Utilizzo del cervello dell'embrione di pulcino come modello per analisi in vivo ed ex vivo del comportamento delle cellule di glioblastoma umano

Riepilogo

Gli embrioni di pulcino sono utilizzati per studiare i tumori cerebrali del glioblastoma umano (GBM) in ovo e in co-colture di fette cerebrali ex vivo. Il comportamento delle cellule GBM può essere registrato mediante microscopia time-lapse in co-colture ex vivo, ed entrambi i preparati possono essere analizzati all'endpoint sperimentale mediante analisi confocale 3D dettagliata.

Abstract

L'embrione di pulcino è stato un sistema modello ideale per lo studio dello sviluppo dei vertebrati, in particolare per le manipolazioni sperimentali. L'uso dell'embrione di pulcino è stato esteso per studiare la formazione di tumori cerebrali di glioblastoma umano (GBM) in vivo e l'invasività delle cellule tumorali nel tessuto cerebrale circostante. I tumori GBM possono essere formati mediante iniezione di una sospensione di cellule marcate fluorescentmente nel ventricolo del mesencefalo E5 (tectum ottico) in ovo.

A seconda delle cellule GBM, i tumori compatti si formano casualmente nel ventricolo e all'interno della parete cerebrale e gruppi di cellule invadono il tessuto della parete cerebrale. Sezioni di tessuto spesso (350 μm) di tecta fissa E15 con tumori possono essere immunocolorate per rivelare che le cellule invasori spesso migrano lungo i vasi sanguigni quando analizzate dalla ricostruzione 3D di immagini confocali z-stack. Le fette vive di mesencefalo e proencefalo E15 (250-350 μm) possono essere coltivate su inserti di membrana, dove le cellule GBM marcate con fluorescenza possono essere introdotte in posizioni non casuali per fornire co-colture ex vivo per analizzare l'invasione cellulare, che può anche verificarsi lungo i vasi sanguigni, per un periodo di circa 1 settimana. Queste co-colture ex vivo possono essere monitorate mediante microscopia time-lapse a fluorescenza a campo largo o confocale per osservare il comportamento delle cellule vive.

Le fette co-coltivate possono quindi essere fissate, immunocolorate e analizzate al microscopio confocale per determinare se l'invasione si è verificata o meno lungo i vasi sanguigni o gli assoni. Inoltre, il sistema di co-coltura può essere utilizzato per studiare potenziali interazioni cellula-cellula posizionando aggregati di diversi tipi e colori cellulari in diverse posizioni precise e osservando i movimenti cellulari. I trattamenti farmacologici possono essere eseguiti su colture ex vivo , mentre questi trattamenti non sono compatibili con il sistema in ovo . Questi due approcci complementari consentono analisi dettagliate e precise del comportamento delle cellule GBM umane e della formazione del tumore in un ambiente cerebrale vertebrato altamente manipolabile.

Introduzione

Gli studi in vitro sui comportamenti delle cellule tumorali sono spesso utilizzati per analizzare i potenziali meccanismi che operano durante il comportamento più complesso che si osserva durante la formazione del tumore e l'invasione cellulare nei modelli di xenotrapianto in vivo. Ad esempio, con il glioblastoma (GBM), studi in vitro hanno scoperto meccanismi di come L1CAM opera potenzialmente durante la formazione del tumore e l'invasione cerebrale in un nuovo modello di tumore cerebrale xenotrapianto di embrione di pulcino 1,2,3,4,5. Sebbene gli esperimenti in vitro e in vivo si completino a vicenda in modi utili, lasciano una lacuna sostanziale nel modo in cui i risultati possono essere correlati. Ad esempio, le analisi meccanicistiche della motilità delle cellule GBM su un piatto sono una situazione altamente artificiale e i modelli di xenotrapianto in vivo possono rivelare solo analisi statiche del punto temporale o dell'endpoint della formazione del tumore e del comportamento cellulare. Gli studi in vivo che utilizzano embrioni di roditori o pulcini non si prestano facilmente al monitoraggio del comportamento cellulare mentre le cellule invadono il tessuto cerebrale in questi modelli di xenotrapianto. Tuttavia, il modello di xenotrapianto di embrioni di pulcino ha dimostrato che la proteina di adesione L1CAM svolge un ruolo stimolante nella capacità invasiva delle cellule umane T98G GBM ^2,5.

Una soluzione adeguata a questo problema può essere raggiunta collegando metodi sia in vivo che in vitro utilizzando un modello organotipico di coltura di fette di cervello, indicato come modello ex vivo . In questo modello ex vivo, il tessuto cerebrale vivo può essere mantenuto a uno spessore di diverse centinaia di micron per un massimo di alcune settimane, rendendo possibile l'impianto di cellule tumorali, osservare il loro comportamento nel tessuto reale nel tempo e quindi eseguire un'analisi dei marcatori più dettagliata all'endpoint dell'esperimento.

Un popolare metodo di coltura organotipica è stato quello di coltivare una fetta di cervello spessa diverse centinaia di micron sopra una membrana porosa traslucida o trasparente, lasciando il tessuto esposto all'aria, ma consentendo ai mezzi nutritivi di sostenere il tessuto da sotto la membrana (fare riferimento a Stoppini et ^al.6). Diverse varianti di questo metodo sono state utilizzate per diversi studi, incluso l'utilizzo di diversi mezzi o diversi inserti di membrana. Diversi inserti di membrana includono un inserto a membrana poroso (0,4 μm) di diametro 30 mm in un piatto di coltura da 35 mm 6 e inserti di coltura cellulare (0,4 μm) per piastre a⁶ pozzetti⁷. Diversi mezzi includono 50% MEM / HEPES + 25% siero di cavallo inattivato dal calore + 25% di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)⁸, 50% di media sierici ridotti + 25% di siero di cavallo + 25% di HBSS⁹, così come altri. Se viene utilizzata una membrana traslucida o trasparente insieme a cellule GBM marcate con fluorescenza, tali colture possono essere visualizzate dal basso utilizzando un microscopio a fluorescenza a campo largo invertito o confocale 10,11,12,13,14,15.

Mentre molti modelli di xenotrapianto di tumore cerebrale ortotopico in vivo e di coltura di fette di cervello organotipiche ex vivo sono stati stabiliti utilizzando roditori, come citato sopra, l'embrione di pulcino (Gallus gallus) è stato sottoutilizzato per questi scopi. Tuttavia, è stato dimostrato che l'embrione di pulcino può essere utilizzato come modello di xenotrapianto ortotopico in vivo per lo studio dell'invasione del glioma sia umano che di ratto ^1,2,5. Le cellule xenotrapiantate nel cervello di embrioni di pulcino hanno mostrato modelli di invasione simili a quelli osservati nei modelli di roditori, supportando ulteriormente l'uso di embrioni di pulcino come modello in vivo per l'analisi delle cellule tumorali GBM. Gli embrioni di pulcino sono anche poco costosi, possono essere mantenuti più facilmente dei roditori (cioè nei loro gusci d'uovo in un incubatore di laboratorio) e sono molto più facili da lavorare, rendendoli un'opzione attraente per studi GBM in vivo a breve termine. Un recente articolo ha descritto l'uso di colture di fette di cervello di embrione di pulcino per la formazione e la crescita degli assoni durante il normale sviluppo del cervello in cui le fette erano vitali per almeno 7 giorni¹⁶. Tuttavia, manca l'uso di tali colture di fette di cervello di embrione di pulcino per l'analisi ex vivo del comportamento delle cellule GBM in un ambiente tissutale. In questo articolo, sono descritti sia il trapianto di cellule GBM umane e cellule staminali GBM (GSC) nel cervello precoce dell'embrione di pulcino in vivo, sia l'introduzione di cellule GBM su colture di cellule di cervello di embrioni di pulcino vivo ex vivo. Vengono inoltre forniti alcuni esempi rappresentativi dei tumori risultanti e dei modelli di invasione cellulare ottenuti da questi preparati.

Protocollo

Non era necessaria alcuna autorizzazione o approvazione presso l'Università del Delaware per svolgere questo lavoro.

1. Iniezione di cellule GBM nel tectum ottico del pulcino

1. Preparazione di GSC e cellule GBM per l'iniezione
   1. Cultura SGC nei media dell'SGC (tabella 1). Linee cellulari GBM stabilite dalla coltura nei terreni GBM (Tabella 1).
   2. Risciacquare le cellule su piastre con soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) e introdurre 1 mL di soluzione di tripsina in un piatto da 10 cm. Lasciare in un incubatore di coltura cellulare per 2-3 minuti fino a quando le cellule iniziano a staccarsi.
   3. Inattivare la tripsina aggiungendo 10 ml di terreno di coltura appropriato contenente siero nel piatto da 10 cm e staccare le cellule pipettando su e giù. Inserire la sospensione cellulare in una provetta conica da centrifuga da 15 ml.
   4. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 800 × g per 5 minuti a 4 °C.
   5. Aspirare il fluido dal pellet cellulare utilizzando una pipetta di vetro fine monouso collegata a un pallone a braccio laterale e a una pompa per vuoto. Risospendere le cellule in terreni di crescita appropriati ad una concentrazione di 10.000 cellule per microlitro e metterle in un tubo di microfuge o in un piccolo tubo a vite sul ghiaccio.
   6. Mescolare le cellule con una piccola quantità di colorante FCF Fast Green sterile all'1% (utilizzare un rapporto di 5 μL di colorante / 100 μL di sospensione cellulare).
2. Iniezione di cellule GBM nel tectum ottico E5 in ovo. Cfr. figura supplementare 1.
   1. Incubare le uova di gallina fecondate in un'incubatrice umidificata, con l'estremità appuntita rivolta verso il basso, a 37,5 °C (il 1° giorno di incubazione è embrionale giorno 0 [E0]). Il 6 ° giorno di incubazione (E5), sterilizzare il guscio d'uovo spruzzando con etanolo al 70%.
   2. Usando un candelabro per uova, traccia lungo il perimetro dello spazio aereo sopra l'embrione con una matita e copri l'area delineata con nastro trasparente.
   3. Usando le forbici curve, tagliare delicatamente intorno all'area tracciata, facendo attenzione a non tagliare le membrane embrionali o i vasi sanguigni e scartare la parte superiore del guscio d'uovo.
   4. Posizionare alcune gocce di terreno salino o di coltura cellulare sulla membrana dello spazio aereo per bagnarla in modo che si stacchi facilmente. Usando una pinza fine, perforare con cura la membrana dello spazio aereo sopra la parte superiore dell'embrione, rimuoverla e individuare la testa dell'embrione di pulcino.
   5. Utilizzare una pinza fine per afferrare la membrana amnionica trasparente che circonda immediatamente l'embrione per posizionare la testa in modo che il tectum ottico possa essere iniettato con le cellule. Con una mano, utilizzare la pinza fine per trattenere l'amnion per mantenere la testa in posizione durante il processo di iniezione. Fare attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni extraembrionali nella membrana corioallantoica sul tuorlo.
      NOTA: La procedura di cui sopra richiede un po 'di pratica per essere in grado di afferrare in modo efficiente la membrana amnionica trasparente che circonda intimamente l'embrione, poiché è invisibile fino a quando non viene afferrata e tirata. Esercitati con una pinza fine per afferrare l'amnione chiaro che circonda immediatamente l'embrione.
   6. Tenere ferma la testa afferrando la membrana amnionica con una pinza fine. Utilizzando una micropipetta di vetro e una picopompa pneumatica, iniettare circa 50.000 cellule in 5 μL di terreno di coltura cellulare adatto nel tectum ottico (5 μL sono circa 1/2 di una micropipetta riempita).
      NOTA: Vedi Cretu et ^al.1 per un'immagine di un embrione E5 che è stato iniettato con cellule GBM mescolate con colorante.
   7. Mettere alcune gocce di 50 mg/ml di ampicillina sopra l'embrione.
   8. Coprire il foro nella parte superiore delle uova con nastro trasparente e lasciare in umidificatore fino a E15 per la dissezione.

2. Dissezione delle regioni cerebrali dagli embrioni E15

NOTA: La dissezione dei cervelli E15 qui per la fissazione è simile a quella descritta nel passaggio 8.2 per le fette di cervello vive, ma la dissezione qui non deve essere eseguita in condizioni asettiche.

1. Tagliare via il nastro intorno alla parte superiore del guscio, consentendo l'accesso all'embrione.
2. Decapitare l'embrione al collo e posizionare la testa in un piatto da 10 cm con soluzione sterile di Tyrodes priva di calcio e magnesio (CMF Tyrode). Cfr . figura supplementare 2.
3. Usando una pinza sottile, staccare la pelle che copre il cervello per rivelare la dura madre sottostante. Rimuovere le ossa del cranio in formazione sui lati sinistro e destro del cervello. Le ossa del cranio in formazione non coprono ancora la maggior parte del cervello.
4. Usa delicatamente una pinza appuntita fine per strappare le meningi sovrastanti il centro del cervello e sbucciarla su ciascun lato per scoprire il cervello.
5. Usa una pinza curva per raccogliere il cervello dal basso e tirarlo delicatamente fuori dalla sua cavità.
6. Seziona il cervello nelle sue parti: proencefalo, tecta, cervelletto.
7. Rimuovere la pia madre sovrastante dalla tecta usando una pinza fine. Si noti che la pia si separa facilmente dalla tecta, ma non dal proencefalo o dal cervelletto. Rimuovere la pia dal proencefalo toccandola o arrotolandola su un piccolo pezzo di carta da filtro.
8. Metti le regioni cerebrali sezionate in un piccolo piatto.
9. Posizionare le regioni cerebrali per la fissazione in un pozzetto a 24 pozzetti e fissare in paraformaldeide (PFA) al 2% in tampone di cacodilato di sodio 0,1 M. Lasciare agire per almeno 24 ore a 4 °C.
10. Dopo la fissazione, sciacquare il tessuto in 3x PBS per almeno 1 ora prima di incorporarlo in agar.

3. Incorporare e affettare le regioni cerebrali raccolte

1. Preriscaldare una soluzione di agar al 3,5% e saccarosio all'8% in PBS fino a fusione e mantenerla alla temperatura di fusione.
2. Usando una pinza curva come paletta, raccogliere delicatamente il tectum ottico o la regione del proencefalo del cervello dell'embrione di pulcino e asciugare leggermente sulla carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso per garantire l'adesione dell'agar alla superficie esterna del cervello.
3. Utilizzando una pipetta di trasferimento sterile, riempire lo stampo con una soluzione di agar.
   NOTA: Un semplice stampo può essere realizzato formando un foglio di alluminio attorno a un oggetto di dimensioni appropriate, come piccoli blocchi rettangolari di affettatrice di tessuto vibrante in metallo.
4. Metti la regione del cervello in agar e lascia che l'agar si solidifichi completamente.
5. Rimuovere il foglio di alluminio intorno al cervello incorporato e tagliare l'agar in eccesso intorno ai lati usando una lama di rasoio o un bisturi.
6. Posizionare una goccia di colla cianoacrilica sul quadrato in acciaio inossidabile del vassoio di affettatura, posizionare il blocco di agarosio con il cervello sulla colla e lasciare che la colla si leghi per 1 minuto. Posizionare il vassoio nel mandrino dell'affettatrice di tessuto vibrante, stringere e riempire il vassoio con abbastanza PBS da coprire la parte superiore del blocco di agar.
7. Tagliare le fette di cervello su un'affettatrice di tessuto vibrante con uno spessore di 350 μm usando una lama di rasoio d'acciaio.
8. Mentre le fette di cervello vengono tagliate e galleggiano liberamente nel vassoio di affettatura, utilizzare una spatola per raccogliere e rimuovere le fette dal vassoio. Far scivolare delicatamente la sezione dalla spatola e in una capsula di Petri etichettata da 10 cm con PBS in modo che le sezioni fluttuino liberamente.
   NOTA: L'agar che circonda la fetta di cervello può staccarsi se il cervello non è sufficientemente tamponato con carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso prima dell'incorporamento. Se ciò si verifica, il tessuto cerebrale può essere rimosso delicatamente dall'agar solidificato e reincorporato dopo una corretta asciugatura del liquido in eccesso.

4. Immunocolorazione delle fette di cervello con cellule tumorali

1. Utilizzando uno stereomicroscopio dotato di epifluorescenza, schermare le singole fette nel piatto da 10 cm una per una per la presenza o l'assenza di cellule tumorali.
2. Preparare una quantità sufficiente di soluzione salina tamponata fosfato con Triton X-100 allo 0,1% e siero di capra normale al 5% (PBSTG) (vedere Tabella 1) per l'immunocolorazione e sciacquare le fette da immunocolorare.
3. Pozzetti di riempimento a metà in una piastra da 24 pozzetti che verrà utilizzata per colorare sezioni cerebrali con PBS.
4. Tagliare gli angoli di agar intorno alle fette del cervello con il bordo di una spatola o di un bisturi e posizionarli delicatamente nei pozzetti contenenti PBS.
5. Aspirare il PBS e sostituirlo con 350 μL di soluzione di colorazione anticorpale primaria in PBSTG (ad esempio, 2 μg/mL UJ127 in PBSTG).
6. Incubare per 24 ore in una cella frigorifera agitando delicatamente in modo che la fetta si muova liberamente all'interno del pozzetto.
7. Dopo 24 ore, rimuovere la soluzione anticorpale primaria e risciacquare 3 x 1 h con PBSTG in una cella frigorifera agitando.
8. Al termine del risciacquo, incubare in 350 μL/pozzetto di soluzione di colorazione anticorpale secondaria in PBSTG (ad esempio, 1/200 di diluizione di biotina-GAM in PBSTG). Incubare per 20 ore in una cella frigorifera con agitazione.
   NOTA: Se si rinuncia alla fase terziaria e si incuba con l'anticorpo secondario contenente fluorocromo in questa fase, coprire per proteggere dalla luce durante l'incubazione di tanto in tanto e quindi saltare al punto 4.11.
9. Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria e risciacquare 3 x 1 h in PBSTG in una cella frigorifera agitando.
10. Rimuovere il PBSTG e incubare nella soluzione terziaria (ad esempio, diluizione 1:250 di Alexa Fluor 647 streptavidina in PBSTG). Se lo si desidera, colorare i nuclei in questa fase aggiungendo 0,1 μg/ml di bisbenzimmide alla miscela. Incubare per 20 ore in una cella frigorifera con agitazione.
11. Rimuovere la soluzione terziaria e risciacquare 3 x 1 h in PBSTG in una cella frigorifera agitando.
12. Lasciare in PBS fino al momento del montaggio su vetrini da microscopio.

5. Montaggio di fette su vetrini da microscopio

1. Prepara tanti vetrini da microscopio quante sono le sezioni da montare.
2. Per ogni vetrino, posizionare una striscia di 50 mm di nastro elettrotecnico in vinile di 10 mil (254 μm) di spessore su un pezzo di parafilm.
3. Utilizzando un foro quadrato di 1 cm x 1 cm, perforare un foro attraverso il centro del nastro isolante e del parafilm.
4. Estrarre il nastro dal parafilm e posizionarlo sopra il vetrino del microscopio, lasciando spazio per il nastro adesivo sul vetrino.
5. Utilizzando una micropipetta, posizionare una o due gocce di supporto di montaggio anti-sbiadimento nel foro quadrato al centro del nastro isolante.
6. Utilizzare una spatola curva per sollevare la sezione dell'affettatrice di tessuto vibrante desiderata dal PBSTG e rimuovere accuratamente l'umidità con una salvietta da laboratorio pulita o un pezzo di carta da filtro.
7. Toccare il bordo della fetta fino alla goccia di montante e utilizzare un'altra spatola per far scorrere delicatamente la sezione nel supporto di montaggio.
8. Coprire la sezione con qualche altra goccia di montante e posizionare con attenzione un coprislip di 24 mm x 30 mm (# 1,5 spessore) sopra la sezione e il montante.
9. Sigillare i bordi della copertina con lo smalto per unghie per tenerlo in posizione.

6. Microscopia confocale di fette cerebrali fisse

1. Utilizzare la fluorescenza a campo largo per trovare tumori fluorescenti nella fetta di cervello montata utilizzando l'obiettivo appropriato e i set di filtri.
   NOTA: Alcuni tumori possono essere abbastanza grandi e sono facilmente visibili con l'obiettivo 4x, mentre le singole cellule potrebbero richiedere l'obiettivo 10x.
2. Passare alla microscopia confocale utilizzando una lente obiettiva, uno o più laser, dimensioni stenopeiche, e le impostazioni del rilevatore. Per seguire questo protocollo, utilizzare un obiettivo 20x (apertura numerica [N.A.] = 0,75) per l'imaging di routine e un obiettivo olio 60x (N.A. = 1,40) per l'imaging ad alta risoluzione.
3. Impostare i limiti superiore e inferiore dell'asse z e la dimensione del passo (per la situazione specifica secondo le istruzioni del produttore del microscopio confocale) per l'acquisizione di sezioni ottiche. Acquisisci uno z-stack di sezioni ottiche.
4. Utilizzare il software del microscopio confocale per creare un rendering del volume 3D del tumore, secondo le istruzioni del produttore.

7. Preparazione sferoidale

1. Creazione di lastre di poli(2-idrossietilmetacrilato) (poli-HEMA)
   1. Creare una soluzione di 10 μg/mL di poli-HEMA in etanolo al 95% e rivestire piastre di Petri da 35 mm (o piastre di coltura cellulare) con 1 mL di questa soluzione.
   2. Lasciare che i piatti si adagino su un bilanciere scoperto durante la notte a temperatura ambiente per sviluppare un rivestimento della superficie del piatto.
      NOTA: Il solvente evaporerà e lascerà un rivestimento traslucido sul piatto, che potrebbe apparire irregolare, ma ciò non influirà sulla capacità di produrre sferoidi cellulari.
   3. Dopo l'essiccazione, sterilizzare i piatti aperti sotto la luce UV in un armadio di biosicurezza per 1 ora. Sostituire i coperchi dopo la sterilizzazione. I piatti rivestiti sono ora pronti per l'uso.
2. Colorazione fluorescente DiD per microscopia time-lapse
   NOTA: Questa sezione è per la colorazione di singole cellule con colorante fluorescente DiD da utilizzare per produrre sferoidi, che ottimizza la visualizzazione della motilità cellulare per l'imaging time-lapse dal vivo.
   1. Sospendi le cellule in un terreno di coltura privo di siero.
   2. Aggiungere 5 μL di stock di DiD/mL di sospensione cellulare e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Incubare per 20 min a 37 °C.
   3. Centrifugare la sospensione cellulare marcata a 800 × g a 5 °C per 5 minuti.
   4. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in mezzi caldi per risciacquare.
   5. Ripetere questa centrifugazione e risciacquare altre due volte.
      NOTA: se lo si desidera, saltare al passaggio 7.3.6 per creare sferoidi immediatamente dopo questo processo.
3. Fare sferoidi cellulari
   1. Riscaldare la soluzione di tripsina/acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) allo 0,25% a 37 °C.
   2. GSC di coltura in terreni GSC¹⁷ (tabella 1) e cellule gloima maligne (MG) U-118 in terreno di coltura U-118 (cfr. tabella 1). Utilizzare un piatto confluente di 10 cm per la preparazione di una piastra di sferoidi da 35 mm. Aggiungere i fattori di crescita bFGF (concentrazione finale di 10 ng/ml) e TGF-α (concentrazione finale di 20 ng/ml) alle GSC inizialmente e poi ogni 3 giorni.
      NOTA: Le cellule utilizzate nel presente studio erano GSC15-2/K72 verdi, GSC16-4/K72 verdi, U-118/L1LE/mCherry2x rosse e U-118/1879/mCherry2x rosse. Una piastra di sferoidi dovrebbe essere sufficiente per due piastre a 6 pozzetti di fette di cervello su inserti di membrana.
   3. Risciacquare le cellule sulle piastre con PBS sterile e posizionare 1 mL di soluzione di tripsina su una capsula da 10 cm. Mettere nell'incubatore di coltura cellulare per 2-3 minuti fino a quando le cellule iniziano a staccarsi.
   4. Inattivare la tripsina aggiungendo 10 ml di terreno di coltura appropriato contenente siero nel piatto da 10 cm e staccare le cellule pipettando su e giù. Inserire la sospensione cellulare in una provetta conica da centrifuga da 15 ml.
   5. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 800 × g per 5 minuti a 4 °C.
   6. Aspirare il mezzo dal pellet cellulare e risospendere le cellule in 10 ml di supporto.
   7. Posizionare 2 mL di sospensione cellulare su ciascun piatto rivestito in poliHEMA da 35 mm e aggiungere altri 2 ml di supporto appropriato per ottenere 4 mL di supporto totale per piatto. Se utilizzi le GSC, aggiungi i fattori di crescita.
   8. Incubare le cellule in un incubatore cellulare fino a quando gli aggregati raggiungono una dimensione di 100-200 μm, che potrebbe essere di 1-2 giorni a seconda della densità delle cellule che sono state placcate.

8. Dissezione del cervello dell'embrione di pulcino vivo e affettatrice di tessuto vibrante

1. Preparazione per la dissezione
   1. Preparare una piastra di inserto a membrana di poliestere a 6 pozzetti con 1 ml di terreno di coltura a fetta di cervello (vedere Tabella 1) sotto l'inserto della membrana.
   2. Sterilizzare l'area di lavoro e gli strumenti con etanolo al 70%.
   3. Posizionare la piastra di inserimento a 6 pozzetti sul ghiaccio mentre è in corso la dissezione.
   4. Preparare 100 ml di mezzo vibrante per affettare l'affettatrice di tessuto (Tabella 1) e metterlo sul ghiaccio.
   5. Introdurre un flaconcino di agarosio a basso contenuto di fusione al 4% in PBS a bagnomaria fino a quando non si scioglie in un liquido (circa 50 °C).
   6. Riempire la vasca dell'affettatrice di tessuto vibrante con ghiaccio.
2. Dissezione asettica del cervello dell'embrione di pulcino E14/15
   1. Usando un candelabro per uova, tracciare lungo il perimetro della sacca d'aria sopra l'embrione E14 o E15 con una matita e coprire l'area delineata con nastro trasparente.
   2. Usando forbici curve o sottili, tagliare delicatamente intorno all'area tracciata, facendo attenzione a non tagliare la membrana embrionale o i vasi sanguigni e scartare il pezzo superiore del guscio.
   3. Utilizzando una pinza curva, rimuovere la membrana dello spazio aereo sopra la parte superiore dell'embrione e individuare la testa dell'embrione di pulcino.
   4. Decapitare l'embrione e posizionare la testa in un piatto da 10 cm con soluzione fredda sterile di CMF. Cfr . figura supplementare 2.
   5. Usando una pinza fine sterile, staccare la pelle che copre il cervello per rivelare la dura madre sottostante. Rimuovere le ossa del cranio in formazione sui lati sinistro e destro del cervello. Le ossa del cranio in formazione non coprono ancora la maggior parte del cervello.
   6. Usa delicatamente una pinza appuntita fine (# 5 o # 55) per strappare le meningi che sovrastano il centro del cervello e sbucciarlo su ciascun lato per scoprire il cervello.
   7. Usando una pinza curva fine, raccogli il cervello dalla parte anteriore inferiore e tiralo delicatamente fuori dalla sua cavità.
   8. Seziona il cervello nelle sue tre parti principali: proencefalo, mesencefalo (ottica tecta), cervelletto. Consultare un atlante dello sviluppo dei pulcini, se necessario.
   9. Rimuovere la pia madre sovrastante dalla tecta usando una pinza fine.
      NOTA: La pia si separa facilmente dalla tecta, ma non dal proencefalo o dal cervelletto. La pia può essere rimossa dal proencefalo toccandola o arrotolandola su una garza sterile.
   10. Posizionare le regioni cerebrali sezionate in un piccolo piatto sterile sul ghiaccio.
3. Incorporare e affettare il cervello
   1. Usando una pinza curva come paletta, raccogliere delicatamente il tectum ottico o la regione del proencefalo e asciugare leggermente sulla garza sterile per rimuovere il liquido in eccesso per garantire l'adesione dell'agarosio alla superficie esterna del cervello.
   2. Utilizzando una pipetta di trasferimento sterile, riempire lo stampo con agarosio a basso punto di fusione. Preparare uno stampo semplice formando un foglio di alluminio attorno a un oggetto di dimensioni appropriate. Il piccolo blocco rettangolare di affettatrice di tessuto vibrante in metallo viene abitualmente utilizzato come oggetto. Cfr. figura supplementare 3.
   3. Posizionare rapidamente la regione del cervello in agarosio e lasciarla solidificare (circa 4-5 minuti) sul ghiaccio.
      NOTA: Il cervello può affondare sul fondo dello stampo prima che l'agarosio si indurisca. Se ciò si verifica, attendere 1 minuto per lasciare che l'agar inizi a tramontare, quindi posizionare la regione del cervello nell'agarosio. Prova a sospendere la regione del cervello direttamente nel mezzo dell'agarosio.
   4. Rimuovere il foglio di alluminio da intorno al cervello incorporato nell'agarosio solidificato e tagliare l'agarosio in eccesso intorno ai lati usando una lama di rasoio sterile o un bisturi.
   5. Posizionare una goccia di colla cianoacrilica sul quadrato in acciaio inossidabile del piatto / vassoio di affettatura, posizionare il blocco di agarosio con il cervello e lasciare che la colla si leviga per 1 minuto. Posizionare il piatto/vassoio nel mandrino dell'affettatrice di tessuto vibrante, stringere e riempire il vassoio con un mezzo di taglio per coprire la parte superiore del blocco di agarosio.
   6. Tagliare le sezioni su un'affettatrice di tessuto vibrante a 250-350 μm usando un coltello zaffiro, che è stato segnalato per causare meno danni ai tessuti vivi rispetto a una lama di rasoio d'acciaio.
   7. Mentre le fette di cervello vengono tagliate e galleggiano liberamente nel vassoio di affettatura, utilizzare una spatola sterile per raccogliere e rimuovere la fetta dal vassoio. Far scorrere delicatamente la sezione dalla spatola e su un inserto di membrana usando un'altra spatola sterile.
      NOTA: Normalmente, due o tre fette di cervello possono essere posizionate su ciascun inserto di membrana, se lo si desidera. L'agarosio che circonda la fetta di cervello può staccarsi se il cervello non è sufficientemente tamponato con una garza sterile per rimuovere il liquido in eccesso. Se ciò si verifica ancora dopo una sufficiente tamponatura prima dell'incorporazione, raccogliere delicatamente la fetta senza l'agarosio circostante e farla scorrere sull'inserto della membrana.
   8. Posizionare la piastra a 6 pozzetti di fette di cervello sugli inserti di membrana nell'incubatore di coltura cellulare a 37 °C e al 5% di CO₂.
   9. Il giorno dopo la placcatura, utilizzare una pipetta Pasteur sterile per aspirare il fluido da sotto l'inserto (ci sono spazi vuoti nei lati degli inserti per consentire a una pipetta di accedere al supporto sottostante). Aggiungere 1 mL di mezzo fresco per fette a ciascun pozzetto sotto l'inserto della membrana. Continua a cambiare media a giorni alterni in seguito.
   10. Attendi qualche giorno affinché le fette di cervello si attacchino saldamente agli inserti della membrana e sembrino appiattirsi un po '. Questo è un segno che le fette sono vitali e pronte per l'introduzione delle celle GBM.

9. Introduzione delle cellule GBM sulle fette di cervello

1. Metodo sferoidale
   1. Dopo che gli sferoidi cellulari hanno raggiunto 150-200 μm di dimensione, utilizzare una micropipetta da 20 μL impostata su 5 μL per rimuovere da uno a più sferoidi dal loro piatto di coltura. Cfr. figura supplementare 3.
   2. Espellere delicatamente il supporto con sferoidi sulla fetta di cervello desiderata.
      NOTA: gli sferoidi cellulari devono essere visibili nella punta della pipetta. L'uso di una punta per pipetta trasparente li renderà più facili da vedere nella punta. Se lo sferoide cade dalla fetta di cervello quando il liquido viene rilasciato, è necessario utilizzare una ciglia sterilizzata con etanolo incollata a un sottile bastoncino applicatore di legno per spingere delicatamente lo sferoide sulla fetta di cervello.
   3. Lasciare che gli sferoidi si coltivino sulle fette del cervello per 2-5 giorni.
      NOTA: La limitazione qui sembra essere l'eventuale degradazione dei vasi sanguigni e delle cellule cerebrali nella fetta. I vasi sanguigni degradati appariranno come palline discontinue nella fetta quando macchiati per la laminina.
2. Metodo di punzonatura bioptica
   1. Lasciare che le fette di cervello si attacchino sembrando appiattirsi sull'inserto della membrana (potrebbero essere necessari 2-5 giorni in coltura).
   2. Scongelare la matrice cellulare sul ghiaccio.
   3. Nell'armadio di biosicurezza della coltura cellulare, collegare un punch sterile per biopsia di 1 mm di diametro a un tubo aspiratore a vuoto.
   4. Toccare delicatamente la fetta di cervello con il punzone bioptico per creare un foro di 1 mm al centro della fetta di cervello.
      NOTA: Il tessuto nel punch bioptico verrà aspirato nel punch dal vuoto.
   5. Preparare una sospensione di matrice cellulare tripsinizzando un piatto di cellule confluenti del 60% -70% di 10 cm e riassumendo in 10 ml di supporto; quindi, mescolare 1 mL di quella sospensione con 100 μL di matrice.
   6. Utilizzando una micropipetta da 20 μL, posizionare 1 μL della miscela di matrice cellulare in ciascun foro delle fette di cervello.
   7. Dopo aver terminato il posizionamento della miscela cellulare, posizionare il piatto di fette di cervello con cellule incorporate nell'incubatore e consentire alla matrice di solidificarsi e alle cellule di invadere potenzialmente la fetta di cervello circostante.

10. Microscopia time-lapse a fluorescenza a largo campo

1. Posizionare il nastro rimovibile attorno al bordo della piastra a 6 pozzetti per impedire l'evaporazione del fluido, lasciando un piccolo spazio su un lato per lo scambio di gas.
2. Posizionare le piastre in una camera di coltura personalizzata su uno stadio automatizzato regolabile su un microscopio a epifluorescenza invertita.
   NOTA: La camera è stata mantenuta in condizioni atmosferiche del 5% di CO₂ e del 95% di aria utilizzando un controller di iniezione di gas e la temperatura è stata mantenuta a 37 °C con un regolatore di temperatura dell'aria calda e un inserto a temperatura controllata. Vedi Fotos et ^al.18 per i dettagli del sistema utilizzato qui.
3. Utilizzando un apposito software di controllo del microscopio, creare un programma di acquisizione time-lapse che raccolga immagini fluorescenti delle aree di interesse una volta ogni 10 minuti per 20 ore.
   NOTA: Se nelle cellule viene utilizzata un'etichetta fluorescente verde (ad esempio, proteina fluorescente verde [GFP]), utilizzare la quantità minima di luce di eccitazione blu richiesta per visualizzare le cellule per prevenire la fototossicità. Le etichette rosse (ad esempio, mCherry) e rosso lontano (ad esempio, DiD) non sembrano avere questo potenziale problema a causa dell'eccitazione a lunghezza d'onda più lunga.

11. Immunocolorazione delle fette di cervello dopo microscopia time-lapse

NOTA: Questo protocollo di immunocolorazione è ottimizzato per colorare i vasi sanguigni con laminina e nuclei con bisbenzimide. Utilizzare anticorpi appropriati per la/e molecola/e desiderata/e di interesse.

1. Aspirare il fluido da sotto l'inserto della membrana utilizzando una pipetta Pasteur e posizionare 1 mL di PFA al 2% in tampone cacodilato di sodio 0,1 M sotto l'inserto e 1 mL sopra l'inserto per coprire la fetta di cervello. Lasciare fissare le fette per una notte a 4 °C.
2. Rimuovere il fissativo da sotto l'inserto della membrana e qualsiasi fissativo rimasto sulla fetta di cervello (il fissativo tende a fuoriuscire attraverso l'inserto della membrana nel pozzo sottostante).
3. Rimuovere l'inserto con fette dal pozzetto da 35 mm e metterli in un piatto di plastica più grande.
4. Preparare una piastra da 24 pozzetti aggiungendo 350 μL di PBS in tanti pozzetti quante sono le fette di cervello (una fetta / pozzetto durante l'immunocolorazione).
   1. Utilizzando una spatola sottile, rimuovere delicatamente l'agarosio da intorno alla fetta di cervello senza staccare la fetta di cervello dall'inserto della membrana. Assicurati che l'agarosio si stacchi facilmente dal bordo esterno della fetta del cervello. In caso contrario, lasciare l'agarosio attaccato alla fetta di cervello.
   2. Usando un bisturi affilato, tagliare la membrana intorno alla fetta del cervello fino a quando la fetta con la membrana sottostante è libera dal resto dell'inserto. Raccogli la membrana con la fetta di cervello attaccata, usando una pinza fine per afferrare la membrana e posizionala in un pozzetto della piastra a 24 pozzetti in PBS.
5. Risciacquare le fette 3 volte con PBS nell'arco di 1 ora nella cella frigorifera con agitazione o oscillazione costante e delicata, in modo che la fetta si muova all'interno del pozzetto.
6. Durante il risciacquo, preparare la soluzione anticorpale primaria.
   1. Diluire l'anti-laminina a 2 μg/mL in PBSTG (vedere Tabella 1).
7. Rimuovere il PBS dai pozzetti e incubare durante la notte in soluzione anticorpale primaria in una cella frigorifera con delicata agitazione.
8. Dopo almeno 20 ore di incubazione, aspirare la soluzione anticorpale primaria e sciacquare le sezioni 3x per 1 ora in PBSTG.
9. Durante il risciacquo, preparare la soluzione anticorpale secondaria.
   1. Diluire fluorescente-GAM con il fluorocromo specifico necessario per una diluizione 1:200 in PBSTG insieme a una concentrazione di 0,1 μg/mL di bisbenzimmide.
   2. Rimuovere PBSTG e incubare durante la notte in una stanza fredda con agitazione nella soluzione di anticorpi secondari fluorescenti.
   3. Rimuovere l'anticorpo secondario e sciacquare 2 volte nell'arco di 1 ora in PBSTG e 1 volta in 1 ora in PBS.
   4. Lasciare in PBS fino al momento del montaggio su vetrini da microscopio (sezione 5) e visualizzare.

Discussione

I passaggi critici nel protocollo per l'iniezione di cellule nel ventricolo del mesencefalo (tectum ottico) includono non danneggiare i vasi sanguigni nella membrana corioallantoica nell'uovo o circondare l'embrione prima e durante l'iniezione, sebbene la membrana amnionica immediatamente circostante l'embrione possa essere delicatamente tirata e tenuta per posizionare la testa quando si iniettano le cellule nel mesencefalo. L'amnione è relativamente duro e può essere tirato con una pinza sottile per posizionare la testa e tenerla ferma con una mano, per l'iniezione di cellule con l'altra mano nel tectum ottico, che è la grande struttura rotonda nel mezzo del cervello. Generalmente, la vitalità degli embrioni iniettati varia dal 25% al 75%, a seconda di fattori sconosciuti, e praticamente ogni embrione che sopravvive contiene almeno un piccolo tumore nel tectum ottico. I passaggi critici nella generazione di fette di cervello vitali includono la cancellazione del tessuto di liquido in eccesso in modo che l'agarosio aderisca al cervello durante il taglio e per mantenere il tessuto e le fette fredde fino a quando non vengono posizionate sull'inserto della membrana. Poiché diversi tipi di cellule formano sferoidi in modo diverso (in velocità e dimensioni), la densità cellulare placcata su piastre di poli-HEMA e il periodo di tempo prima della raccolta degli sferoidi dovrebbero essere ottimizzati per ciascun tipo di cellula.

Il lavoro qui non è stato oggetto di uno studio longitudinale formale della vitalità delle fette di cervello. Yang et al. hanno usato colture di fette di cervello di embrione di pulcino simili a quelle utilizzate qui e hanno mostrato una buona vitalità delle fette per almeno 7 giorni¹⁶. Il lavoro precedente ha dimostrato che quando il tessuto OT è stato mantenuto in mezzi subottimali, molti nuclei picnotici sono apparsi nel tessuto, che non si sono verificati nelle fette nel lavoro qui. Inoltre, quando le fette degenerano in condizioni non ottimali, i vasi sanguigni si frammentano e appaiono come file di sfere positive alla laminina (non mostrate). Pertanto, sebbene la vitalità qui non sia stata verificata con metodi come l'elettrofisiologia o l'espressione attiva della caspasi-3, nessuno degli indicatori di morte cellulare che sono stati osservati in condizioni di coltura non ottimali è apparso qui.

L'OT è stato focalizzato per esperimenti di tumore cerebrale in vivo perché è la regione più facilmente iniettabile con il ventricolo più grande. A E5, che è l'ultimo giorno in cui l'embrione è abbastanza piccolo da rimanere accessibile sopra il tuorlo, le iniezioni devono essere fatte in un ventricolo, poiché tutte le regioni del cervello non sono altro che una sottile zona ventricolare. Tuttavia, queste iniezioni provocano con successo tumori incorporati con cellule che invadono il parenchima cerebrale. A volte, i tumori risultanti si trovano nel proencefalo o nel cervelletto, ma questo non è comune. Fette ex vivo di tectum ottico E15 sono state utilizzate principalmente per esperimenti qui, in modo che i risultati della co-coltura ex vivo possano essere correlati con gli esperimenti di iniezione in vivo . Tuttavia, anche le fette del proencefalo sono adatte e hanno una superficie più ampia e un ventricolo molto sottile rispetto al tectum ottico, il che potrebbe rendere il proencefalo più adatto per co-colture ex vivo che non sono correlate con iniezioni in vivo .

È stato dimostrato qui che le iniezioni in vivo, seguite dalla fissazione dei tessuti, dal sezionamento vibrante dell'affettatrice tissutale e dall'immunocolorazione per la laminina e altri marcatori, hanno portato a immagini ad alta risoluzione delle cellule GBM e delle GSC nel tessuto cerebrale in prossimità dei vasi sanguigni. La capacità di determinare le interrelazioni tra cellule tumorali e vasi sanguigni è stata notevolmente facilitata dalla creazione di rendering di volumi 3D da z-stack di sezioni ottiche confocali utilizzando il software confocale e le istruzioni del produttore. Era possibile l'imaging time-lapse utilizzando la microscopia a fluorescenza a largo campo di cellule marcate con GFP, mCherry e DiD; Tuttavia, le cellule in migrazione che si trovavano in prossimità degli sferoidi altamente fluorescenti erano talvolta oscurate dal "bagliore" dello sferoide. Questo effetto indesiderato può essere in qualche modo ridotto al minimo regolando attentamente i tempi di esposizione per la raccolta di immagini a campo ampio. L'imaging time-lapse utilizzando z-stack confocali nel tempo (4D) ha eliminato il bagliore fuori fuoco dagli sferoidi e ha portato a cellule migratorie nettamente definite con uno sfondo scuro. Questo non è stato descritto nel protocollo, ma è stato eseguito in modo simile all'imaging time-lapse a campo ampio, che è stato eseguito mentre le fette di cervello erano sugli inserti della membrana trasparente in una piastra di plastica a 6 pozzetti. Sebbene l'imaging time-lapse confocale produca immagini marcatamente più chiare delle singole cellule e del loro comportamento, un esperimento time-lapse multi-punto che raccoglie pile z di 10 piani z / punto, a intervalli di 10 minuti su un periodo di 20 ore, è un uso estensivo dei galvanometri a testa di scansione. Poiché ciò potrebbe ridurre significativamente la durata della vita dei galvanometri, questo metodo viene utilizzato con giudizio.

Sebbene il sistema embrionale di pulcino sia molto adatto sia per l'iniezione in vivo che per gli esperimenti di co-coltura ex vivo che studiano il comportamento delle cellule GBM, ci sono diverse limitazioni a questo sistema modello. Come con qualsiasi sistema di xenotrapianto, l'ambiente in cui vengono impiantate le cellule umane non è il cervello umano, ma il comportamento delle cellule GBM sembra imitarlo nei modelli di roditori e nei pazienti umani. Dopo aver eseguito esperimenti di iniezione in vivo su E5, i tumori sono normalmente autorizzati a formarsi per 10 giorni, fino a E15. Questo chiaramente non è abbastanza tempo per studiare tutti gli aspetti della tumorigenesi e dell'invasione cellulare. Tuttavia, è stato dimostrato qui che i tumori solidi si formano nel parenchima cerebrale, le cellule interagiscono e si riorganizzano all'interno del tumore e si verificano significative invasioni cerebrali sia lungo i vasi sanguigni che diffusamente in questo periodo di tempo relativamente breve. Un'altra limitazione al sistema embrionale di pulcino in vivo è che non è adatto per farmaci o altri trattamenti a causa del grande tuorlo e del sistema circolatorio extraembrionale che opera durante lo sviluppo dell'embrione di pulcino. I trattamenti topici con farmaci liquidi si tradurrebbero in una concentrazione altamente variabile e sconosciuta nel cervello a causa della diffusione lontano dall'embrione nella massa di tuorlo molto più grande. Allo stesso modo, l'iniezione endovenosa di farmaci nel delicatissimo sistema circolatorio extraembrionale fuoriuscirebbe o diffonderebbe dai vasi sanguigni e provocherebbe anche concentrazioni sconosciute nel cervello. Questo è uno dei motivi principali per cui è stato adottato il metodo di coltura a fetta ex vivo , in modo che non solo il comportamento cellulare potesse essere osservato e monitorato tramite microscopia time-lapse, ma anche in modo che i trattamenti che hanno avuto successo nell'alterare il comportamento delle cellule GBM in un piatto⁴ potessero essere testati in un ambiente di tessuto cerebrale più rilevante.

Lo sviluppo del sistema modello di tumore cerebrale ortotopico dell'embrione di pulcino è visto come un'aggiunta significativa ai sistemi e agli strumenti disponibili per lo studio della formazione del tumore GBM e del comportamento cellulare invasivo. È probabile che le uova di gallina fecondate siano prontamente disponibili nella maggior parte delle aree, sono poco costose rispetto ai roditori, non ci sono costi di cura degli animali, gli embrioni sono molto resistenti e resistenti alle infezioni (cioè, la maggior parte del lavoro viene svolto su un banco), gli embrioni sono altamente manipolabili e possono essere coltivati in coltura senza guscio¹⁹ e gli embrioni di pulcino non sono considerati animali vertebrati e quindi non richiedono l'approvazione IACUC dalle linee guida NIH (requisiti istituzionali può variare). Pertanto, questi molteplici vantaggi rendono il sistema embrionale di pulcino molto attraente se si limitano le loro domande ed esperimenti a quelli che rientrano nei suoi limiti. Diversi studi sulle cellule GBM sono stati eseguiti da altri utilizzando l'embrione di pulcino, ma questi hanno utilizzato quasi esclusivamente la membrana corioallantoica (CAM) dell'embrione 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 e gemma degli arti ³⁰, e non il cervello. C'è stato anche un rapporto che ha impiantato il medulloblastoma nel cervello del pulcino su E2³¹. Indubbiamente, l'uso dell'embrione di pulcino come sistema modello di xenotrapianto ortotopico, come descritto qui, dovrebbe produrre risultati molto più significativi per la biologia tumorale del GBM umano rispetto agli studi che utilizzano la CAM.

Sebbene questi studi abbiano appena iniziato a utilizzare pienamente il sistema modello di tumore cerebrale dell'embrione di pulcino per studi sulle cellule GBM umane e sul comportamento delle GSC, si spera che altri estenderanno gli usi e troveranno ulteriori potenziali applicazioni. Si potrebbe immaginare che non solo questo sistema scoprirà i meccanismi che regolano la formazione del tumore GBM e il comportamento cellulare, ma consentirà anche test preclinici di farmaci e sostanze specifici su cellule di pazienti specifici. Ad esempio, se le colture di fette di cervello sono state impostate in anticipo, le cellule tumorali, i pezzi di resezioni tumorali chirurgiche o gli organoidi GBM³² derivati dal paziente potrebbero essere collocati direttamente in co-coltura ex vivo e vari trattamenti potrebbero essere valutati in pochi giorni. Allo stesso modo, le cellule dissociate del paziente potrebbero essere iniettate direttamente nei mesencefalo E5 in ovo per valutare la loro capacità di formare tumori e invadere il parenchima cerebrale. Pertanto, si spera che le descrizioni dei metodi e dei risultati rappresentativi qui facilitino e incoraggino un maggiore uso di questo sistema altamente sottoutilizzato per la ricerca sul cancro al cervello.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cm x 1 cm square hole paper punch	Birabira	N/A
1 mm biopsy punch pen	Robbins Instruments	20335
6 well insert plate (Corning Transwell)	Millipore Sigma	CLS3450
9" Disposable Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20C
15 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-12
24 well plate	Corning Costar	3526
50 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-9
Agar	Fisher BioReagents	BP1423-500	for embedding fixed brains
Alexafluor 488-conjugated GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-605-146
Alexafluor 647-conjugated GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-146
Aluminum foil	ReynoldsWrap	N/A
Ampicillin	Sigma Aldrich	A-9518
anti-integrin alpha-6 monoclonal antibody GOH3	Santa Cruz Biotechnology	sc-19622
anti-L1CAM monoclonal antibody UJ127	Santa Cruz Biotechnology	sc-53386
anti-laminin monoclonal antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	3H11
anti-nestin monoclonal antibody 10c2	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
anti-Sox2 monoclonal antibody E-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
B27 supplement without vitamin A	GIBCO	17504-044
bisbenzimide (Hoechst 33258)	Sigma-Aldrich	B2883	nuclear stain
Cell culture incubator	Forma		standard humidified CO2 incubator
Centrifuge	Beckman Coulter
Confocal microscope	Nikon Instruments	C2si+	With custom-made cell incubator chamber
Confocal microscope objective lenses	Nikon Instruments		Plan Apo lenses, except S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA objective lens for confocal time-lapse imaging
Confocal microscope software	Nikon Instruments	NIS Elements	Version 5.2
Curved foreceps	World Precision Intruments	504478
Curved scissors	Fine Science Tools
Curved spatula	Fisher Scientific	14-375-20
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue	KG-585 12R
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270
DiD far red fluorescent dye	Invitrogen	V22887	Vybrant DiD
DMEM	Sigma Aldrich	D5671
DMEM/F12	Sigma Aldrich	D8437
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-1L
egg incubator	Humidaire
electrical tape (10 mil thick/254 µm)	Scotch	N/A
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories	2701
Fast green FCF dye	Avocado Research Chemicals	16520
FBS	Gemini Bio-products	900-108
filter paper	Fisher Scientific
Gauze	Dynarex	3353
Glass Capillaries for microinjection	World Precision Instruments	TW100-4
Glycerol	Fisher BioReagents	BP228-1	for mounting media
GSCs (human glioblastoma stem cells)	Not applicable		Isolated from patient GBM specimens in Galileo laboratory in GSC media and then transduced with a GFP encoding lentiviral vector.  Cells used were between passage 10 and 30.
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-020-CV
Hemacytometer	Hausser scientific
Heparin	Fisher Scientific	BP2524-100
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H0887
Horse Serum (HI)	Gibco	26050-088
Human FGF-2	BioVision	4037-1000
Human TGF-α	BioVision	4339-1000
Inverted phase contrast microscope	Nikon Instruments	TMS	for routine viewing of cultured cells
KCl	Fisher Scientific	BP366
KH2PO4	Fisher Scientific	P284
Laboratory film	Parafilm
Labquake Shaker	LabIndustries	T400-110
L-Glut:Pen:Strep	Gemini Bio-products	400-110
Low-melt agarose	Fisher Scientific	BP1360	for embedding live brains
Matrix	Corning Matrigel	354234
Medium 199	GIBCO	11150-059
MEM	Corning	10-010-CV
Metal vibratome block
Micropipette tips (20, 200, 1,000 µL)	Fisherbrand
Micropipettors (20, 200, 1,000 µL)	Gilson
Microscope Coverglass (no. 1.5 thickness)	Fisherbrand	12544A
NaCl	Fisher Scientific	S271
NaH2PO4 + H2O	Fisher Scientific	S369
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
Normal goat serum	Millipore Sigma	526-M
N-propyl gallate	Sigma Aldrich	P3130	for mounting media
Parafilm	Parafilm
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS	Sigma Aldrich	P5493-1L
Pencil
Plain Microscope slides	Fisherbrand	12-550-A3
Plastic 35 mm Petri dish	Becton Dickinson	351008
pneumatic picopump	World Precision Intruments	PV830
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)  (poly-HEMA)	Sigma Aldrich	P-3932
razor blade- double edge	PACE		for cutting fixed brain slices
sapphire knife	Delaware Diamond Knives		for cutting live brain slices
Scalpel	TruMed	1001
Sodium cacodylate buffer 0.2 M pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11652
Specimen chamber for vibratome	custom-made
Stereo Dissecting Microscope	Nikon Instruments	SMZ1500	Equipped with epifluorescence
straight foreceps	World Precision Intruments	500233
straight scissors	Fine Science Tools
Sucrose	Mallinckrodt	7723
Time-lapse fluorescence microscope (widefield fluorescence)	Nikon Instruments	TE2000-E	With custom-made cell incubator chamber (see Fotos et al., 2006)
Tissue culture dish polystyrene 100 mm	Thermo Fisher Scientific	130182	for cell culturing
Tissue culture dish polystyrene 60 mm	Becton Dickinson	353004	for cell culturing
Transfer pipette	American Central Scientific Co.	FFP011
Transparent tape	Scotch
Triton X-100	Sigma Aldrich	T-8787
Trypsin (0.25%) + 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
U-118 MG human GBM cell line	ATCC	HTB-15	Cells were transduced with a lentiviral vector encoding the entire ectodomain sequence of the L1CAM adhesion protein and then with lentiviral vector pUltra-hot encoding mCherry.  Passage numbers are unknown.
Vacuum pump	Cole-Parmer	EW-07532-40	"Air Cadet"
Vibrating tissue slicer	Vibratome	3000	for cutting live and fixed brain slices