utilizando un microscopio de fluorescencia confocal con una lente objetivo 20x (consulte la Tabla de materiales). Establezca el tiempo de exposición del canal 488 como 500 ms, el canal 561 como 200 ms y el canal DIC como 100 ms. Seleccione 5-10 áreas aleatorias para cada placa. Los tipos de células se definen en nuestro informe¹⁴ publicado anteriormente.

Resultados

La morfología teñida con Wright-Giemsa (Figura 2A-D) y los fenotipos FACS (Figura 2E-J) de los neutrófilos tratados con CLON-G no se vieron afectados. La viabilidad de los neutrófilos tratados con CLON-G a las 24 h fue de aproximadamente 90% + según el análisis de citometría de flujo (Figura 3) y los ensayos de imagen fluorescente (Figura...

Discusión

Los neutrófilos desempeñan un papel vital en la inmunidad innata y adaptativa, y su homeostasis está estrictamente regulada. Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la sangre periférica humana, y tienen un recambio robusto y rápido. Un adulto sano puede liberar 1 x 10⁹ neutrófilos/kg diarios de la médula ósea²⁸. La muerte de los neutrófilos se ha convertido así en uno de los enigmas desconcertantes de este campo, y se ha dedicado mucho esfuerzo a comprenderlos m...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm syringe filter	Pall Corporation	4612	Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube	LABSELECT	MCT-001-150	Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-15	Lab consumable.
24 well cell culture plate	Falcon	351147	Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-50	Lab consumable.
BD LSRII	BD		Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	C4901	Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope	Perkinelmer	UltraVIEW VOX	Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate	NEST	801001-20mm	Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads	Thermo Fisher	C36950	Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO	Sigma Aldrich	D9533	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO)	Sigma Aldrich	D2650	Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C	Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V	BD	51-65874X	Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70	Abcam	ab113187	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC	Sigma Aldrich	A9165	Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s	EMD Millipore	852391-15-2	Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS)	Gibco	15070063	Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI)	BioLegend	421301	For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph	Selleck chem	S7311	Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)	Chugai Pharma China	GRANOCYTE	Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes	Falcon	100-0102	Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640	Gibco	C11875500BT	Component of neutrophil culture basic medium.
Saline	LEAGENE	R00641	Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH)	FENG CHUAN	13-011-00029	pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution	Solarbio	G1020	Neutrophil cytospin staining.