استخدام دماغ جنين الفرخ كنموذج للتحليلات داخل الجسم الحي وخارج الجسم الحي لسلوك خلايا الورم الأرومي الدبقي البشري

Summary

تستخدم أجنة الكتاكيت لدراسة أورام الدماغ بالورم الأرومي الدبقي البشري (GBM) في البويضات وفي الثقافات المشتركة لشرائح الدماغ خارج الجسم الحي. يمكن تسجيل سلوك خلية GBM عن طريق الفحص المجهري بفاصل زمني في الثقافات المشتركة خارج الجسم الحي ، ويمكن تحليل كلا المستحضرين عند نقطة النهاية التجريبية عن طريق تحليل مفصل 3D متحد البؤر.

Abstract

كان جنين الفرخ نظاما نموذجيا مثاليا لدراسة تطور الفقاريات ، خاصة للتلاعب التجريبي. تم توسيع استخدام جنين الفرخ لدراسة تكوين أورام الدماغ بالورم الأرومي الدبقي البشري (GBM) في الجسم الحي وغزو الخلايا السرطانية في أنسجة المخ المحيطة. يمكن تشكيل أورام GBM عن طريق حقن معلق للخلايا الموسومة بالفلورسنت في البطين E5 للدماغ المتوسط (القفص البصري) في البيض.

اعتمادا على خلايا GBM ، تتشكل الأورام المدمجة بشكل عشوائي في البطين وداخل جدار الدماغ ، وتغزو مجموعات من الخلايا أنسجة جدار الدماغ. يمكن تلطيخ أقسام الأنسجة السميكة (350 ميكرومتر) من E15 tecta الثابتة مع الأورام للكشف عن أن الخلايا الغازية غالبا ما تهاجر على طول الأوعية الدموية عند تحليلها عن طريق إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لصور z-stack متحدة البؤر. يمكن زراعة شرائح الدماغ المتوسط والدماغ الأمامي E15 الحية (250-350 ميكرومتر) على إدخالات غشائية ، حيث يمكن إدخال خلايا GBM ذات العلامات الفلورية في مواقع غير عشوائية لتوفير ثقافات مشتركة خارج الجسم الحي لتحليل غزو الخلايا ، والذي يمكن أن يحدث أيضا على طول الأوعية الدموية ، على مدى حوالي 1 أسبوع. يمكن مراقبة هذه الثقافات المشتركة خارج الجسم الحي بواسطة الفحص المجهري الفاصل الزمني الفلوري واسع المجال أو متحد البؤر لمراقبة سلوك الخلية الحية.

يمكن بعد ذلك تثبيت الشرائح المستزرعة بشكل مشترك وتلطيخها وتحليلها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر لتحديد ما إذا كان الغزو قد حدث على طول الأوعية الدموية أو المحاور أم لا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام نظام الاستزراع المشترك للتحقيق في التفاعلات المحتملة بين الخلايا والخلايا عن طريق وضع مجاميع من أنواع وألوان مختلفة من الخلايا في مواقع دقيقة مختلفة ومراقبة حركات الخلايا. يمكن إجراء العلاجات الدوائية على مزارع خارج الجسم الحي ، في حين أن هذه العلاجات غير متوافقة مع نظام البويضات . يسمح هذان النهجان المتكاملان بإجراء تحليلات مفصلة ودقيقة لسلوك خلايا GBM البشرية وتكوين الورم في بيئة دماغية فقارية يمكن التلاعب بها بشكل كبير.

Introduction

غالبا ما تستخدم الدراسات المختبرية لسلوكيات الخلايا السرطانية لتشريح الآليات المحتملة التي تعمل أثناء السلوك الأكثر تعقيدا الذي يتم ملاحظته أثناء تكوين الورم وغزو الخلايا في نماذج xenograft في الجسم الحي. على سبيل المثال ، مع الورم الأرومي الدبقي (GBM) ، كشفت الدراسات في المختبر عن آليات لكيفية عمل L1CAM المحتمل أثناء تكوين الورم وغزو الدماغ في نموذج ورم دماغي جديد لجنين الفرخ¹،²،³،^4،5. على الرغم من أن التجارب في المختبر وفي الجسم الحي تكمل بعضها البعض بطرق مفيدة ، إلا أنها تترك فجوة كبيرة في كيفية ارتباط النتائج. على سبيل المثال ، تعد التحليلات الميكانيكية لحركة خلية GBM على طبق حالة مصطنعة للغاية ، ويمكن لنماذج xenograft في الجسم الحي أن تكشف فقط عن تحليلات ثابتة لنقطة زمنية أو نقطة نهاية لتكوين الورم وسلوك الخلية. في الدراسات في الجسم الحي ، لا تصلح الدراسات التي تستخدم القوارض أو أجنة الكتاكيت بسهولة لمراقبة سلوك الخلية بينما تغزو الخلايا أنسجة المخ في نماذج الطعم الأجنبي هذه. ومع ذلك ، فقد أظهر نموذج الطعم الأجنبي لجنين الفرخ أن بروتين الالتصاق L1CAM يلعب دورا محفزا في القدرة الغازية لخلايا T98G GBM البشرية ^2,5.

يمكن التوصل إلى حل مناسب لهذه المشكلة عن طريق سد الطرق في الجسم الحي وفي المختبر باستخدام نموذج زراعة شريحة الدماغ العضوي ، والذي يشار إليه باسم نموذج خارج الجسم الحي . في هذا النموذج خارج الجسم الحي ، يمكن الحفاظ على أنسجة المخ الحية بسمك عدة مئات من الميكرونات لمدة تصل إلى بضعة أسابيع ، مما يجعل من الممكن زرع الخلايا السرطانية ، ومراقبة سلوكها في الأنسجة الفعلية بمرور الوقت ، ثم إجراء تحليل أكثر تفصيلا للعلامات في نقطة نهاية التجربة.

كانت إحدى طرق زراعة الشرائح العضوية الشائعة هي زراعة عدة مئات من شرائح الدماغ التي يبلغ سمكها ميكرون فوق غشاء مسامي شفاف أو شفاف ، مما يترك الأنسجة معرضة للهواء ، مع السماح لوسائط المغذيات بالحفاظ على الأنسجة من أسفل الغشاء (راجع Stoppini et ^al.6). تم استخدام أشكال مختلفة من هذه الطريقة لدراسات مختلفة ، بما في ذلك استخدام وسائط مختلفة أو إدخالات غشاء مختلفة. تشتمل إدخالات الأغشية المختلفة على إدراج غشاء مسامي (0.4 ميكرومتر) بقطر 30 مم في طبق استزراع 35 مم 6 ، وإدخالات زراعة الخلايا (0.4 ميكرومتر) لألواح⁶ آبار⁷. تشمل الوسائط المختلفة 50٪ MEM / HEPES + 25٪ مصل حصان معطل حراريا + 25٪ محلول ملح متوازن هانكس (HBSS) ⁸ ، وسائط مصل مخفضة بنسبة 50٪ + 25٪ مصل حصان + 25٪ HBSS⁹ ، بالإضافة إلى أخرى. إذا تم استخدام غشاء شفاف أو شفاف جنبا إلى جنب مع خلايا GBM ذات العلامات الفلورية ، فيمكن تصوير هذه الثقافات من الأسفل باستخدام مجهر مضان واسع المجال أو متحد البؤر^{مقلوب 10}،11،12،¹³،^14،15.

في حين تم إنشاء العديد من نماذج زراعة شرائح الدماغ العضوي في الجسم الحي باستخدام القوارض ، كما هو مذكور أعلاه ، فإن جنين الفرخ (جالوس جالوس) لم يتم استغلاله بشكل كاف لهذه الأغراض. ومع ذلك ، فقد ثبت أن جنين الفرخ قادر على استخدامه كنموذج للطعم الأجنبي في الجسم الحي لدراسة غزو كل من الورم الدبقي البشري والجرذ¹،^2،5. أظهرت الخلايا المطعمة ب Xenografted في أدمغة أجنة الفرخ أنماط غزو مماثلة لتلك التي لوحظت في نماذج القوارض ، مما يدعم استخدام أجنة الكتاكيت كنموذج في الجسم الحي لتحليل الخلايا السرطانية GBM. كما أن أجنة الكتاكيت غير مكلفة ، ويمكن الحفاظ عليها بسهولة أكبر من القوارض (أي في قشور البيض في حاضنة المختبر) ، ويسهل التعامل معها ، مما يجعلها خيارا جذابا لدراسات GBM قصيرة المدى في الجسم الحي. وصفت مقالة حديثة استخدام مزارع شرائح دماغ جنين الفرخ لتشكيل ونمو المحاور العصبية أثناء نمو الدماغ الطبيعي حيث كانت الشرائح قابلة للحياة لمدة 7 أيام على الأقل¹⁶. ومع ذلك ، فإن استخدام مثل هذه الثقافات شريحة دماغ جنين الفرخ للتحليل خارج الجسم الحي لسلوك خلية GBM في بيئة الأنسجة غير موجود. في هذه المقالة ، تم وصف كل من زرع خلايا GBM البشرية والخلايا الجذعية GBM (GSCs) في دماغ جنين الفرخ المبكر في الجسم الحي ، وكذلك إدخال خلايا GBM في مزارع شرائح دماغ جنين الفرخ الحية خارج الجسم الحي. كما يتم توفير بعض الأمثلة التمثيلية للأورام الناتجة وأنماط غزو الخلايا التي تم الحصول عليها من هذه المستحضرات.

Protocol

لم تكن هناك حاجة إلى تصريح أو موافقة في جامعة ديلاوير لتنفيذ هذا العمل.

1. حقن خلية GBM في كتكوت البصري

1. تحضير خلايا GSCs و GBM للحقن
   1. ثقافة GSCs في وسائط GSC (الجدول 1). أنشأت الثقافة خطوط خلايا GBM في وسائط GBM (الجدول 1).
   2. شطف الخلايا على لوحات مع محلول ملحي معقم الفوسفات (PBS) ووضع 1 مل من محلول التربسين في طبق 10 سم. اتركيه في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 2-3 دقائق حتى تبدأ الخلايا في الانفصال.
   3. قم بتعطيل التربسين عن طريق إضافة 10 مل من وسائط الاستزراع المناسبة المحتوية على المصل في طبق 10 سم وافصل الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. ضع تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل.
   4. قم بإذابة الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   5. قم بنضح الوسائط من حبيبات الخلية باستخدام ماصة زجاجية دقيقة يمكن التخلص منها متصلة بدورق ذراع جانبي ومضخة تفريغ. أعد تعليق الخلايا في وسائط نمو مناسبة إلى تركيز 10000 خلية لكل ميكرولتر وضعها في أنبوب microfuge أو أنبوب صغير لولبي على الجليد.
   6. امزج الخلايا مع كمية صغيرة من صبغة FCF الخضراء السريعة المعقمة بنسبة 1٪ (استخدم نسبة 5 ميكرولتر من الصبغة / 100 ميكرولتر من تعليق الخلية).
2. حقن خلايا GBM في القفص البصري E5 في البيض. انظر الشكل التكميلي 1.
   1. احتضان بيض الدجاج المخصب في حاضنة بيض مرطبة ، مع توجيه الطرف المدبب لأسفل ، عند 37.5 درجة مئوية (اليوم الأول من الحضانة هو اليوم الجنيني 0 [E0]). في اليوم السادس من الحضانة (E5) ، تعقيم قشر البيض عن طريق الرش مع الإيثانول 70 ٪.
   2. باستخدام شمعة البيض ، تتبع على طول محيط الفضاء الجوي فوق الجنين بقلم رصاص وقم بتغطية المنطقة المحددة بشريط شفاف.
   3. باستخدام مقص منحني ، قم بقص المنطقة المتتبعة برفق ، مع الحرص على عدم قطع الأغشية الجنينية أو الأوعية الدموية ، وتجاهل الجزء العلوي من قشر البيض.
   4. ضع بضع قطرات من المحلول الملحي أو وسائط زراعة الخلايا على غشاء الفضاء الجوي لتبلله حتى ينفصل بسهولة. باستخدام ملقط دقيق ، اخترق بعناية غشاء الفضاء الهوائي فوق الجزء العلوي من الجنين ، وقم بإزالته ، وحدد موقع رأس جنين الفرخ.
   5. استخدم ملقط رفيع للإمساك بغشاء السلى الشفاف الذي يحيط بالجنين على الفور لوضع الرأس بحيث يمكن حقن القفص البصري بالخلايا. بيد واحدة ، استخدم الملقط الناعم للتمسك بالسلى للحفاظ على الرأس في مكانه أثناء عملية الحقن. احرص على عدم إتلاف الأوعية الدموية خارج الجنين في الغشاء المشيمي الألانتوي على صفار البيض.
      ملاحظة: يتطلب الإجراء أعلاه بعض الممارسة لتكون قادرا على الإمساك بكفاءة بغشاء السلى الصافي الذي يحيط بالجنين بشكل وثيق ، لأنه غير مرئي حتى يتم الإمساك به وسحبه. تدرب على استخدام ملقط دقيق للاستيلاء على السلى الصافي الذي يحيط بالجنين على الفور.
   6. امسك الرأس بثبات عن طريق إمساك غشاء السلى بالملقط الرفيع. باستخدام ماصة زجاجية دقيقة ومضخة بيكوب هوائية ، قم بحقن حوالي 50000 خلية في 5 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا المناسبة في التيكتوم البصري (5 ميكرولتر حوالي 1/2 من ماصة دقيقة مملوءة).
      ملاحظة: انظر Cretu et ^al.1 للحصول على صورة لجنين E5 تم حقنه بخلايا GBM الممزوجة بالصبغة.
   7. ضع بضع قطرات من الأمبيسلين 50 مجم / مل فوق الجنين.
   8. غطي الفتحة الموجودة في الجزء العلوي من البيض بشريط شفاف واتركها في المرطب حتى E15 للتشريح.

2. تشريح مناطق الدماغ من أجنة E15

ملاحظة: يشبه تشريح أدمغة E15 هنا للتثبيت ذلك الموصوف في الخطوة 8.2 لشرائح الدماغ الحية ، ولكن لا يجب إجراء التشريح هنا في ظل ظروف معقمة.

1. قطع الشريط حول الجزء العلوي من قذيفة ، مما يسمح للوصول إلى الجنين.
2. قطع رأس الجنين في الرقبة ووضع الرأس في طبق 10 سم مع محلول Tyrodes المعقم الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم (CMF Tyrode's). انظر الشكل التكميلي 2.
3. باستخدام ملقط رفيع ، قشر الجلد الذي يغطي الدماغ للكشف عن الأم الجافية الأساسية. إزالة عظام الجمجمة المشكلة على الجانبين الأيسر والأيمن من الدماغ. عظام الجمجمة المشكلة لا تغطي بعد غالبية الدماغ.
4. استخدم ملقط مدبب ناعم برفق لتمزيق السحايا التي تغطي مركز الدماغ وقشره إلى كل جانب للكشف عن الدماغ.
5. استخدم ملقط منحني لجرف الدماغ من الأسفل وسحبه برفق من تجويفه.
6. تشريح الدماغ إلى أجزائه: الدماغ الأمامي ، tecta ، المخيخ.
7. قم بإزالة الأم التي تعلوها الحنون من القفص باستخدام ملقط ناعم. لاحظ أن الحنون ينفصل بسهولة عن التكتا ، ولكن ليس عن الدماغ الأمامي أو المخيخ. قم بإزالة الحنون من الدماغ الأمامي عن طريق لمسه أو لفه على قطعة صغيرة من ورق الترشيح.
8. ضع مناطق الدماغ المشرحة في طبق صغير.
9. ضع مناطق الدماغ للتثبيت في بئر صفيحة 24 بئرا وقم بتثبيتها في 2٪ بارافورمالدهايد (PFA) في 0.1 متر من محلول كاكوديلات الصوديوم. اتركيه لمدة 24 ساعة على الأقل عند 4 درجات مئوية.
10. بعد التثبيت ، شطف الأنسجة في 3x PBS على الأقل 1 ساعة قبل التضمين في أجار.

3. تضمين وتقطيع مناطق الدماغ المحصودة

1. سخن محلول من 3.5٪ أجار و 8٪ سكروز في برنامج تلفزيوني حتى يذوب واحتفظ به في درجة حرارة الانصهار.
2. باستخدام ملقط منحني كمغرفة ، التقط برفق إما القفص البصري أو منطقة الدماغ الأمامي لدماغ جنين الفرخ ، وامسحه قليلا على ورق الترشيح لإزالة السائل الزائد لضمان التصاق الآجار بسطح الدماغ الخارجي.
3. باستخدام ماصة نقل معقمة ، املأ القالب بمحلول أجار.
   ملاحظة: يمكن صنع قالب بسيط عن طريق تشكيل رقائق الألومنيوم حول جسم مناسب الحجم ، مثل كتل تقطيع الأنسجة المعدنية الصغيرة المستطيلة الاهتزازية.
4. ضع منطقة الدماغ في أجار ، واترك الآجار يتصلب تماما.
5. قم بإزالة ورق الألمنيوم من حول الدماغ المضمن وقم بقص الآجار الزائد حول الجانبين باستخدام شفرة حلاقة أو مشرط.
6. ضع قطرة من غراء cyanoacrylate على مربع الفولاذ المقاوم للصدأ في صينية التقطيع ، ضع كتلة الأغاروز مع الدماغ على الغراء ، واترك الغراء يترابط لمدة 1 دقيقة. ضع الدرج في ظرف تقطيع الأنسجة الاهتزازي ، وشد الدرج واملأه بما يكفي من PBS لتغطية الجزء العلوي من كتلة أجار.
7. قطع شرائح الدماغ على قطاعة الأنسجة تهتز بسمك 350 ميكرومتر باستخدام شفرة حلاقة فولاذية.
8. عندما يتم قطع شرائح الدماغ وتطفو بحرية في صينية التقطيع ، استخدم ملعقة لغرف الشرائح وإزالتها من الدرج. حرك القسم برفق من الملعقة إلى طبق بتري 10 سم مع برنامج تلفزيوني حتى تطفو الأقسام بحرية.
   ملاحظة: قد ينفصل الآجار المحيط بشريحة الدماغ إذا لم يتم تنظيف الدماغ بشكل كاف بورق الترشيح لإزالة السائل الزائد قبل التضمين. في حالة حدوث ذلك ، يمكن إزالة أنسجة المخ بلطف من الآجار المتصلب وإعادة دمجها بعد النشاف المناسب للسائل الزائد.

4. شرائح الدماغ المناعية مع الخلايا السرطانية

1. باستخدام مجهر ستيريو مجهز ب epifluorescence ، قم بفحص شرائح فردية في طبق 10 سم واحدا تلو الآخر لوجود أو عدم وجود خلايا سرطانية.
2. تحضير كمية كافية من محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع 0.1٪ Triton X-100 و 5٪ مصل الماعز العادي (PBSTG) (انظر الجدول 1) للتلطيخ المناعي وشطف الشرائح المراد تلوينها بالمناعة.
3. نصف ملء الآبار في لوحة 24 بئرا التي سيتم استخدامها لتلطيخ أقسام الدماغ مع برنامج تلفزيوني.
4. قم بقص زوايا الآجار حول شرائح الدماغ بحافة ملعقة أو مشرط ، وضعها برفق في الآبار التي تحتوي على برنامج تلفزيوني.
5. نضح PBS واستبدله ب 350 ميكرولتر من محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولي في PBSTG (على سبيل المثال ، 2 ميكروغرام / مل UJ127 في PBSTG).
6. احتضان لمدة 24 ساعة في غرفة باردة مع تحريض لطيف بحيث ينظر إلى شريحة تتحرك بحرية داخل البئر.
7. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي وشطف 3 × 1 ساعة مع PBSTG في غرفة باردة مع الإثارة.
8. عند الانتهاء من الشطف، احتضان 350 ميكرولتر/بئر من محلول تلطيخ الأجسام المضادة الثانوي في PBSTG (على سبيل المثال، تخفيف 1/200 من البيوتين-GAM في PBSTG). احتضان لمدة 20 ساعة في غرفة باردة مع الإثارة.
   ملاحظة: إذا كنت قد تخلت عن الخطوة الثالثة واحتضنت بالجسم المضاد الثانوي المحتوي على الفلوروكروم في هذه الخطوة ، فقم بتغطيتها للحماية من الضوء أثناء الحضانة الآن ثم انتقل إلى الخطوة 4.11.
9. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الثانوي وشطف 3 × 1 ساعة في PBSTG في غرفة باردة مع الإثارة.
10. إزالة PBSTG واحتضان في محلول ثلاثي (على سبيل المثال ، 1: 250 تخفيف اليكسا فلور 647 ستربتافيدين في PBSTG). إذا رغبت في ذلك ، قم بتلطيخ النوى في هذه الخطوة بإضافة 0.1 ميكروغرام / مل بيسبنزيميد إلى الخليط. احتضان لمدة 20 ساعة في غرفة باردة مع الإثارة.
11. قم بإزالة المحلول الثلاثي وشطف 3 × 1 ساعة في PBSTG في غرفة باردة مع الإثارة.
12. اتركه في برنامج تلفزيوني حتى يصبح جاهزا للتركيب على شرائح المجهر.

5. تصاعد شرائح على شرائح المجهر

1. قم بإعداد العديد من شرائح المجهر حيث توجد أقسام لتركيبها.
2. لكل شريحة ، ضع شريطا بطول 50 مم بسمك 10 مل (254 ميكرومتر) من شريط كهربائي من الفينيل على قطعة من parafilm.
3. باستخدام ثقب مربع 1 سم × 1 سم ، قم بعمل ثقب في وسط الشريط الكهربائي والبارافيلم.
4. اسحب الشريط من البارافيلم وضعه أعلى شريحة المجهر ، مع ترك مساحة لوضع العلامات على الشريحة.
5. باستخدام ماصة صغيرة ، ضع قطرة أو قطرتين من وسائط التثبيت المضادة للتلاشي في الفتحة المربعة في وسط الشريط الكهربائي.
6. استخدم ملعقة منحنية لرفع قسم تقطيع الأنسجة الاهتزازي المطلوب من PBSTG وإزالة الرطوبة تماما بمسح مختبر نظيف أو قطعة من ورق الترشيح.
7. المس حافة الشريحة بقطرة الحامل واستخدم ملعقة أخرى لتحريك القسم برفق في وسائط التركيب.
8. قم بتغطية القسم ببضع قطرات أخرى من الحامل وضع بعناية غطاء 24 مم × 30 مم (سمك # 1.5) أعلى القسم والتركيب.
9. أغلق حواف الغطاء بطلاء الأظافر لإبقائه في مكانه.

6. الفحص المجهري متحد البؤر لشرائح الدماغ الثابتة

1. استخدم مضان واسع المجال للعثور على أورام الفلورسنت في شريحة الدماغ المركبة باستخدام العدسة الموضوعية المناسبة ومجموعة (مجموعات) المرشح.
   ملاحظة: يمكن أن تكون بعض الأورام كبيرة جدا ويمكن رؤيتها بسهولة مع هدف 4x ، بينما قد تتطلب الخلايا المفردة هدف 10x.
2. قم بالتبديل إلى الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام عدسة موضوعية مناسبة وليزر (ليزر) وحجم الثقب وإعدادات الكاشف. لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم هدفا 20x (الفتحة العددية [N.A.] = 0.75) للتصوير الروتيني وهدف زيت 60x (N.A. = 1.40) للتصوير عالي الدقة.
3. قم بتعيين الحدود العلوية والسفلى للمحور z وحجم الخطوة (للحالة المحددة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمجهر متحد البؤر) للحصول على أقسام بصرية. الحصول على مجموعة z من المقاطع البصرية.
4. استخدم برنامج المجهر متحد البؤر لإنشاء عرض حجم 3D للورم ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

7. إعداد كروي

1. إنشاء ألواح بولي (2-هيدروكسي إيثيل ميثاكريلات) (بولي هيما)
   1. قم بإنشاء محلول من 10 ميكروغرام / مل بولي هيما في 95٪ إيثانول ، وقم بتغطية أطباق بتري 35 مم (أو أطباق زراعة الخلايا) ب 1 مل من هذا المحلول.
   2. دع الأطباق تجلس على هزاز مكشوف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة لتطوير طلاء لسطح الطبق.
      ملاحظة: سوف يتبخر المذيب ويترك طبقة شفافة على الطبق ، والتي قد تبدو غير متساوية ، ولكن هذا لن يؤثر على القدرة على صنع كرويات الخلية.
   3. بعد التجفيف ، قم بتعقيم الأطباق المفتوحة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة الحيوية لمدة 1 ساعة. استبدل الأغطية بعد التعقيم. الأطباق المطلية جاهزة الآن للاستخدام.
2. تلطيخ DiD الفلوري للفحص المجهري بفاصل زمني
   ملاحظة: هذا القسم مخصص لتلطيخ الخلايا المفردة بصبغة الفلورسنت DiD لاستخدامها في صنع كرويات ، مما يحسن تصور حركة الخلية للتصوير المباشر بفاصل زمني.
   1. تعليق الخلايا في وسط ثقافة خالية من المصل.
   2. أضف 5 ميكرولتر من مخزون DiD / مل من تعليق الخلية واخلطه برفق عن طريق الماصة. احتضان لمدة 20 دقيقة على 37 درجة مئوية.
   3. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية المسمى عند 800 × جم عند 5 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
   4. نضح الطافع وإعادة تعليق الخلايا في وسائط دافئة لشطفها.
   5. كرر هذا الطرد المركزي وشطف الخطوة مرتين أخريين.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك ، انتقل إلى الخطوة 7.3.6 لعمل كرويات مباشرة بعد هذه العملية.
3. صنع كرويات الخلية
   1. قم بتسخين محلول التربسين / حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) بنسبة 0.25٪ إلى 37 درجة مئوية.
   2. GSCs المستنبتة في وسائط GSC¹⁷ (الجدول 1) وخلايا غلويما خبيثة U-118 (MG) في وسط زراعة U-118 (انظر الجدول 1). استخدم طبقا متقاربا بطول 10 سم لإعداد طبق واحد 35 مم من الأجسام الكروية. أضف عوامل نمو bFGF (10 نانوغرام / مل التركيز النهائي) و TGF-α (20 نانوغرام / مل التركيز النهائي) إلى GSCs في البداية ثم كل 3 أيام.
      ملاحظة: كانت الخلايا المستخدمة في الدراسة الحالية هي GSC15-2 / K72 الخضراء ، والأخضر GSC16-4 / K72 ، والأحمر U-118 / L1LE / mCherry2x ، والأحمر U-118 / 1879 / mCherry2x. يجب أن تكون صفيحة واحدة من الأجسام الكروية كافية لوحين من 6 آبار من شرائح الدماغ على إدراج الغشاء.
   3. شطف الخلايا على لوحات مع PBS معقمة ووضع 1 مل من محلول التربسين على طبق 10 سم. ضع في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 2-3 دقائق حتى تبدأ الخلايا في الانفصال.
   4. قم بتعطيل التربسين عن طريق إضافة 10 مل من وسائط الاستزراع المناسبة المحتوية على المصل في طبق 10 سم وافصل الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. ضع تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل.
   5. قم بإذابة الخلايا بالطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   6. نضح الوسائط من حبيبات الخلية وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من الوسائط.
   7. ضع 2 مل من معلق الخلية على كل طبق مطلي ببولي هيما 35 مم وأضف 2 مل إضافية من الوسائط المناسبة للحصول على 4 مل من إجمالي الوسائط لكل طبق. في حالة استخدام GSCs ، أضف عوامل النمو.
   8. احتضان الخلايا في حاضنة الخلايا حتى تصل الركام إلى حجم 100-200 ميكرومتر ، والذي يمكن أن يكون 1-2 أيام اعتمادا على كثافة الخلايا المطلية.

8. تشريح دماغ جنين الفرخ الحي وتقطيع تقطيع الأنسجة الاهتزازية

1. التحضير للتشريح
   1. قم بإعداد لوحة إدخال غشاء بوليستر 6 آبار مع 1 مل من وسائط زراعة شريحة الدماغ (انظر الجدول 1) أسفل إدخال الغشاء.
   2. تعقيم منطقة العمل والأدوات بنسبة 70 ٪ من الإيثانول.
   3. ضع لوحة إدخال 6 آبار على الجليد أثناء إجراء التشريح.
   4. تحضير 100 مل من وسائط تقطيع تقطيع الأنسجة الاهتزازية (الجدول 1) ووضعها على الثلج.
   5. ضع قنينة من 4٪ أغاروز منخفض الذوبان في برنامج تلفزيوني في حمام مائي حتى يذوب في سائل (حوالي 50 درجة مئوية).
   6. املأ حوض تقطيع الأنسجة المهتز بالثلج.
2. تشريح دماغ جنين الفرخ العقيم E14 / 15
   1. باستخدام شمعة البيض ، تتبع على طول محيط الجيب الهوائي فوق الجنين E14 أو E15 بقلم رصاص وقم بتغطية المنطقة المحددة بشريط شفاف.
   2. باستخدام مقص منحني أو ناعم ، قم بقص المنطقة التي تم تتبعها برفق ، مع الحرص على عدم قطع غشاء الجنين أو الأوعية الدموية ، وتجاهل القطعة العلوية من الصدفة.
   3. باستخدام ملقط منحني ، قم بإزالة غشاء الفضاء الهوائي فوق الجزء العلوي من الجنين وحدد موقع رأس جنين الفرخ.
   4. قطع رأس الجنين ووضع الرأس في طبق 10 سم مع محلول CMF معقم بارد. انظر الشكل التكميلي 2.
   5. باستخدام ملقط دقيق معقم ، قشر الجلد الذي يغطي الدماغ للكشف عن الأم الجافية الأساسية. إزالة عظام الجمجمة المشكلة على الجانبين الأيسر والأيمن من الدماغ. عظام الجمجمة المشكلة لا تغطي بعد غالبية الدماغ.
   6. استخدم ملقط مدبب ناعم (# 5 أو # 55) لتمزيق السحايا التي تغطي مركز الدماغ وقشره إلى كل جانب للكشف عن الدماغ.
   7. باستخدام ملقط منحني ناعم ، اغرف الدماغ لأعلى من أسفل الجبهة واسحبه برفق من تجويفه.
   8. تشريح الدماغ إلى أجزائه الرئيسية الثلاثة: الدماغ الأمامي ، الدماغ المتوسط (tecta البصري) ، المخيخ. استشر أطلس تطور الفرخ ، إذا لزم الأمر.
   9. قم بإزالة الأم التي تعلوها الحنون من القفص باستخدام ملقط ناعم.
      ملاحظة: ينفصل الحنون بسهولة عن القفص الصدري ، ولكن ليس عن الدماغ الأمامي أو المخيخ. يمكن إزالة الحنون من الدماغ الأمامي عن طريق لمسه أو لفه على شاش معقم.
   10. ضع مناطق الدماغ المشرحة في طبق معقم صغير على الجليد.
3. تضمين وتقطيع الدماغ
   1. باستخدام ملقط منحني كمغرفة ، التقط برفق إما القفص البصري أو منطقة الدماغ الأمامي وامسحه قليلا على شاش معقم لإزالة السائل الزائد لضمان التصاق الأغاروز بسطح الدماغ الخارجي.
   2. باستخدام ماصة نقل معقمة ، املأ القالب بأغاروز منخفض الذوبان. قم بإعداد قالب بسيط عن طريق تشكيل رقائق الألومنيوم حول جسم مناسب الحجم. يتم استخدام كتلة تقطيع الأنسجة المعدنية الصغيرة المستطيلة بشكل روتيني ككائن. انظر الشكل التكميلي 3.
   3. ضع منطقة الدماغ بسرعة في الأغاروز واتركها تتصلب (حوالي 4-5 دقائق) على الجليد.
      ملاحظة: قد يغرق الدماغ في قاع القالب قبل أن تصلب الأغاروز. إذا حدث هذا ، انتظر 1 دقيقة للسماح للأجار بالبدء في التماسك ، ثم ضع منطقة الدماغ في الأغاروز. حاول تعليق منطقة الدماغ مباشرة في منتصف الأغاروز.
   4. قم بإزالة رقائق الألومنيوم من حول الدماغ المضمن في الأغاروز المتصلب وقم بقص الأغاروز الزائد حول الجانبين باستخدام شفرة حلاقة أو مشرط معقم.
   5. ضع قطرة من غراء cyanoacrylate على مربع الفولاذ المقاوم للصدأ في طبق / صينية التقطيع ، ضع كتلة الأغاروز مع الدماغ ، واترك الغراء يترابط لمدة 1 دقيقة. ضع الطبق / الدرج في ظرف تقطيع الأنسجة الاهتزازي ، وشد الدرج واملأه بوسائط التقطيع لتغطية الجزء العلوي من كتلة الأغاروز.
   6. قم بقص الأجزاء الموجودة على قطاعة الأنسجة الاهتزازية عند 250-350 ميكرومتر باستخدام سكين الياقوت ، والذي تم الإبلاغ عن أنه يؤدي إلى تلف الأنسجة الحية أقل من شفرة الحلاقة الفولاذية.
   7. عندما يتم قطع شرائح الدماغ وتطفو بحرية في صينية التقطيع ، استخدم ملعقة معقمة لغرف الشريحة وإزالتها من الدرج. حرك الجزء برفق من الملعقة وعلى ملحق الغشاء باستخدام ملعقة معقمة أخرى.
      ملاحظة: عادة ، يمكن وضع شريحتين أو ثلاث شرائح دماغية على كل إدخال غشاء ، إذا رغبت في ذلك. قد ينفصل الأغاروز المحيط بشريحة الدماغ إذا لم يتم مسح الدماغ بشكل كاف بشاش معقم لإزالة السائل الزائد. إذا استمر حدوث ذلك بعد النشاف الكافي قبل التضمين ، فالتقط الشريحة برفق بدون الأغاروز المحيط وحركها على ملحق الغشاء.
   8. ضع صفيحة 6 آبار من شرائح الدماغ على حشوات غشائية في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
   9. في اليوم التالي للطلاء ، استخدم ماصة باستور معقمة لشفط الوسائط من أسفل الملحق (توجد فجوات في جوانب الإدخالات للسماح للماصة بالوصول إلى الوسائط أدناه). أضف 1 مل من وسائط الشرائح الطازجة إلى كل بئر أسفل ملحق الغشاء. استمر في تغيير الوسائط كل يوم بعد ذلك.
   10. انتظر بضعة أيام حتى تلتصق شرائح الدماغ بقوة بإدخالات الغشاء ويبدو أنها تتسطح إلى حد ما. هذه علامة على أن الشرائح قابلة للحياة وجاهزة لإدخال خلايا GBM.

9. إدخال خلية GBM على شرائح الدماغ

1. طريقة كروية
   1. بعد أن يصل حجم كرويات الخلية إلى 150-200 ميكرومتر ، استخدم ماصة صغيرة 20 ميكرولتر مضبوطة على 5 ميكرولتر لإزالة واحد إلى عدة كرويات من طبق الاستزراع الخاص بهم. انظر الشكل التكميلي 3.
   2. اطرد الوسائط برفق باستخدام كرويات على شريحة الدماغ المطلوبة.
      ملاحظة: يجب أن تكون كرويات الخلية مرئية في طرف الماصة. سيؤدي استخدام طرف ماصة واضح إلى تسهيل رؤيتها في الحافة. إذا سقط الكروي من شريحة الدماغ عند إطلاق السائل ، فيجب استخدام رمش معقم بالإيثانول ملتصق بعصا قضيب خشبية رقيقة لدفع الكروي برفق إلى شريحة الدماغ.
   3. اسمح للكرويات بالثقافة على شرائح الدماغ لمدة 2-5 أيام.
      ملاحظة: يبدو أن القيد هنا هو التدهور النهائي للأوعية الدموية وخلايا الدماغ في الشريحة. ستظهر الأوعية الدموية المتدهورة ككرات متقطعة في الشريحة عند تلطيخها بالصفيحة.
2. طريقة لكمة الخزعة
   1. اسمح لشرائح الدماغ بالالتصاق عن طريق الظهور وكأنها تتسطح على إدخال الغشاء (قد يستغرق 2-5 أيام في الثقافة).
   2. قم بإذابة مصفوفة الخلية على الجليد.
   3. في خزانة السلامة الحيوية لزراعة الخلايا ، قم بتوصيل لكمة خزعة معقمة قطرها 1 مم بأنبوب شفاط مفرغ.
   4. المس شريحة الدماغ برفق باستخدام لكمة الخزعة لإنشاء ثقب 1 مم في وسط شريحة الدماغ.
      ملاحظة: سيتم استنشاق الأنسجة الموجودة في لكمة الخزعة في الثقب بواسطة الفراغ.
   5. تحضير معلق مصفوفة الخلية عن طريق التربسين طبق 60٪ -70٪ متلاقى 10 سم من الخلايا وتعليقه في 10 مل من الوسائط ؛ ثم امزج 1 مل من هذا المعلق مع 100 ميكرولتر من المصفوفة.
   6. باستخدام ماصة دقيقة 20 ميكرولتر ، ضع 1 ميكرولتر من خليط مصفوفة الخلية في كل ثقب في شرائح الدماغ.
   7. بعد الانتهاء من وضع خليط الخلية ، ضع طبق شرائح الدماغ مع الخلايا المدمجة مرة أخرى في الحاضنة ، واسمح للمصفوفة بالتصلب والخلايا لغزو شريحة الدماغ المحيطة.

10. مجهر الفاصل الزمني مضان واسع المجال

1. ضع شريطا قابلا للإزالة حول حافة اللوحة المكونة من 6 آبار لمنع تبخر الوسائط ، مما يترك فجوة صغيرة على جانب واحد لتبادل الغازات.
2. ضع الألواح في غرفة استزراع مخصصة على مرحلة آلية قابلة للتعديل على مجهر التألق المقلوب.
   ملاحظة: تم الاحتفاظ بالغرفة في الظروف الجوية بنسبة 5٪ CO₂ و 95٪ هواء باستخدام وحدة تحكم في حقن الغاز ، وتم الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية مع جهاز تحكم في درجة حرارة الهواء الدافئ وإدخال مرحلة يتم التحكم في درجة حرارته. انظر Fotos et ^al.18 للحصول على تفاصيل حول النظام المستخدم هنا.
3. باستخدام برنامج التحكم المجهري المناسب ، قم بإنشاء جدول اقتناء بفاصل زمني يجمع صور الفلورسنت للمناطق ذات الأهمية مرة كل 10 دقائق لمدة 20 ساعة.
   ملاحظة: إذا تم استخدام ملصق الفلورسنت الأخضر في الخلايا (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأخضر [GFP]) ، فاستخدم الحد الأدنى من ضوء الإثارة الأزرق المطلوب لتصور الخلايا لمنع السمية الضوئية. لا يبدو أن التسميات الحمراء (على سبيل المثال ، mCherry) والأحمر البعيد (على سبيل المثال ، DiD) تعاني من هذه المشكلة المحتملة بسبب إثارة الطول الموجي الأطول.

11. شرائح الدماغ المناعية بعد الفحص المجهري بفاصل زمني

ملاحظة: تم تحسين بروتوكول التلوين المناعي هذا لتلطيخ الأوعية الدموية باللامينين والنوى بالبيسبنزيميد. استخدم الأجسام المضادة المناسبة للجزيء (الجزيئات) المطلوب من الاهتمام.

1. قم بشفط الوسائط من أسفل ملحق الغشاء باستخدام ماصة باستور ، وضع 1 مل من 2٪ PFA في 0.1 متر من محلول كاكوديلات الصوديوم أسفل الملحق و 1 مل أعلى الملحق لتغطية شريحة الدماغ. دع الشرائح تثبت طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
2. قم بإزالة المثبت من أسفل إدخال الغشاء وأي مثبت متبقي على شريحة الدماغ (يميل المثبت إلى التسرب من خلال إدخال الغشاء إلى البئر أدناه).
3. أخرج الملحق بشرائح من البئر مقاس 35 مم وضعها في طبق بلاستيكي أكبر.
4. قم بإعداد صفيحة من 24 بئرا عن طريق إضافة 350 ميكرولتر من PBS إلى أكبر عدد ممكن من الآبار مثل شرائح الدماغ (شريحة واحدة / بئر عند تلطيخ المناعة).
   1. باستخدام ملعقة رفيعة ، قم بإزالة الأغاروز برفق من حول شريحة الدماغ دون فصل شريحة الدماغ عن إدخال الغشاء. تأكد من أن الأغاروز ينفصل عن الحافة الخارجية لشريحة الدماغ بسهولة. إذا لم يكن كذلك ، اترك الأغاروز متصلا بشريحة الدماغ.
   2. باستخدام مشرط حاد ، قم بقطع الغشاء المحيط بشريحة الدماغ حتى تصبح الشريحة ذات الغشاء الأساسي خالية من بقية الإدخال. التقط الغشاء بشريحة الدماغ المرفقة ، باستخدام ملقط دقيق للإمساك بالغشاء ، وضعه في بئر من لوحة 24 بئرا في برنامج تلفزيوني.
5. شطف شرائح 3x مع PBS أكثر من 1 ساعة في الغرفة الباردة مع التحريض اللطيف المستمر أو هزاز ، بحيث تتحرك شريحة داخل البئر.
6. أثناء الشطف ، قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الأساسي.
   1. خفف مضاد اللامينين إلى 2 ميكروغرام / مل في PBSTG (انظر الجدول 1).
7. قم بإزالة برنامج تلفزيوني من الآبار واحتضانه طوال الليل في محلول الأجسام المضادة الأولية في غرفة باردة مع تحريض لطيف.
8. بعد 20 ساعة على الأقل من الحضانة ، قم باستنشاق محلول الأجسام المضادة الأساسي وشطف الأقسام 3x لمدة 1 ساعة في PBSTG.
9. أثناء الشطف ، قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الثانوي.
   1. تمييع الفلورسنت-GAM مع الفلوروكروم المحدد اللازم لتخفيف 1: 200 في PBSTG جنبا إلى جنب مع تركيز 0.1 ميكروغرام / مل من ثنائي بنزيميد.
   2. إزالة PBSTG واحتضان بين عشية وضحاها في غرفة باردة مع التحريض في محلول الأجسام المضادة الثانوية الفلورية.
   3. قم بإزالة الجسم المضاد الثانوي وشطف 2x على 1 ساعة في PBSTG و 1x على 1 ساعة في PBS.
   4. اتركه في PBS حتى يصبح جاهزا للتركيب على شرائح المجهر (القسم 5) وعرضه.

Discussion

تتضمن الخطوات الحاسمة في بروتوكول حقن الخلايا في بطين الدماغ المتوسط (الصمام البصري) عدم إتلاف الأوعية الدموية في الغشاء المشيمي النخاعي في البويضة أو المحيطة بالجنين قبل الحقن وأثناءه ، على الرغم من أن الغشاء السلوي المحيط بالجنين مباشرة يمكن سحبه برفق وتثبيته لوضع الرأس عند حقن الخلايا في الدماغ المتوسط. السلى صلب نسبيا ويمكن سحبه بالملقط الدقيق لوضع الرأس وتثبيته بيد واحدة ، لحقن الخلايا باليد الأخرى في القفص البصري ، وهو الهيكل الكبير المستدير في منتصف الدماغ. بشكل عام ، تتراوح صلاحية الأجنة المحقونة من 25٪ إلى 75٪ ، اعتمادا على عوامل غير معروفة ، وعمليا كل جنين يبقى على قيد الحياة يحتوي على ورم صغير على الأقل في القفص البصري. تشمل الخطوات الحاسمة في توليد شرائح دماغية قابلة للحياة تنشيف أنسجة السائل الزائد بحيث يلتصق الأغاروز بالدماغ أثناء التقطيع وللحفاظ على برودة الأنسجة والشرائح حتى توضع على الغشاء الملحق. نظرا لأن أنواع الخلايا المختلفة تشكل كرويات بشكل مختلف (في السرعة والحجم) ، يجب تحسين كثافة الخلايا المطلية على ألواح poly-HEMA وطول الوقت قبل حصاد الكائنات الكروية لكل نوع من الخلايا.

لم يخضع العمل هنا لدراسة طولية رسمية لصلاحية شريحة الدماغ. استخدم Yang et al. ثقافات شريحة دماغ جنين الفرخ مماثلة لتلك المستخدمة هنا وأظهر صلاحية جيدة للشرائح لمدة 7 أيام^{على الأقل 16}. أظهر العمل السابق أنه عندما تم الاحتفاظ بأنسجة OT في وسائط دون المستوى الأمثل ، ظهرت العديد من نوى pyknotic في الأنسجة ، والتي لم تحدث في الشرائح في العمل هنا. بالإضافة إلى ذلك ، عندما تتدهور الشرائح في ظروف دون المستوى الأمثل ، تتفتت الأوعية الدموية وتظهر كصفوف من المجالات الإيجابية لللامينين (غير معروضة). وبالتالي ، على الرغم من أن الجدوى هنا لم يتم التحقق منها بطرق مثل الفيزيولوجيا الكهربية أو تعبير caspase-3 النشط ، لم يظهر هنا أي من مؤشرات موت الخلايا التي شوهدت في ظل ظروف ثقافة دون المستوى الأمثل.

تم التركيز على OT لتجارب أورام المخ في الجسم الحي لأنها المنطقة الأكثر سهولة في الحقن مع أكبر بطين. في E5 ، وهو آخر يوم يكون فيه الجنين صغيرا بما يكفي ليظل متاحا فوق صفار البيض ، يجب إجراء الحقن في البطين ، لأن جميع مناطق الدماغ ليست أكثر من منطقة بطين رقيقة. ومع ذلك ، فإن هذه الحقن تؤدي بنجاح إلى أورام مدمجة مع خلايا تغزو حمة الدماغ. في بعض الأحيان ، توجد الأورام الناتجة في الدماغ الأمامي أو المخيخ ، لكن هذا ليس شائعا. تم استخدام شرائح خارج الجسم الحي من القفص البصري E15 بشكل أساسي للتجارب هنا ، بحيث يمكن ربط نتائج الزراعة المشتركة خارج الجسم الحي بتجارب الحقن في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن شرائح الدماغ الأمامي مناسبة أيضا ولها مساحة سطح أكبر وبطين رقيق جدا مقارنة بالقفص البصري ، مما قد يجعل الدماغ الأمامي أكثر ملاءمة للمزارع المشتركة خارج الجسم الحي التي لا ترتبط بالحقن في الجسم الحي.

لقد ثبت هنا أن الحقن في الجسم الحي ، متبوعا بتثبيت الأنسجة ، وتقسيم تقطيع الأنسجة الاهتزازي ، والتلطيخ المناعي للامينين والعلامات الأخرى ، أدى إلى صور عالية الدقة لخلايا GBM و GSCs في أنسجة المخ على مقربة من الأوعية الدموية. تم تسهيل القدرة على تحديد العلاقات المتبادلة بين الخلايا السرطانية والأوعية الدموية إلى حد كبير من خلال إنشاء عروض حجم 3D من مداخن z من المقاطع البصرية متحدة البؤر باستخدام برنامج متحد البؤر وتعليمات الشركة المصنعة. كان التصوير بفاصل زمني باستخدام الفحص المجهري الفلوري واسع المجال للخلايا المصنفة GFP و mCherry و DiD ممكنا. ومع ذلك ، فإن الخلايا المهاجرة التي كانت على مقربة من الأجسام الكروية شديدة الفلورسنت كانت محجوبة في بعض الأحيان بسبب "التوهج" من الكروية. يمكن تقليل هذا التأثير غير المرغوب فيه إلى حد ما عن طريق ضبط أوقات التعرض بعناية لجمع صور واسعة النطاق. أدى التصوير بفاصل زمني باستخدام مكدسات Z متحدة البؤر بمرور الوقت (4D) إلى القضاء على التوهج خارج التركيز البؤري من الأجسام الكروية وأدى إلى خلايا مهاجرة محددة بدقة ذات خلفية داكنة. لم يتم وصف ذلك في البروتوكول ، ولكن تم تنفيذه بشكل مشابه لتصوير الفاصل الزمني واسع المجال ، والذي تم إجراؤه أثناء وجود شرائح الدماغ على إدخالات الغشاء الشفاف في لوحة بلاستيكية ذات 6 آبار. على الرغم من أن التصوير الفاصل الزمني متحد البؤر ينتج عنه صور أكثر وضوحا بشكل ملحوظ للخلايا الفردية وسلوكها ، فإن تجربة الفاصل الزمني متعددة النقاط التي تجمع مداخن z من 10 طائرات z / نقطة ، على فترات 10 دقائق على مدار 20 ساعة ، هي استخدام مكثف لجلفانومتر رأس المسح. وبما أن هذا يمكن أن يقلل بشكل كبير من عمر الجلفانومتر، فإن هذه الطريقة تستخدم بحكمة.

على الرغم من أن نظام جنين الفرخ مناسب جدا لكل من الحقن في الجسم الحي وتجارب الزراعة المشتركة خارج الجسم الحي التي تبحث في سلوك خلية GBM ، إلا أن هناك العديد من القيود على هذا النظام النموذجي. كما هو الحال مع أي نظام طعم أجنبي ، فإن البيئة التي تزرع فيها الخلايا البشرية ليست الدماغ البشري ، ولكن يبدو أن سلوك خلية GBM يحاكي ذلك في نماذج القوارض وفي المرضى من البشر. بعد إجراء تجارب الحقن في الجسم الحي على E5 ، يسمح عادة للأورام بالتشكل لمدة 10 أيام ، حتى E15. من الواضح أن هذا ليس وقتا كافيا لدراسة جميع جوانب تكوين الورم وغزو الخلايا. ومع ذلك ، فقد ثبت هنا أن الأورام الصلبة تتشكل في حمة الدماغ ، وتتفاعل الخلايا وتعيد ترتيب نفسها داخل الورم ، ويحدث غزو دماغي كبير على طول الأوعية الدموية ومنتشر خلال هذه الفترة الزمنية القصيرة نسبيا. هناك قيد آخر على نظام جنين الفرخ في الجسم الحي وهو أنه غير مناسب للأدوية أو العلاجات الأخرى بسبب الصفار الكبير والدورة الدموية خارج الجنين التي تعمل أثناء نمو جنين الفرخ. قد تؤدي العلاجات الدوائية السائلة الموضعية إلى تركيز متغير للغاية وغير معروف في الدماغ بسبب الانتشار بعيدا عن الجنين إلى كتلة صفار أكبر بكثير. وبالمثل ، فإن حقن الأدوية في الوريد في الجهاز الدوري خارج الجنين الدقيق للغاية من شأنه أن يتسرب أو ينتشر خارج الأوعية الدموية ويؤدي أيضا إلى تركيزات غير معروفة في الدماغ. هذا هو أحد الأسباب الرئيسية لاعتماد طريقة زراعة الشرائح خارج الجسم الحي - بحيث لا يمكن فقط ملاحظة سلوك الخلية وتتبعه عبر الفحص المجهري بفاصل زمني ، ولكن أيضا حتى يمكن اختبار العلاجات التي نجحت في تغيير سلوك خلية GBM في الطبق⁴ في بيئة أنسجة المخ الأكثر صلة.

ينظر إلى تطوير نظام نموذج ورم الدماغ التقويمي لجنين الفرخ على أنه إضافة مهمة للأنظمة والأدوات المتاحة لدراسة تكوين ورم GBM وسلوك الخلايا الغازية. من المحتمل أن يكون بيض الدجاج المخصب متاحا بسهولة في معظم المناطق ، فهو غير مكلف مقارنة بالقوارض ، ولا توجد تكاليف لرعاية الحيوانات ، والأجنة مرنة للغاية ومقاومة للعدوى (أي أن معظم العمل يتم على سطح الطاولة) ، والأجنة قابلة للتلاعب بدرجة كبيرة ويمكن زراعتها في ثقافة بدون قشرة¹⁹ ، ولا تعتبر أجنة الكتاكيت فقارية وبالتالي لا تتطلب موافقة IACUC من خلال إرشادات المعاهد الوطنية للصحة (المتطلبات المؤسسية قد تختلف). وبالتالي ، فإن هذه المزايا المتعددة تجعل نظام جنين الفرخ جذابا للغاية إذا حصر المرء أسئلته وتجاربه في تلك التي تقع ضمن حدوده. تم إجراء العديد من دراسات خلايا GBM من قبل الآخرين باستخدام جنين الفرخ ، ولكن هذه الدراسات استخدمت بشكل حصري تقريبا الغشاء المشيمي الألانتوي (CAM) للجنين 20،21،^22،23،24،²⁵،26،27،^28،29 وبرعم الأطراف³⁰، وليس الدماغ. كان هناك أيضا تقرير عن زرع الورم الأرومي النخاعي في دماغ الفرخ على E2³¹. مما لا شك فيه أن استخدام جنين الفرخ كنظام نموذج xenograft لتقويم العظام ، كما هو موضح هنا ، يجب أن يسفر عن نتائج أكثر أهمية لبيولوجيا ورم GBM البشري من الدراسات التي تستخدم CAM.

على الرغم من أن هذه الدراسات قد بدأت فقط في الاستفادة الكاملة من نظام نموذج ورم دماغ جنين الفرخ لدراسات خلية GBM البشرية وسلوك GSC ، فمن المأمول أن يقوم الآخرون بتوسيع الاستخدامات وإيجاد المزيد من التطبيقات المحتملة. يمكن للمرء أن يتخيل أن هذا النظام لن يكشف فقط عن الآليات التي تنظم تكوين ورم GBM وسلوك الخلية ، ولكنه سيسمح أيضا بإجراء اختبار ما قبل السريري لعقاقير ومواد معينة على خلايا مرضى معينين. على سبيل المثال ، إذا تم إعداد مزارع شرائح الدماغ مسبقا ، فيمكن وضع الخلايا السرطانية أو القطع من عمليات استئصال الورم الجراحية أو عضويات GBM³² المشتقة من المريض مباشرة في الثقافة المشتركة خارج الجسم الحي ، ويمكن تقييم العلاجات المختلفة في غضون أيام. وبالمثل ، يمكن حقن خلايا المريض المنفصلة مباشرة في الدماغ المتوسط E5 في البويضات لتقييم قدرتها على تكوين الأورام وغزو حمة الدماغ. وبالتالي ، من المأمول أن تؤدي أوصاف الأساليب والنتائج التمثيلية هنا إلى تسهيل وتشجيع زيادة استخدام هذا النظام غير المستغل بشكل كبير لأبحاث سرطان الدماغ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cm x 1 cm square hole paper punch	Birabira	N/A
1 mm biopsy punch pen	Robbins Instruments	20335
6 well insert plate (Corning Transwell)	Millipore Sigma	CLS3450
9" Disposable Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20C
15 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-12
24 well plate	Corning Costar	3526
50 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-9
Agar	Fisher BioReagents	BP1423-500	for embedding fixed brains
Alexafluor 488-conjugated GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-605-146
Alexafluor 647-conjugated GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-146
Aluminum foil	ReynoldsWrap	N/A
Ampicillin	Sigma Aldrich	A-9518
anti-integrin alpha-6 monoclonal antibody GOH3	Santa Cruz Biotechnology	sc-19622
anti-L1CAM monoclonal antibody UJ127	Santa Cruz Biotechnology	sc-53386
anti-laminin monoclonal antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	3H11
anti-nestin monoclonal antibody 10c2	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
anti-Sox2 monoclonal antibody E-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
B27 supplement without vitamin A	GIBCO	17504-044
bisbenzimide (Hoechst 33258)	Sigma-Aldrich	B2883	nuclear stain
Cell culture incubator	Forma		standard humidified CO2 incubator
Centrifuge	Beckman Coulter
Confocal microscope	Nikon Instruments	C2si+	With custom-made cell incubator chamber
Confocal microscope objective lenses	Nikon Instruments		Plan Apo lenses, except S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA objective lens for confocal time-lapse imaging
Confocal microscope software	Nikon Instruments	NIS Elements	Version 5.2
Curved foreceps	World Precision Intruments	504478
Curved scissors	Fine Science Tools
Curved spatula	Fisher Scientific	14-375-20
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue	KG-585 12R
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270
DiD far red fluorescent dye	Invitrogen	V22887	Vybrant DiD
DMEM	Sigma Aldrich	D5671
DMEM/F12	Sigma Aldrich	D8437
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-1L
egg incubator	Humidaire
electrical tape (10 mil thick/254 µm)	Scotch	N/A
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories	2701
Fast green FCF dye	Avocado Research Chemicals	16520
FBS	Gemini Bio-products	900-108
filter paper	Fisher Scientific
Gauze	Dynarex	3353
Glass Capillaries for microinjection	World Precision Instruments	TW100-4
Glycerol	Fisher BioReagents	BP228-1	for mounting media
GSCs (human glioblastoma stem cells)	Not applicable		Isolated from patient GBM specimens in Galileo laboratory in GSC media and then transduced with a GFP encoding lentiviral vector.  Cells used were between passage 10 and 30.
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-020-CV
Hemacytometer	Hausser scientific
Heparin	Fisher Scientific	BP2524-100
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H0887
Horse Serum (HI)	Gibco	26050-088
Human FGF-2	BioVision	4037-1000
Human TGF-α	BioVision	4339-1000
Inverted phase contrast microscope	Nikon Instruments	TMS	for routine viewing of cultured cells
KCl	Fisher Scientific	BP366
KH2PO4	Fisher Scientific	P284
Laboratory film	Parafilm
Labquake Shaker	LabIndustries	T400-110
L-Glut:Pen:Strep	Gemini Bio-products	400-110
Low-melt agarose	Fisher Scientific	BP1360	for embedding live brains
Matrix	Corning Matrigel	354234
Medium 199	GIBCO	11150-059
MEM	Corning	10-010-CV
Metal vibratome block
Micropipette tips (20, 200, 1,000 µL)	Fisherbrand
Micropipettors (20, 200, 1,000 µL)	Gilson
Microscope Coverglass (no. 1.5 thickness)	Fisherbrand	12544A
NaCl	Fisher Scientific	S271
NaH2PO4 + H2O	Fisher Scientific	S369
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
Normal goat serum	Millipore Sigma	526-M
N-propyl gallate	Sigma Aldrich	P3130	for mounting media
Parafilm	Parafilm
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS	Sigma Aldrich	P5493-1L
Pencil
Plain Microscope slides	Fisherbrand	12-550-A3
Plastic 35 mm Petri dish	Becton Dickinson	351008
pneumatic picopump	World Precision Intruments	PV830
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)  (poly-HEMA)	Sigma Aldrich	P-3932
razor blade- double edge	PACE		for cutting fixed brain slices
sapphire knife	Delaware Diamond Knives		for cutting live brain slices
Scalpel	TruMed	1001
Sodium cacodylate buffer 0.2 M pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11652
Specimen chamber for vibratome	custom-made
Stereo Dissecting Microscope	Nikon Instruments	SMZ1500	Equipped with epifluorescence
straight foreceps	World Precision Intruments	500233
straight scissors	Fine Science Tools
Sucrose	Mallinckrodt	7723
Time-lapse fluorescence microscope (widefield fluorescence)	Nikon Instruments	TE2000-E	With custom-made cell incubator chamber (see Fotos et al., 2006)
Tissue culture dish polystyrene 100 mm	Thermo Fisher Scientific	130182	for cell culturing
Tissue culture dish polystyrene 60 mm	Becton Dickinson	353004	for cell culturing
Transfer pipette	American Central Scientific Co.	FFP011
Transparent tape	Scotch
Triton X-100	Sigma Aldrich	T-8787
Trypsin (0.25%) + 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
U-118 MG human GBM cell line	ATCC	HTB-15	Cells were transduced with a lentiviral vector encoding the entire ectodomain sequence of the L1CAM adhesion protein and then with lentiviral vector pUltra-hot encoding mCherry.  Passage numbers are unknown.
Vacuum pump	Cole-Parmer	EW-07532-40	"Air Cadet"
Vibrating tissue slicer	Vibratome	3000	for cutting live and fixed brain slices