ニワトリ胚脳をモデルとしてヒト膠芽腫細胞挙動の in vivoおよび ex vivo 解析(英語)

要約

ニワトリ胚は、 ovo および ex vivo 脳スライス共培養におけるヒト膠芽腫(GBM)脳腫瘍の研究に使用されます。GBM細胞の挙動は、 ex vivo 共培養におけるタイムラプス顕微鏡によって記録することができ、両方の調製物は、詳細な3D共焦点分析によって実験エンドポイントで分析することができる。

要約

ニワトリ胚は、脊椎動物の発生の研究、特に実験的操作のための理想的なモデルシステムです。ニワトリ胚の使用は、 in vivoでの ヒト膠芽腫(GBM)脳腫瘍の形成および周囲の脳組織への腫瘍細胞の浸潤性を研究するために拡張されています。GBM腫瘍は、蛍光標識細胞の懸濁液を ovoのE5中脳(視蓋)心室に注射することによって形成することができる。

GBM細胞によっては、脳室と脳壁内にコンパクトな腫瘍がランダムに形成され、細胞群が脳壁組織に浸潤します。腫瘍のある固定E15テクタの厚い組織切片(350 μm)を免疫染色して、共焦点zスタック画像の3D再構成によって分析すると、浸潤細胞が血管に沿って移動することが多いことを明らかにすることができます。生きたE15の中脳および前脳スライス(250-350 μm)をメンブレンインサート上で培養し、蛍光標識したGBM細胞を非ランダム位置に導入して、血管に沿って発生する可能性のある細胞浸潤を分析するための ex vivo 共培養を約1週間にわたって行うことができます。これらの ex vivo 共培養は、広視野または共焦点蛍光タイムラプス顕微鏡によってモニターして、生細胞の挙動を観察することができます。

次に、共培養スライスを固定し、免疫染色し、共焦点顕微鏡で分析して、浸潤が血管または軸索に沿って発生したかどうかを判断できます。さらに、共培養システムは、異なる細胞タイプおよび色の凝集体を異なる正確な位置に配置し、細胞の動きを観察することにより、潜在的な細胞間相互作用を調べるために使用することができる。薬物処理は ex vivo 培養で行うことができますが、これらの処理は in ovo システムと互換性がありません。これらの2つの相補的なアプローチにより、高度に操作可能な脊椎動物の脳環境におけるヒトGBM細胞の挙動と腫瘍形成の詳細かつ正確な分析が可能になります。

概要

癌細胞の挙動のin vitro研究は、in vivo異種移植片モデルにおける腫瘍形成および細胞浸潤中に観察されるより複雑な挙動の間に機能する潜在的なメカニズムを分析するためにしばしば使用されます。たとえば、膠芽腫(GBM)の場合、in vitro研究では、新しいニワトリ胚異種移植片脳腫瘍モデル1,2,3,4,5において、腫瘍形成および脳浸潤中にL1CAMがどのように機能する可能性があるかのメカニズムが明らかになりました。in vitro実験とin vivo実験は有用な方法で互いに補完し合っていますが、結果の相関方法には大きなギャップがあります。例えば、皿上のGBM細胞の運動性の機構解析は非常に人工的な状況であり、in vivo異種移植片モデルは、腫瘍形成と細胞挙動の静的な時点またはエンドポイント分析のみを明らかにすることができます。げっ歯類またはニワトリ胚のいずれかを使用したin vivo研究は、これらの異種移植片モデルで細胞が脳組織に侵入している間の細胞の挙動を監視するのに容易ではありません。それにもかかわらず、ニワトリ胚異種移植片モデルは、接着タンパク質L1CAMがヒトT98G GBM細胞の侵襲能力において刺激的役割を果たすことを実証した^2,5。

この問題に対する適切な解決策は、ex vivoモデルと呼ばれる器官型脳スライス培養モデルを用いて、in vivoおよびin vitroの両方の方法を橋渡しすることによって達成することができる。このex vivoモデルでは、生きた脳組織を数百ミクロンの厚さで数週間まで維持できるため、がん細胞を移植し、実際の組織での挙動を経時的に観察し、実験のエンドポイントでより詳細なマーカー分析を行うことができます。

一般的な有機型スライス培養法は、半透明または透明な多孔質膜の上に数百ミクロンの厚さの脳スライスを培養し、組織を空気にさらしたままにし、栄養培地が膜の下から組織を維持することを可能にすることでした(Stoppini et ^al.6を参照)。この方法のさまざまなバリエーションが、異なる媒体または異なるメンブレンインサートの使用など、さまざまな研究に使用されてきました。さまざまなメンブレンインサートには、直径30 mm、35 mm^培養皿6の多孔質(0.4 μm)メンブレンインサート、および6^{ウェルプレート7}用の細胞培養インサート(0.4 μm)が含まれます。さまざまな培地には、50%MEM / HEPES + 25%熱不活性化馬血清+ 25%ハンクス平衡塩溶液(HBSS)⁸、50%還元血清培地+ 25%馬血清+ 25%HBSS⁹などがあります。半透明または透明なメンブレンが蛍光標識されたGBM細胞と共に使用される場合、そのような培養物は、倒立広視野または共焦点蛍光顕微鏡^10、11、¹²、13^、14、15を用いて下から画像化することができる。

げっ歯類を用いて多くのin vivo同所性脳腫瘍異種移植片およびex vivo有機型脳スライス培養モデルが確立されているが、上で引用したように、ニワトリ胚(Gallus gallus)はこれらの目的のために十分に活用されていない。しかしながら、ニワトリ胚は、ヒトおよびラットグリオーマ浸潤の両方の研究のためのin vivo同所性異種移植片モデルとして使用できることが実証されている¹、^2、5。ニワトリ胚脳への異種移植細胞は、げっ歯類モデルで観察されたものと同様の侵入パターンを示しており、GBM腫瘍細胞分析のためのin vivoモデルとしてのニワトリ胚の使用をさらに支持している。ひよこ胚はまた、安価であり、げっ歯類よりも簡単に維持でき(つまり、ラボインキュベーターの卵殻で)、取り扱いがはるかに簡単であるため、短期間のin vivoGBM研究にとって魅力的な選択肢となっています。最近の記事では、スライスが少なくとも7日間生存可能であった正常な脳発達中の軸索の形成および成長のためのニワトリ胚脳スライス培養の使用が記載されている¹⁶。しかしながら、組織環境におけるGBM細胞挙動のex vivo分析のためのそのようなニワトリ胚脳スライス培養の使用は不足している。この記事では、ヒトGBM細胞とGBM幹細胞(GSC)のin vivoの初期ニワトリ胚脳への移植、およびex vivoでの生きたニワトリ胚脳スライス培養へのGBM細胞の導入について説明します。これらの調製物から得られる結果として生じる腫瘍および細胞浸潤パターンのいくつかの代表例も提供される。

プロトコル

この作業を実行するために、デラウェア大学での許可や承認は必要ありませんでした。

1. ひよこ視蓋へのGBM細胞注入

1. 注射用GSCおよびGBM細胞の調製
   1. GSC培地でGSCを培養する(表1)。GBM培地中でGBM細胞株を樹立した培養(表1)。
   2. プレート上の細胞を滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすぎ、1 mLのトリプシン溶液を10 cmディッシュに入れます。細胞が剥離し始めるまで、細胞培養インキュベーターに2〜3分間放置します。
   3. 10 mLの適切な血清含有培養培地を10 cmディッシュに加えてトリプシンを不活性化し、上下にピペッティングして細胞を剥離します。細胞懸濁液を15 mLの円錐形遠沈管に入れます。
   4. 800 × g で4°Cで5分間遠心分離することにより細胞をペレット化します。
   5. サイドアームフラスコおよび真空ポンプに取り付けられた使い捨ての微細ガラスピペットを使用して細胞ペレットから培地を吸引する。細胞を適切な増殖培地にマイクロリットルあたり10,000細胞の濃度まで再懸濁し、氷上のマイクロフュージチューブまたは小さなスクリュートップチューブに入れます。
   6. 細胞を少量の滅菌1%ファストグリーンFCF色素と混合します(5 μLの色素/100 μLの細胞懸濁液の比率を使用)。
2. OVOのE5視蓋へのGBM細胞の注入。補足図1を参照してください。
   1. 受精鶏卵を加湿卵インキュベーターで尖った端を下に向けて37.5°Cで孵化させます( 孵卵の1日目 は胚の0日目[E0]です)。インキュベーション(E5)の6日目に、70%エタノールをスプレーして卵殻を殺菌します。
   2. 卵キャンドラーを使用して、鉛筆で胚の上の空間の周囲に沿ってトレースし、輪郭を描かれた領域を透明なテープで覆います。
   3. 湾曲したハサミを使用して、胚膜や血管に切り込まないように注意しながら、トレース領域の周りをそっと切り、卵殻の上部を捨てます。
   4. 生理食塩水または細胞培養培地を数滴の空気空間膜に置き、容易に剥離するように濡らします。細かい鉗子を使用して、胚の上部に気空間膜を注意深く突き刺し、それを取り除き、ひよこ胚の頭を見つけます。
   5. 細かい鉗子を使用して、胚をすぐに囲む透明な羊膜をつかみ、視蓋に細胞を注入できるように頭を配置します。片手で細かい鉗子を使用して羊膜をつかみ、注射プロセス中に頭を所定の位置に保ちます。卵黄の絨毛尿膜の胚外血管を傷つけないように注意してください。
      注:上記の手順は、胚を密接に取り囲む透明な羊膜を効率的につかむことができるようにするために、ある程度の練習が必要です。細かい鉗子を使って、胚をすぐに囲む透明な羊膜をつかむ練習をします。
   6. 羊膜を細かい鉗子でつかんで頭をしっかりと保持します。ガラスマイクロピペットと空気圧ピコポンプを使用して、5 μLの適切な細胞培養培地中の約50,000個の細胞を視蓋に注入します(5 μLは充填マイクロピペットの約1/2です)。
      注:色素を混合したGBM細胞を注入したE5胚の画像については、Cretuら¹ を参照してください。
   7. 胚の上に50 mg / mLのアンピシリンを数滴置きます。
   8. 卵の上の穴を透明なテープで覆い、解剖のためにE15まで加湿器に入れます。

2. E15胚からの脳領域の解剖

注:ここでの固定のためのE15脳の解剖は、生きた脳スライスのステップ8.2で説明されているものと似ていますが、ここでの解剖は無菌条件下で行う必要はありません。

1. 殻の上部の周りのテープを切り取り、胚にアクセスできるようにします。
2. 首の胚を断頭し、滅菌カルシウムとマグネシウムを含まないタイロード(CMF Tyrode)溶液を入れた10cmの皿に頭を置きます。 補足図2を参照してください。
3. 細かい鉗子を使用して、脳を覆っている皮膚を剥がし、下にある硬膜を明らかにします。脳の左右にある形成中の頭蓋骨を取り除きます。形成する頭蓋骨はまだ脳の大部分を覆っていません。
4. 細かい先のとがった鉗子をそっと使って、脳の中心にある髄膜を引き裂き、両側に剥がして脳を明らかにします。
5. 湾曲した鉗子を使用して脳を下からすくい取り、そっと腔から引き出します。
6. 脳をその部分に解剖します:前脳、テクタ、小脳。
7. 細かい鉗子を使用して、上にある軟膜をテクタから取り除きます。軟膜はテクタから容易に分離するが、前脳や小脳からは分離しないことに注意してください。前脳に触れるか、ろ紙の上で転がして、前脳からピアを取り除きます。
8. 解剖した脳領域を小さな皿に入れます。
9. 固定する脳領域を24ウェルプレートウェルに入れ、0.1 Mカコジル酸ナトリウムバッファー中の2%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定します。4°Cで少なくとも24時間放置します。
10. 固定後、寒天に包埋する前に、少なくとも1時間にわたって3x PBSで組織をすすぎます。

3.収穫した脳領域の埋め込みとスライス

1. PBS中の3.5%寒天と8%スクロースの溶液を溶融するまで予熱し、融解温度に保ちます。
2. 湾曲した鉗子をスクープとして使用し、ニワトリ胚脳の視蓋または前脳領域のいずれかをそっと持ち上げ、ろ紙でわずかに吸い取って余分な液体を取り除き、寒天が外脳表面に付着するようにします。
3. 滅菌トランスファーピペットを使用して、型に寒天溶液を充填します。
   注意: 小さな長方形の金属振動組織スライサーブロックなど、適切なサイズのオブジェクトの周りにアルミホイルを形成することで、簡単な型を作成できます。
4. 脳領域を寒天に入れ、寒天を完全に固化させます。
5. 埋め込まれた脳の周りからアルミホイルを取り除き、かみそりの刃またはメスを使用して側面の周りの余分な寒天を切り取ります。
6. スライストレイのステンレス鋼の正方形にシアノアクリレート接着剤を一滴置き、脳付きのアガロースブロックを接着剤の上に置き、接着剤を1分間接着させます。トレイを振動組織スライサーチャックに入れ、締めて、寒天ブロックの上部を覆うのに十分なPBSをトレイに充填します。
7. スチール製のかみそりの刃を使用して、振動する組織スライサーで脳スライスを350μmの厚さで切断します。
8. 脳のスライスがカットされてスライストレイに自由に浮かぶので、ヘラを使用してスライスをすくい上げ、トレイから取り出します。セクションをスパチュラからそっとスライドさせ、PBSでラベル付けされた10cmのペトリ皿に入れて、セクションが自由に浮くようにします。
   注:脳スライスを囲む寒天は、埋め込む前に余分な液体を除去するために脳がろ紙で十分に吸い取られていない場合、剥離する可能性があります。これが発生した場合、脳組織は固化した寒天から穏やかに除去され、過剰な液体の適切な吸い取りの後に再埋め込まれます。

4.腫瘍細胞による脳スライスの免疫染色

1. 落射蛍光を備えた実体顕微鏡を使用して、腫瘍細胞の有無について10cmディッシュ内の個々のスライスを1つずつスクリーニングします。
2. 免疫染色のために0.1%Triton X-100および5%正常ヤギ血清(PBSTG)( 表1を参照)を含む十分な量のリン酸緩衝生理食塩水を調製し、免疫染色するスライスをすすぎます。
3. PBSで脳切片を染色するために使用される24ウェルプレートのウェルをハーフフィルします。
4. ヘラやメスの縁で脳スライスの周りの寒天の角を切り取り、PBSを含むウェルにそっと置きます。
5. PBSを吸引し、PBSTG中の350 μLの一次抗体染色溶液(例えば、PBSTG中の2 μg/mL UJ127)と交換します。
6. 穏やかな攪拌を伴う冷蔵室で24時間インキュベートし、スライスがウェル内で自由に動くのが見えるようにします。
7. 24時間後、一次抗体溶液を取り出し、攪拌しながら冷蔵室でPBSTGで3 x 1時間すすぎます。
8. すすぎが終了したら、PBSTG中の二次抗体染色溶液350 μL/ウェルでインキュベートします(例:PBSTG中のビオチンGAMの1/200希釈)。攪拌しながら冷蔵室で20時間インキュベートします。
   注:三次ステップを先に進め、このステップで蛍光色素含有二次抗体とともにインキュベートする場合は、インキュベーション中に光から保護するためにカバーしてから、ステップ4.11にスキップしてください。
9. 二次抗体溶液を取り出し、PBSTG中で撹拌しながら冷蔵室で3 x 1時間すすぎます。
10. PBSTGを除去し、三次溶液中でインキュベートします(例:PBSTG中のAlexa Fluor 647ストレプトアビジンの1:250希釈)。必要に応じて、このステップで0.1 μg/mLのビスベンズイミドを混合物に加えて核を染色します。攪拌しながら冷蔵室で20時間インキュベートします。
11. 三次溶液を取り出し、攪拌しながら冷蔵室でPBSTGで3 x 1時間すすぐ。
12. 顕微鏡スライドに取り付ける準備ができるまでPBSに入れたままにします。

5. 顕微鏡スライドへのスライスの取り付け

1. 取り付けるセクションと同じ数の顕微鏡スライドを準備します。
2. スライドごとに、厚さ10ミル(254μm)のビニール電気テープの長さ50 mmのストリップをパラフィルムの上に置きます。
3. 1 cm x 1 cmの正方形の穴あけパンチを使用して、電気テープとパラフィルムの中央に穴を開けます。
4. パラフィルムからテープを引き抜き、顕微鏡スライドの上に置き、スライドにテープにラベルを付けるスペースを残します。
5. マイクロピペットを使用して、電気テープの中央にある四角い穴に1〜2滴の退色防止封入剤を置きます。
6. 湾曲したスパチュラを使用して、目的の振動組織スライサーセクションをPBSTGから持ち上げ、清潔な実験室用ワイプまたはろ紙で水分を完全に逃がします。
7. スライスの端を封入剤の滴に触れ、別のヘラを使用してセクションを封入剤にそっとスライドさせます。
8. さらに数滴のマウンタントでセクションを覆い、セクションとマウンタントの上に24 mm x 30 mm(#1.5の厚さ)のカバーガラスを慎重に置きます。
9. カバーガラスの端をマニキュアでシールして、所定の位置に保ちます。

6. 固定脳スライスの共焦点顕微鏡

1. 広視野蛍光を使用して、適切な対物レンズとフィルターセットを使用して、マウントされた脳スライス内の蛍光腫瘍を見つけます。
   注:一部の腫瘍は非常に大きく、4倍の対物レンズで簡単に見ることができますが、単一細胞には10倍の対物レンズが必要になる場合があります。
2. 適切な対物レンズ、レーザー、ピンホールサイズ、および検出器設定を使用して共焦点顕微鏡に切り替えます。このプロトコルに従うには、ルーチンイメージングには20倍の対物レンズ(開口数[N.A.] = 0.75)、高解像度のイメージングには60倍の対物レンズ(N.A.= 1.40)を使用します。
3. 光学切片を取得するためのz軸とステップサイズの上限と下限を設定します(共焦点顕微鏡の製造元の指示に従って特定の状況に応じて)。光学セクションのZスタックを取得します。
4. 共焦点顕微鏡ソフトウェアを使用して、製造元の指示に従って腫瘍の3Dボリュームレンダリングを作成します。

7.スフェロイドの準備

1. ポリ(メタクリル酸2-ヒドロキシエチル)(ポリHEMA)プレートの作成
   1. 95%エタノール中の10 μg/mLポリHEMA溶液を作成し、35 mmペトリ皿(または細胞培養皿)を1 mLのこの溶液でコーティングします。
   2. 皿を室温で一晩カバーされていないロッカーに置いて、皿の表面のコーティングを開発します。
      注意: 溶媒は蒸発し、皿に半透明のコーティングを残し、不均一に見える場合がありますが、これは細胞スフェロイドを作る能力には影響しません。
   3. 乾燥後、開いた皿をバイオセーフティキャビネット内のUV光の下で1時間滅菌します。滅菌後は蓋を元に戻してください。これで、コーティングされた皿を使用する準備が整いました。
2. タイムラプス顕微鏡のための蛍光DiD染色
   注:このセクションは、スフェロイドの作成に使用するDiD蛍光色素で単一細胞を染色するためのものであり、ライブタイムラプスイメージングのための細胞運動性の視覚化を最適化します。
   1. 細胞を無血清培養培地に懸濁します。
   2. 5 μLのDiDストック/mLの細胞懸濁液を加え、ピペッティングで穏やかに混合します。37°Cで20分間インキュベートします。
   3. 標識細胞懸濁液を800 × g で5°Cで5分間遠心分離します。
   4. 上清を吸引し、細胞を温かい培地に再懸濁してすすぎます。
   5. この遠心分離とすすぎのステップをさらに2回繰り返します。
      注意: 必要に応じて、手順7.3.6にスキップして、このプロセスの直後にスフェロイドを作成します。
3. 細胞スフェロイドを作る
   1. 0.25%トリプシン/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液を37°Cに温めます。
   2. GSC培地¹⁷(表1)でGSCを培養し、U-118悪性グロイマ(MG)細胞をU-118培地(表1参照)で培養する。スフェロイドの35 mmプレート1枚を準備するために、コンフルエントな10 cmディッシュを使用します。bFGF(最終濃度10 ng/mL)およびTGF-α(最終濃度20 ng/mL)成長因子を最初にGSCに追加し、その後3日ごとに追加します。
      注:現在の研究で使用された細胞は、緑色のGSC15-2 / K72、緑色のGSC16-4 / K72、赤色のU-118 / L1LE / mCherry2x、および赤色のU-118 / 1879 / mCherry2xでした。スフェロイドの1プレートは、メンブレンインサート上の脳スライスの2つの6ウェルプレートに十分なはずです。
   3. プレート上の細胞を滅菌PBSですすぎ、1 mLのトリプシン溶液を10 cmの皿に置きます。細胞が剥離し始めるまで2〜3分間細胞培養インキュベーターに入れます。
   4. 10 mLの適切な血清含有培養培地を10 cmディッシュに加えてトリプシンを不活性化し、上下にピペッティングして細胞を剥離します。細胞懸濁液を15 mLの円錐形遠沈管に入れます。
   5. 800 × g で4°Cで5分間遠心分離することにより細胞をペレット化します。
   6. 細胞ペレットから培地を吸引し、細胞を10 mLの培地に再懸濁します。
   7. 各35 mmポリHEMAコーティングディッシュに2 mLの細胞懸濁液を置き、さらに2 mLの適切な培地を加えて、ディッシュあたり4 mLの合計培地を取得します。GSCを使用する場合は、成長因子を追加します。
   8. 凝集体が100〜200μmのサイズに達するまで細胞をインキュベートし、これは播種された細胞の密度に応じて1〜2日であり得る。

8.生きたひよこ胚脳解剖と 振動組織スライサースライス

1. 解剖の準備
   1. メンブレンインサートの下に1 mLの脳スライス培養培地( 表1を参照)を入れた6ウェルポリエステルメンブレンインサートプレートを準備します。
   2. 作業領域とツールを70%エタノールで滅菌します。
   3. 解剖中に6ウェルインサートプレートを氷上に置きます。
   4. 100 mLの振動組織スライサースライスメディア(表1)を準備し、氷上に置きます。
   5. PBS中の4%低メルトアガロースのバイアルを、液体(約50°C)に溶けるまで水浴に入れます。
   6. 振動するティッシュスライサータブを氷で満たします。
2. 無菌E14/15ひよこ胚脳解剖
   1. 卵キャンドラーを使用して、E14またはE15胚の上のエアポケットの周囲に沿って鉛筆でトレースし、輪郭を描かれた領域を透明なテープで覆います。
   2. 湾曲したハサミや細かいハサミを使って、胚の膜や血管に切り込まないように注意しながら、トレースした部分の周りをそっと切り、一番上の殻を捨てます。
   3. 湾曲した鉗子を使用して、胚の上部にある空間膜を取り除き、ひよこ胚の頭を見つけます。
   4. 胚を断頭し、冷たい滅菌CMF溶液を入れた10 cmの皿に頭を置きます。 補足図2を参照してください。
   5. 滅菌済みの細かい鉗子を使用して、脳を覆っている皮膚を剥がして、下にある硬膜を明らかにします。脳の左右にある形成中の頭蓋骨を取り除きます。形成する頭蓋骨はまだ脳の大部分を覆っていません。
   6. 細かい先のとがった鉗子(#5または#55)をそっと使用して、脳の中心にある髄膜を引き裂き、両側に剥がして脳を明らかにします。
   7. 細かい湾曲した鉗子を使用して、脳を前面の下からすくい上げ、そっと空洞から引き出します。
   8. 脳を前脳、中脳(視神経蓋)、小脳の3つの主要部分に解剖します。必要に応じて、ひよこの発達のアトラスを参照してください。
   9. 細かい鉗子を使用して、上にある軟膜をテクタから取り除きます。
      注:ピアはテクタから簡単に分離しますが、前脳や小脳からは分離しません。軟膜は、それに触れるか、滅菌ガーゼ上で転がすことによって前脳から取り除くことができる。
   10. 解剖した脳領域を氷の上の小さな滅菌皿に入れます。
3. 脳の埋め込みとスライス
   1. 湾曲した鉗子をスクープとして使用し、視蓋または前脳領域のいずれかをそっと持ち上げ、滅菌ガーゼでわずかに吸い取って余分な液体を取り除き、アガロースが外脳表面に確実に付着するようにします。
   2. 滅菌トランスファーピペットを使用して、金型に低溶融アガロースを充填します。適切なサイズの物体の周りにアルミホイルを形成して、簡単な型を準備します。小さな長方形の金属振動組織スライサーブロックは、オブジェクトとして日常的に使用されます。 補足図3を参照してください。
   3. 脳領域をアガロースにすばやく置き、氷上で固化させます(約4〜5分)。
      注:アガロースが硬化する前に、脳が型の底に沈むことがあります。これが発生した場合は、寒天が固まり始めるまで1分待ってから、脳領域をアガロースに配置します。アガロースの真ん中で脳領域を直接吊り下げてみてください。
   4. 固化したアガロースに埋め込まれた脳の周りからアルミホイルを取り除き、滅菌かみそりの刃またはメスを使用して側面の周りの余分なアガロースを切り取ります。
   5. スライス皿/トレイのステンレス鋼の正方形にシアノアクリレート接着剤を一滴置き、アガロースブロックを脳に置き、接着剤を1分間接着させます。皿/トレイを振動ティッシュスライサーチャックに入れ、締めて、トレイにスライスメディアを充填して、アガロースブロックの上部を覆います。
   6. サファイアナイフを使用して、振動組織スライサーの切片を250〜350μmで切断しますが、これは鋼製のかみそりの刃よりも生きた組織の損傷が少ないことが報告されています。
   7. 脳のスライスがカットされ、スライストレイに自由に浮かぶので、滅菌ヘラを使用してスライスをすくい上げ、トレイから取り出します。別の滅菌ヘラを使用して、セクションをスパチュラからメンブレンインサートにそっとスライドさせます。
      注:通常、必要に応じて、2つまたは3つの脳スライスを各メンブレンインサートに配置できます。脳スライスを囲むアガロースは、脳が余分な液体を除去するために滅菌ガーゼで十分に吸い取られていない場合、剥離する可能性があります。包埋する前に十分なブロッティングを行ってもこれが発生する場合は、周囲のアガロースを含まないスライスをそっと持ち上げ、メンブレンインサートにスライドさせます。
   8. 脳スライスの6ウェルプレートを、37°Cおよび5%_CO2の細胞培養インキュベーター内のメンブレンインサート上に置きます。
   9. めっきの翌日、滅菌パスツールピペットを使用して、インサートの下から培地を吸引します(ピペットが下の培地にアクセスできるように、インサートの側面に隙間があります)。メンブレンインサートの下の各ウェルに1 mLの新鮮なスライス培地を追加します。その後も1日おきにメディアを交換してください。
   10. 脳スライスがメンブレンインサートにしっかりと付着し、やや平らになっているように見えるまで数日待ちます。これは、スライスが実行可能であり、GBM細胞の導入の準備ができていることを示しています。

9.脳スライスへのGBM細胞の導入

1. 回転楕円体法
   1. 細胞スフェロイドのサイズが150〜200 μmに達したら、5 μLに設定した20 μLマイクロピペットを使用して、培養皿から1〜数個のスフェロイドを除去します。 補足図3を参照してください。
   2. スフェロイドを含むメディアを目的の脳スライスに静かに排出します。
      注意: 細胞スフェロイドはピペットチップに表示されているはずです。透明なピペットチップを使用すると、チップで見やすくなります。液体が放出されたときにスフェロイドが脳スライスから落ちる場合は、薄い木製のアプリケータースティックに接着されたエタノール滅菌まつげを使用して、スフェロイドを脳スライスにそっと押し戻す必要があります。
   3. スフェロイドを脳スライス上で2〜5日間培養します。
      注:ここでの制限は、スライス内の血管と脳細胞の最終的な劣化であるように思われます。分解された血管は、ラミニンで染色されると、スライスに不連続なボールとして表示されます。
2. 生検パンチ法
   1. メンブレンインサート上で平らに見えるようにして、脳スライスを付着させます(培養には2〜5日かかる場合があります)。
   2. 細胞マトリックスを氷上で解凍します。
   3. 細胞培養バイオセーフティキャビネットで、直径1mmの滅菌生検パンチを真空アスピレーターチューブに接続します。
   4. 生検パンチで脳スライスにそっと触れ、脳スライスの中央に1mmの穴を開けます。
      注:生検パンチの組織は、真空によってパンチに吸引されます。
   5. 60%〜70%コンフルエントな10 cmディッシュの細胞をトリプシン処理し、10 mLの培地に再懸濁することにより、細胞マトリックス懸濁液を調製します。次に、その懸濁液1 mLを100 μLのマトリックスと混合します。
   6. 20 μLのマイクロピペットを使用して、1 μLの細胞マトリックス混合物を脳スライスの各穴に入れます。
   7. 細胞混合物の配置が終了したら、細胞が埋め込まれた脳スライスの皿をインキュベーターに戻し、マトリックスが固化し、細胞が周囲の脳スライスに侵入する可能性があります。

10. 広視野蛍光タイムラプス顕微鏡

1. メディアの蒸発を防ぐために、6ウェルプレートの端の周りに取り外し可能なテープを置き、ガス交換のために片側に小さな隙間を残します。
2. プレートを、倒立落射蛍光顕微鏡上の調整可能な自動ステージ上のカスタマイズされた培養チャンバーに置きます。
   注:チャンバーは、ガスインジェクションコントローラーを使用して5%_CO2 および95%空気の大気条件に保たれ、温度は温風温度コントローラーと温度制御されたステージインサートを使用して37°Cに維持されました。ここで使用されているシステムの詳細については、Fotos et ^al.18 を参照してください。
3. 適切な顕微鏡制御ソフトウェアを使用して、10分ごとに20時間、関心のある領域の蛍光画像を収集するタイムラプス取得スケジュールを作成します。
   注:緑色蛍光標識が細胞(緑色蛍光タンパク質[GFP]など)で使用されている場合は、光毒性を防ぐために、細胞を視覚化するために必要な最小限の青色励起光を使用してください。赤(mCherryなど)および遠赤(DiDなど)のラベルには、波長励起が長いため、この潜在的な問題はないようです。

11.タイムラプス顕微鏡後の脳スライスの免疫染色

注:この免疫染色プロトコルは、血管をラミニンで、核をビスベンズイミドで染色するために最適化されています。目的の分子に適した抗体を使用してください。

1. パスツールピペットを使用してメンブレンインサートの下から培地を吸引し、インサートの下の0.1 Mカコジル酸ナトリウムバッファーに1 mLの2%PFAを置き、インサートの上部に1 mLを入れて脳スライスを覆います。スライスを4°Cで一晩固定します。
2. メンブレンインサートの下から固定液を取り除き、脳スライスに残っている固定液を取り除きます(固定液はメンブレンインサートから下のウェルに漏れる傾向があります)。
3. 35 mmウェルからスライスしたインサートを取り出し、より大きなプラスチック皿に入れます。
4. 350 μLのPBSを脳スライスと同じ数のウェル(免疫染色時に1つのスライス/ウェル)に加えて、24ウェルプレートを調製します。
   1. 薄いヘラを使用して、脳スライスをメンブレンインサートから外さずに、脳スライスの周りからアガロースをそっと取り除きます。アガロースが脳スライスの外縁から簡単に外れることを確認してください。そうでない場合は、アガロースを脳スライスに付着したままにします。
   2. 鋭利なメスを使用して、下にある膜のあるスライスがインサートの残りの部分からなくなるまで、脳スライスの周りの膜を切り取ります。脳スライスが付着したメンブレンをピックアップし、細かい鉗子を使用してメンブレンをつかみ、PBSの24ウェルプレートのウェルに入れます。
5. スライスがウェル内を移動するように、冷蔵室で1時間以上PBSでスライスを3回すすぎます。
6. すすぎながら、一次抗体溶液を調製する。
   1. 抗ラミニンをPBSTGで2 μg / mLに希釈します( 表1を参照)。
7. PBSをウェルから取り出し、低温室で一次抗体溶液中で穏やかに攪拌しながら一晩インキュベートします。
8. 少なくとも20時間のインキュベーション後、一次抗体溶液を吸引し、切片をPBSTGで3倍に1時間すすぎます。
9. すすぎながら、二次抗体溶液を調製する。
   1. 蛍光GAMをPBSTGで1:200に希釈するために必要な特定の蛍光色素で希釈し、0.1 μg/mL濃度のビスベンズイミドとともに希釈します。
   2. PBSTGを除去し、蛍光二次抗体溶液を撹拌しながら冷蔵室で一晩インキュベートします。
   3. 二次抗体を除去し、PBSTGで1時間かけて2回、PBSで1時間かけて1回すすぎます。
   4. 顕微鏡スライド(セクション5)とビューに取り付ける準備ができるまで、PBSに残しておきます。

ディスカッション

中脳(視蓋)脳室に細胞を注入するためのプロトコルの重要なステップには、卵子の脈絡膜の血管を損傷しないこと、または注射前および注射中に胚を囲むことが含まれますが、胚のすぐ周囲の羊膜は穏やかに引っ張って保持することができます細胞を中脳に注入するときに頭を配置します。羊膜は比較的丈夫で、細かい鉗子で引っ張って頭を配置し、片手でしっかりと保持し、もう一方の手で脳の中央にある大きくて丸い構造である視蓋に細胞を注入することができます。一般に、注入された胚の生存率は、未知の要因に応じて25%から75%の範囲であり、生存する事実上すべての胚は、視蓋に少なくとも小さな腫瘍を含んでいます。生存可能な脳スライスを生成するための重要なステップには、スライス中にアガロースが脳に付着し、メンブレンインサートに配置されるまで組織とスライスを冷たく保つために、過剰な液体の組織を吸い取ることが含まれます。細胞タイプが異なればスフェロイドの形成速度とサイズも異なるため、poly-HEMAプレート上のメッキ細胞密度とスフェロイドを採取するまでの時間は、細胞タイプごとに最適化する必要があります。

ここでの研究は、脳スライスの生存率に関する正式な縦断的研究の対象となっていません。Yangらは、ここで用いたものと同様のニワトリ胚脳スライス培養物を使用し、少なくとも7日間、スライスの良好な生存率を示した¹⁶。以前の研究では、OT組織を最適ではない培地に保持すると、多くのピノティック核が組織に出現したことが示されましたが、これはここでの研究のスライスでは発生しませんでした。さらに、スライスが最適でない条件で変性すると、血管が断片化し、ラミニン陽性球の列として現れる(図示せず)。したがって、ここでの生存率は電気生理学や活性カスパーゼ-3発現などの方法では確認されていませんが、最適ではない培養条件下で見られた細胞死の指標はここには現れませんでした。

OTは、最大の心室を備えた最も注入しやすい領域であるため、in vivo脳腫瘍実験に焦点を当ててきました。胚が卵黄の上にアクセスできるほど小さい最新の日であるE5では、すべての脳領域が薄い心室ゾーンにすぎないため、脳室に注射を行う必要があります。それにもかかわらず、これらの注射は、脳実質に浸潤する細胞を有する埋め込み腫瘍を首尾よくもたらす。時々、結果として生じる腫瘍は前脳または小脳に見られますが、これは一般的ではありません。E15視蓋のエクスビボスライスは、主にここでの実験に使用されてきたため、エクスビボ共培養の結果はインビボ注射実験と相関させることができます。ただし、前脳スライスも適しており、視蓋と比較して表面積が大きく、心室が非常に薄いため、前脳はin vivo注射と相関していないex vivo共培養により適している可能性があります。

ここでは、 in vivo 注射、組織固定、振動組織スライサー切片、ラミニンやその他のマーカーの免疫染色を行うと、血管に近接した脳組織中のGBM細胞とGSCの高解像度画像が得られることが実証されています。腫瘍細胞と血管の相互関係を決定する機能は、共焦点ソフトウェアと製造元の指示を使用して共焦点光学切片のzスタックから3Dボリュームレンダリングを作成することによって大幅に促進されました。GFP、mCherry、およびDiD標識細胞の広視野蛍光顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングが可能でした。しかし、高蛍光スフェロイドに近接していた遊走細胞は、スフェロイドからの「輝き」によって不明瞭になることがありました。この望ましくない影響は、広視野画像を収集するための露光時間を慎重に調整することで、いくらか最小限に抑えることができます。共焦点Zスタックを用いた経時的なタイムラプスイメージング(4D)により、スフェロイドから焦点が合っていない輝きがなくなり、暗い背景で移動する細胞が鮮明に定義されました。これはプロトコルには記載されていませんでしたが、脳スライスが6ウェルプラスチックプレートの透明なメンブレンインサート上にある間に実行された広視野タイムラプスイメージングと同様に実行されました。共焦点タイムラプスイメージングは、個々の細胞とその挙動の著しく鮮明な画像をもたらしますが、10 z平面/点のzスタックを20時間にわたって10分間隔で収集するマルチポイントタイムラプス実験は、スキャンヘッド検流計の広範な使用です。これにより検流計の寿命が大幅に短くなる可能性があるため、この方法は慎重に使用されます。

ニワトリ胚系は、GBM細胞の挙動を調べるin vivo注射およびex vivo共培養実験の両方に非常に適していますが、このモデル系にはいくつかの制限があります。他の異種移植システムと同様に、ヒト細胞が移植される環境はヒトの脳ではありませんが、GBM細胞の挙動はげっ歯類モデルおよびヒト患者の挙動を模倣しているように見えます。E5でin vivo注射実験を行った後、腫瘍は通常、E15まで10日間形成されます。これは明らかに、腫瘍形成と細胞浸潤のすべての側面を研究するのに十分な時間ではありません。しかし、ここでは、固形腫瘍が脳実質に形成され、細胞が腫瘍内で相互作用して再編成され、この比較的短い期間内に血管に沿ってびまん性に重大な脳浸潤が発生することが実証されています。in vivoニワトリ胚系に対する別の制限は、ニワトリ胚発生中に作動する大きな卵黄および胚外循環系のために、薬物または他の治療に適さないことである。局所液体薬物治療は、胚からはるかに大きな卵黄塊への拡散のために、脳内の非常に変動した未知の濃度をもたらすであろう。同様に、非常に繊細な胚外循環系への薬物の静脈内注射は、血管から漏れたり拡散したりし、脳内の濃度が不明になります。これがex vivoスライス培養法が採用された主な理由の1つであり、タイムラプス顕微鏡で細胞の挙動を観察および追跡できるだけでなく、ディッシュ⁴でGBM細胞の挙動を変えることに成功した治療をより適切な脳組織環境でテストできるようにしました。

ニワトリ胚同所性脳腫瘍モデルシステムの開発は、GBM腫瘍形成および浸潤性細胞挙動の研究に利用可能なシステムおよびツールへの重要な追加と見なされている。受精鶏卵はほとんどの地域で容易に入手できる可能性が高く、げっ歯類に比べて安価であり、動物の世話費用がなく、胚は非常に弾力性があり、感染に耐性があり(つまり、ほとんどの作業はベンチトップで行われます)、胚は非常に操作可能であり、殻のない培養で成長することができます¹⁹、およびニワトリの胚は脊椎動物とは見なされないため、NIHガイドラインによるIACUCの承認を必要としません(制度上の要件異なる場合があります)。したがって、これらの複数の利点は、質問や実験をその制限内にあるものに限定する場合、ニワトリ胚システムを非常に魅力的にします。複数のGBM細胞研究がニワトリ胚を用いて他の人によって行われているが、これらはほぼ独占的に胚20、21^、22、23、24、25、^26、27、^28、29および四肢芽³⁰の絨毛尿膜(CAM)を利用している。、そして脳ではありません。E2³¹に髄芽腫をニワトリの脳に移植した報告もあります。間違いなく、ここで説明したように、同所性異種移植片モデルシステムとしてのニワトリ胚の使用は、CAMを使用した研究よりもヒトGBM腫瘍生物学にとってはるかに意味のある結果をもたらすはずです。

これらの研究は、ヒトGBM細胞とGSCの挙動の研究にニワトリ胚脳腫瘍モデルシステムを十分に活用し始めたばかりですが、他の研究が用途を拡大し、さらなる潜在的なアプリケーションを見つけることが期待されています。このシステムは、GBM腫瘍の形成と細胞の挙動を制御するメカニズムを明らかにするだけでなく、特定の患者の細胞に対する特定の薬物や物質の前臨床試験を可能にすることが想像できます。例えば、脳スライス培養が事前に設定されていれば、腫瘍細胞、外科的腫瘍切除からの断片、または患者由来のGBMオルガノイド³² を ex vivo 共培養に直接配置することができ、さまざまな治療法を数日で評価することができます。同様に、解離した患者細胞を ovoの E5中脳に直接注入して、腫瘍を形成して脳実質に浸潤する能力を評価することができます。したがって、ここでの方法と代表的な結果の説明が、脳腫瘍研究のためのこの非常に十分に活用されていないシステムの使用の増加を促進し、奨励することが期待されています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cm x 1 cm square hole paper punch	Birabira	N/A
1 mm biopsy punch pen	Robbins Instruments	20335
6 well insert plate (Corning Transwell)	Millipore Sigma	CLS3450
9" Disposable Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20C
15 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-12
24 well plate	Corning Costar	3526
50 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-9
Agar	Fisher BioReagents	BP1423-500	for embedding fixed brains
Alexafluor 488-conjugated GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-605-146
Alexafluor 647-conjugated GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-146
Aluminum foil	ReynoldsWrap	N/A
Ampicillin	Sigma Aldrich	A-9518
anti-integrin alpha-6 monoclonal antibody GOH3	Santa Cruz Biotechnology	sc-19622
anti-L1CAM monoclonal antibody UJ127	Santa Cruz Biotechnology	sc-53386
anti-laminin monoclonal antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	3H11
anti-nestin monoclonal antibody 10c2	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
anti-Sox2 monoclonal antibody E-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
B27 supplement without vitamin A	GIBCO	17504-044
bisbenzimide (Hoechst 33258)	Sigma-Aldrich	B2883	nuclear stain
Cell culture incubator	Forma		standard humidified CO2 incubator
Centrifuge	Beckman Coulter
Confocal microscope	Nikon Instruments	C2si+	With custom-made cell incubator chamber
Confocal microscope objective lenses	Nikon Instruments		Plan Apo lenses, except S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA objective lens for confocal time-lapse imaging
Confocal microscope software	Nikon Instruments	NIS Elements	Version 5.2
Curved foreceps	World Precision Intruments	504478
Curved scissors	Fine Science Tools
Curved spatula	Fisher Scientific	14-375-20
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue	KG-585 12R
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270
DiD far red fluorescent dye	Invitrogen	V22887	Vybrant DiD
DMEM	Sigma Aldrich	D5671
DMEM/F12	Sigma Aldrich	D8437
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-1L
egg incubator	Humidaire
electrical tape (10 mil thick/254 µm)	Scotch	N/A
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories	2701
Fast green FCF dye	Avocado Research Chemicals	16520
FBS	Gemini Bio-products	900-108
filter paper	Fisher Scientific
Gauze	Dynarex	3353
Glass Capillaries for microinjection	World Precision Instruments	TW100-4
Glycerol	Fisher BioReagents	BP228-1	for mounting media
GSCs (human glioblastoma stem cells)	Not applicable		Isolated from patient GBM specimens in Galileo laboratory in GSC media and then transduced with a GFP encoding lentiviral vector.  Cells used were between passage 10 and 30.
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-020-CV
Hemacytometer	Hausser scientific
Heparin	Fisher Scientific	BP2524-100
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H0887
Horse Serum (HI)	Gibco	26050-088
Human FGF-2	BioVision	4037-1000
Human TGF-α	BioVision	4339-1000
Inverted phase contrast microscope	Nikon Instruments	TMS	for routine viewing of cultured cells
KCl	Fisher Scientific	BP366
KH2PO4	Fisher Scientific	P284
Laboratory film	Parafilm
Labquake Shaker	LabIndustries	T400-110
L-Glut:Pen:Strep	Gemini Bio-products	400-110
Low-melt agarose	Fisher Scientific	BP1360	for embedding live brains
Matrix	Corning Matrigel	354234
Medium 199	GIBCO	11150-059
MEM	Corning	10-010-CV
Metal vibratome block
Micropipette tips (20, 200, 1,000 µL)	Fisherbrand
Micropipettors (20, 200, 1,000 µL)	Gilson
Microscope Coverglass (no. 1.5 thickness)	Fisherbrand	12544A
NaCl	Fisher Scientific	S271
NaH2PO4 + H2O	Fisher Scientific	S369
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
Normal goat serum	Millipore Sigma	526-M
N-propyl gallate	Sigma Aldrich	P3130	for mounting media
Parafilm	Parafilm
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS	Sigma Aldrich	P5493-1L
Pencil
Plain Microscope slides	Fisherbrand	12-550-A3
Plastic 35 mm Petri dish	Becton Dickinson	351008
pneumatic picopump	World Precision Intruments	PV830
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)  (poly-HEMA)	Sigma Aldrich	P-3932
razor blade- double edge	PACE		for cutting fixed brain slices
sapphire knife	Delaware Diamond Knives		for cutting live brain slices
Scalpel	TruMed	1001
Sodium cacodylate buffer 0.2 M pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11652
Specimen chamber for vibratome	custom-made
Stereo Dissecting Microscope	Nikon Instruments	SMZ1500	Equipped with epifluorescence
straight foreceps	World Precision Intruments	500233
straight scissors	Fine Science Tools
Sucrose	Mallinckrodt	7723
Time-lapse fluorescence microscope (widefield fluorescence)	Nikon Instruments	TE2000-E	With custom-made cell incubator chamber (see Fotos et al., 2006)
Tissue culture dish polystyrene 100 mm	Thermo Fisher Scientific	130182	for cell culturing
Tissue culture dish polystyrene 60 mm	Becton Dickinson	353004	for cell culturing
Transfer pipette	American Central Scientific Co.	FFP011
Transparent tape	Scotch
Triton X-100	Sigma Aldrich	T-8787
Trypsin (0.25%) + 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
U-118 MG human GBM cell line	ATCC	HTB-15	Cells were transduced with a lentiviral vector encoding the entire ectodomain sequence of the L1CAM adhesion protein and then with lentiviral vector pUltra-hot encoding mCherry.  Passage numbers are unknown.
Vacuum pump	Cole-Parmer	EW-07532-40	"Air Cadet"
Vibrating tissue slicer	Vibratome	3000	for cutting live and fixed brain slices