Utilisation du cerveau de l’embryon de poussin comme modèle pour les analyses in vivo et ex vivo du comportement des cellules de glioblastome humain

Résumé

Les embryons de poussins sont utilisés pour étudier les tumeurs cérébrales du glioblastome humain (GBM) en co-cultures ovo et ex vivo de tranches cérébrales. Le comportement des cellules GBM peut être enregistré par microscopie time-lapse dans des co-cultures ex vivo , et les deux préparations peuvent être analysées au point final expérimental par une analyse confocale 3D détaillée.

Résumé

L’embryon de poussin a été un système modèle idéal pour l’étude du développement des vertébrés, en particulier pour les manipulations expérimentales. L’utilisation de l’embryon de poussin a été étendue pour étudier la formation de tumeurs cérébrales du glioblastome humain (GBM) in vivo et le caractère invasif des cellules tumorales dans les tissus cérébraux environnants. Les tumeurs GBM peuvent être formées par injection d’une suspension de cellules marquées par fluorescence dans le ventricule du mésencéphale E5 (tectum optique) in ovo.

Selon les cellules GBM, des tumeurs compactes se forment au hasard dans le ventricule et dans la paroi cérébrale, et des groupes de cellules envahissent le tissu de la paroi cérébrale. Des coupes de tissus épais (350 μm) de tecta E15 fixe avec des tumeurs peuvent être immunocolorées pour révéler que les cellules envahissantes migrent souvent le long des vaisseaux sanguins lorsqu’elles sont analysées par reconstruction 3D d’images confocales z-stack. Des tranches vivantes de cerveau moyen et antérieur E15 (250-350 μm) peuvent être cultivées sur des inserts membranaires, où des cellules GBM marquées par fluorescence peuvent être introduites dans des endroits non aléatoires pour fournir des co-cultures ex vivo pour analyser l’invasion cellulaire, qui peut également se produire le long des vaisseaux sanguins, sur une période d’environ 1 semaine. Ces co-cultures ex vivo peuvent être surveillées par microscopie à fluorescence large ou confocale pour observer le comportement des cellules vivantes.

Les tranches co-cultivées peuvent ensuite être fixées, immunocolorées et analysées par microscopie confocale pour déterminer si l’invasion s’est produite le long des vaisseaux sanguins ou des axones. De plus, le système de co-culture peut être utilisé pour étudier les interactions cellule-cellule potentielles en plaçant des agrégats de différents types et couleurs cellulaires à différents endroits précis et en observant les mouvements cellulaires. Les traitements médicamenteux peuvent être effectués sur des cultures ex vivo , alors que ces traitements ne sont pas compatibles avec le système in ovo . Ces deux approches complémentaires permettent des analyses détaillées et précises du comportement des cellules GBM humaines et de la formation de tumeurs dans un environnement cérébral de vertébrés hautement manipulable.

Introduction

Les études in vitro des comportements des cellules cancéreuses sont souvent utilisées pour disséquer les mécanismes potentiels qui opèrent pendant le comportement plus complexe observé lors de la formation de tumeurs et de l’invasion cellulaire dans des modèles de xénogreffes in vivo. Par exemple, avec le glioblastome (GBM), des études in vitro ont révélé des mécanismes de la façon dont L1CAM fonctionne potentiellement pendant la formation de tumeurs et l’invasion cérébrale dans un nouveau modèle de tumeur cérébrale de xénogreffe d’embryon de poussin 1,2,3,4,5. Bien que les expériences in vitro et in vivo se complètent de manière utile, elles laissent un vide substantiel dans la façon dont les résultats peuvent être corrélés. Par exemple, les analyses mécanistes de la motilité des cellules GBM sur une boîte sont une situation hautement artificielle, et les modèles de xénogreffes in vivo ne peuvent révéler que des analyses statiques ponctuelles ou finales de la formation tumorale et du comportement cellulaire. Les études in vivo utilisant des rongeurs ou des embryons de poussins ne se prêtent pas facilement à la surveillance du comportement cellulaire alors que les cellules envahissent le tissu cérébral dans ces modèles de xénogreffes. Néanmoins, le modèle de xénogreffe d’embryon de poussin a démontré que la protéine d’adhésion L1CAM joue un rôle stimulant dans la capacité invasive des cellules GBM T98G humaines ^2,5.

Une solution appropriée à ce problème peut être trouvée en faisant le pont entre les méthodes in vivo et in vitro à l’aide d’un modèle organotypique de culture de tranches de cerveau, appelé modèle ex vivo . Dans ce modèle ex vivo , le tissu cérébral vivant peut être maintenu à une épaisseur de plusieurs centaines de microns pendant quelques semaines, ce qui permet d’implanter des cellules cancéreuses, d’observer leur comportement dans les tissus réels au fil du temps, puis d’effectuer une analyse plus détaillée des marqueurs à la fin de l’expérience.

Une méthode de culture de tranches organotypiques populaire a consisté à cultiver une tranche de cerveau de plusieurs centaines de microns d’épaisseur sur une membrane poreuse translucide ou transparente, laissant le tissu exposé à l’air, tout en permettant aux milieux nutritifs de soutenir le tissu sous la membrane (voir Stoppini et ^coll.6). Différentes variantes de cette méthode ont été utilisées pour différentes études, y compris l’utilisation de différents milieux ou de différents inserts membranaires. Les différents inserts membranaires comprennent un insert membranaire poreux (0,4 μm) de diamètre dans une boîte de culture⁶ de 35 mm et des inserts de culture cellulaire (0,4 μm) pour les plaques^{6 puits 7}. Les différents milieux comprennent 50% MEM/HEPES + 25% de sérum de cheval inactivé par la chaleur + 25% de solution saline équilibrée Hanks (HBSS)⁸, 50% de milieu sérique réduit + 25% de sérum de cheval + 25% HBSS⁹, ainsi que d’autres. Si une membrane translucide ou transparente est utilisée avec des cellules GBM marquées par fluorescence, ces cultures peuvent être imagées par le bas à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ inversé ou confocale 10,11,12,13,14,15.

Alors que de nombreux modèles in vivo de xénogreffe de tumeurs cérébrales orthotopiques et de cultures de tranches cérébrales organotypiques ex vivo ont été établis à l’aide de rongeurs, comme indiqué ci-dessus, l’embryon de poussin (Gallus gallus) a été sous-utilisé à ces fins. Cependant, il a été démontré que l’embryon de poussin peut être utilisé comme modèle de xénogreffe orthotopique in vivo pour l’étude de l’invasion du gliome humain et du rat ^1,2,5. Les cellules xénogreffées dans le cerveau d’embryons de poussins ont présenté des schémas d’invasion similaires à ceux observés dans les modèles de rongeurs, ce qui renforce l’utilisation d’embryons de poussins comme modèle in vivo pour l’analyse des cellules tumorales GBM. Les embryons de poussins sont également peu coûteux, peuvent être plus facilement entretenus que les rongeurs (c.-à-d. dans leurs coquilles d’œufs dans un incubateur de laboratoire) et sont beaucoup plus faciles à travailler, ce qui en fait une option attrayante pour les études in vivo à court terme sur le GBM. Un article récent a décrit l’utilisation de cultures de tranches de cerveau d’embryons de poussins pour la formation et la croissance d’axones au cours du développement normal du cerveau où les tranches étaient viables pendant au moins 7 jours¹⁶. Cependant, l’utilisation de telles cultures de tranches de cerveau d’embryons de poussins pour l’analyse ex vivo du comportement des cellules GBM dans un environnement tissulaire fait défaut. Dans cet article, la transplantation de cellules GBM humaines et de cellules souches GBM (GSC) dans le cerveau embryonnaire précoce de poussin in vivo, ainsi que l’introduction de cellules GBM sur des cultures de tranches de cerveau d’embryons de poussins vivants ex vivo, sont décrites. Quelques exemples représentatifs des tumeurs résultantes et des modèles d’invasion cellulaire obtenus à partir de ces préparations sont également fournis.

Protocole

Aucune autorisation ou approbation n’était nécessaire à l’Université du Delaware pour effectuer ce travail.

1. Injection de cellules GBM dans le tectum optique des poussins

1. Préparation des CGG et des cellules GBM pour injection
   1. Culture CGC dans les milieux de la CGC (tableau 1). La culture a établi des lignées cellulaires GBM dans des milieux GBM (tableau 1).
   2. Rincer les cellules sur des plaques avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile et placer 1 mL de solution de trypsine dans un plat de 10 cm. Laisser dans un incubateur de culture cellulaire pendant 2-3 minutes jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher.
   3. Inactiver la trypsine en ajoutant 10 mL de milieux de culture appropriés contenant du sérum dans la capsule de 10 cm et détacher les cellules en les pipetant de haut en bas. Placer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique de 15 mL.
   4. Enduire les cellules par centrifugation à 800 × g pendant 5 min à 4 °C.
   5. Aspirer le fluide de la pastille de cellule à l’aide d’une pipette en verre fin jetable fixée à un ballon à bras latéral et à une pompe à vide. Remettez les cellules en suspension dans un milieu de croissance approprié à une concentration de 10 000 cellules par microlitre et placez-les dans un tube à microfuge ou un petit tube à vis sur de la glace.
   6. Mélanger les cellules avec une petite quantité de colorant FCF vert rapide stérile à 1 % (utiliser un rapport de 5 μL de colorant/100 μL de suspension cellulaire).
2. Injection de cellules GBM dans le tectum optique E5 in ovo. Voir la figure supplémentaire 1.
   1. Incuber les œufs de poule fécondés dans un incubateur à œufs humidifié, l’extrémité pointue tournée vers le bas, à 37,5 °C (le 1er jour d’incubation est le jour embryonnaire 0 [E0]). Le 6ème jour d’incubation (E5), stérilisez la coquille d’œuf en pulvérisant avec de l’éthanol à 70%.
   2. À l’aide d’un chandelier à œufs, tracez le long du périmètre de l’espace d’air au-dessus de l’embryon avec un crayon et couvrez la zone délimitée avec du ruban adhésif transparent.
   3. À l’aide de ciseaux incurvés, coupez doucement autour de la zone tracée, en prenant soin de ne pas couper dans les membranes embryonnaires ou les vaisseaux sanguins, et jetez le haut de la coquille d’œuf.
   4. Placez quelques gouttes de milieu de culture saline ou cellulaire sur la membrane de l’espace aérien pour la mouiller afin qu’elle se détache facilement. À l’aide de pinces fines, percez soigneusement la membrane de l’espace aérien sur le dessus de l’embryon, retirez-la et localisez la tête de l’embryon de poussin.
   5. Utilisez une pince fine pour saisir la membrane amnion transparente qui entoure immédiatement l’embryon pour positionner la tête afin que le tectum optique puisse être injecté avec des cellules. D’une main, utilisez la pince fine pour tenir l’amnion afin de maintenir la tête en place pendant le processus d’injection. Veillez à ne pas endommager les vaisseaux sanguins extraembryonnaires de la membrane chorio-allantoïdienne du jaune.
      REMARQUE: La procédure ci-dessus nécessite un peu de pratique pour pouvoir saisir efficacement la membrane amnion transparente qui entoure intimement l’embryon, car elle est invisible jusqu’à ce qu’elle soit saisie et tirée. Entraînez-vous à utiliser des pinces fines pour saisir l’amnion clair qui entoure immédiatement l’embryon.
   6. Maintenez la tête stable en saisissant la membrane amnion avec une pince fine. À l’aide d’une micropipette en verre et d’une picopompe pneumatique, injecter environ 50 000 cellules dans 5 μL de milieu de culture cellulaire approprié dans le tectum optique (5 μL représentent environ la moitié d’une micropipette remplie).
      REMARQUE : Voir Cretu et ^coll.1 pour une image d’un embryon E5 qui a été injecté avec des cellules GBM mélangées à un colorant.
   7. Placez quelques gouttes d’ampicilline à 50 mg/mL sur l’embryon.
   8. Couvrir le trou dans le haut des œufs avec du ruban adhésif transparent et laisser dans l’humidificateur jusqu’à E15 pour la dissection.

2. Dissection de régions cérébrales à partir d’embryons E15

REMARQUE: La dissection des cerveaux E15 ici pour la fixation est similaire à celle décrite à l’étape 8.2 pour les tranches de cerveau vivant, mais la dissection ici ne doit pas être faite dans des conditions aseptiques.

1. Coupez le ruban autour du dessus de la coquille, permettant l’accès à l’embryon.
2. Décapitater l’embryon au niveau du cou et placer la tête dans une boîte de 10 cm avec une solution stérile de Tyrodes sans calcium et magnésium (CMF Tyrode). Voir la figure supplémentaire 2.
3. À l’aide de pinces fines, retirez la peau qui recouvre le cerveau pour révéler la dure-mère sous-jacente. Enlevez les os du crâne en formation sur les côtés gauche et droit du cerveau. Les os du crâne en formation ne couvrent pas encore la majorité du cerveau.
4. Utilisez doucement des pinces fines et pointues pour déchirer les méninges recouvrant le centre du cerveau et pelez-les de chaque côté pour découvrir le cerveau.
5. Utilisez des pinces incurvées pour prélever le cerveau par le bas et le sortir doucement de sa cavité.
6. Disséquer le cerveau en ses parties: cerveau antérieur, tecta, cervelet.
7. Retirez la pie-mère sus-jacente du tecta à l’aide de pinces fines. Notez que le pia se sépare facilement du tecta, mais pas du cerveau antérieur ou du cervelet. Retirez le pia du cerveau antérieur en le touchant ou en le roulant sur un petit morceau de papier filtre.
8. Placez les régions cérébrales disséquées dans un petit plat.
9. Placer les régions du cerveau pour la fixation dans une plaque de 24 puits et fixer dans du paraformaldéhyde (PFA) à 2% dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M. Laisser agir pendant au moins 24 h à 4 °C.
10. Après la fixation, rincer le tissu dans 3x PBS pendant au moins 1 heure avant de l’incorporer dans l’agar-agar.

3. Intégrer et trancher les régions du cerveau récoltées

1. Préchauffer une solution de gélose à 3,5 % et de saccharose à 8 % dans du PBS jusqu’à ce qu’elle soit fondue et la maintenir à la température de fusion.
2. À l’aide d’une pince incurvée comme cuillère, ramasser doucement le tectum optique ou la région du cerveau antérieur du cerveau de l’embryon de poussin et éponger légèrement sur du papier filtre pour éliminer le liquide supplémentaire afin d’assurer l’adhérence de la gélose à la surface externe du cerveau.
3. À l’aide d’une pipette de transfert stérile, remplir le moule avec une solution d’agar.
   REMARQUE: Un moule simple peut être fabriqué en formant une feuille d’aluminium autour d’un objet de taille appropriée, tel que de petits blocs de trancheurs de tissu vibrants en métal rectangulaires.
4. Placez la région du cerveau dans l’agar et laissez la gélose se solidifier complètement.
5. Retirez la feuille d’aluminium autour du cerveau incrusté et coupez l’excès de gélose sur les côtés à l’aide d’une lame de rasoir ou d’un scalpel.
6. Placez une goutte de colle cyanoacrylate sur le carré en acier inoxydable du plateau de tranchage, placez le bloc d’agarose avec la cervelle sur la colle et laissez la colle se lier pendant 1 min. Placez le plateau dans le mandrin vibrant de la trancheuse à tissus, serrez et remplissez le plateau avec suffisamment de PBS pour couvrir le dessus du bloc de gélose.
7. Coupez les tranches de cerveau sur une trancheuse de tissu vibrant à une épaisseur de 350 μm à l’aide d’une lame de rasoir en acier.
8. Lorsque les tranches de cerveau sont coupées et flottent librement dans le plateau de tranchage, utilisez une spatule pour ramasser et retirer les tranches du plateau. Faites glisser doucement la section de la spatule et dans une boîte de Petri étiquetée de 10 cm avec du PBS pour que les sections flottent librement.
   REMARQUE: La gélose entourant la tranche de cerveau peut se détacher si le cerveau n’est pas suffisamment épongé avec du papier filtre pour éliminer l’excès de liquide avant l’incorporation. Si cela se produit, le tissu cérébral peut être retiré doucement de la gélose solidifiée et réintégré après un bon buvardage de l’excès de liquide.

4. Immunomarquage des tranches de cerveau avec des cellules tumorales

1. À l’aide d’un stéréomicroscope équipé d’épifluorescence, cribler les tranches individuelles dans la boîte de 10 cm une par une pour détecter la présence ou l’absence de cellules tumorales.
2. Préparer une quantité suffisante de solution saline tamponnée au phosphate avec 0,1 % de Triton X-100 et 5 % de sérum de chèvre normal (PBSTG) (voir le tableau 1) pour l’immunocoloration et rincer les tranches à immunocolorer.
3. Puits de demi-remplissage dans une plaque de 24 puits qui sera utilisée pour colorer les sections de cerveau avec du PBS.
4. Coupez les coins de gélose autour des tranches de cerveau avec le bord d’une spatule ou d’un scalpel, et placez-les doucement dans les puits contenant du PBS.
5. Aspirer le PBS et le remplacer par 350 μL de solution de coloration d’anticorps primaires dans PBSTG (p. ex. 2 μg/mL UJ127 dans PBSTG).
6. Incuber pendant 24 h dans une chambre froide en agitant doucement afin que la tranche se déplace librement dans le puits.
7. Après 24 h, retirer la solution d’anticorps primaires et rincer 3 x 1 h avec PBSTG dans une chambre froide avec agitation.
8. Une fois le rinçage terminé, incuber dans 350 μL/puits de solution de coloration d’anticorps secondaires dans PBSTG (p. ex., dilution de 1/200 de biotine-GAM dans PBSTG). Incuber pendant 20 h dans une chambre froide avec agitation.
   REMARQUE : Si vous renoncez à l’étape tertiaire et que vous incubez avec l’anticorps secondaire contenant du fluorochrome à cette étape, couvrez pour protéger de la lumière pendant l’incubation maintenant, puis passez à l’étape 4.11.
9. Retirer la solution d’anticorps secondaires et rincer 3 x 1 h dans PBSTG en chambre froide avec agitation.
10. Retirer le PBSTG et incuber dans la solution tertiaire (par exemple, dilution 1:250 de la streptavidine Alexa Fluor 647 dans PBSTG). Si désiré, colorer les noyaux à cette étape en ajoutant 0,1 μg/mL de bisbenzimide au mélange. Incuber pendant 20 h dans une chambre froide avec agitation.
11. Retirer la solution tertiaire et rincer 3 x 1 h dans PBSTG en chambre froide avec agitation.
12. Laisser dans PBS jusqu’à ce que vous soyez prêt à monter sur des lames de microscope.

5. Montage de tranches sur des lames de microscope

1. Préparez autant de lames de microscope qu’il y a de sections à monter.
2. Pour chaque diapositive, placez une bande de vinyle électrique de 50 mm de longueur de 10 mil (254 μm) d’épaisseur sur un morceau de parafilm.
3. À l’aide d’un perforateur carré de 1 cm x 1 cm, percez un trou au centre de la bande électrique et du parafilm.
4. Retirez le ruban du parafilm et placez-le sur la lame du microscope, en laissant de la place pour l’étiquetage du ruban adhésif sur la lame.
5. À l’aide d’une micropipette, placez une ou deux gouttes de support de montage anti-décoloration dans le trou carré au centre de la bande électrique.
6. Utilisez une spatule incurvée pour soulever la section de trancheuse de tissu vibrant souhaitée du PBSTG et évacuez soigneusement l’humidité avec une lingette de laboratoire propre ou un morceau de papier filtre.
7. Touchez le bord de la tranche à la goutte de support et utilisez une autre spatule pour faire glisser doucement la section dans le support de montage.
8. Couvrez la section avec quelques gouttes supplémentaires de support et placez soigneusement une glissière de couverture de 24 mm x 30 mm (#1,5 d’épaisseur) sur le dessus de la section et du support.
9. Scellez les bords de la lamelle de couverture avec du vernis à ongles pour le maintenir en place.

6. Microscopie confocale de tranches de cerveau fixes

1. Utilisez la fluorescence à grand champ pour trouver des tumeurs fluorescentes dans la tranche de cerveau montée à l’aide de la lentille d’objectif et du ou des ensembles de filtres appropriés.
   REMARQUE: Certaines tumeurs peuvent être assez grandes et sont facilement visibles avec l’objectif 4x, tandis que les cellules individuelles peuvent nécessiter l’objectif 10x.
2. Passez à la microscopie confocale à l’aide d’une lentille d’objectif, d’un ou de plusieurs lasers, d’une taille de sténopé et de paramètres de détecteur appropriés. Pour suivre ce protocole, utilisez un objectif 20x (ouverture numérique [N.A.] = 0,75) pour l’imagerie de routine et un objectif d’huile 60x (N.A. = 1,40) pour l’imagerie haute résolution.
3. Définissez les limites supérieure et inférieure de l’axe z et de la taille du pas (pour la situation spécifique selon les instructions du fabricant du microscope confocal) pour l’acquisition de sections optiques. Acquérir une pile z de sections optiques.
4. Utilisez le logiciel de microscope confocal pour créer un rendu de volume 3D de la tumeur, selon les instructions du fabricant.

7. Préparation sphéroïde

1. Création de plaques de poly(méthacrylate de 2-hydroxyéthyle) (poly-HEMA)
   1. Créer une solution de poly-HEMA à 10 μg/mL dans de l’éthanol à 95 % et enrober des boîtes de Petri de 35 mm (ou boîtes de culture cellulaire) avec 1 mL de cette solution.
   2. Laissez les plats reposer sur une bascule découverte pendant la nuit à température ambiante pour développer un revêtement de la surface du plat.
      REMARQUE: Le solvant s’évaporera et laissera un revêtement translucide sur la capsule, ce qui peut sembler inégal, mais cela n’affectera pas la capacité de fabriquer des sphéroïdes cellulaires.
   3. Après séchage, stériliser les plats ouverts sous lumière UV dans une enceinte de biosécurité pendant 1 h. Replacez les couvercles après la stérilisation. Les plats enrobés sont maintenant prêts à l’emploi.
2. Coloration fluorescente DiD pour microscopie time-lapse
   REMARQUE: Cette section concerne la coloration de cellules individuelles avec un colorant fluorescent DiD à utiliser pour fabriquer des sphéroïdes, ce qui optimise la visualisation de la motilité cellulaire pour l’imagerie en accéléré en direct.
   1. Suspendre les cellules dans un milieu de culture sans sérum.
   2. Ajouter 5 μL de DiD stock/mL de suspension cellulaire et mélanger doucement par pipetage. Incuber 20 min à 37 °C.
   3. Centrifuger la suspension cellulaire marquée à 800 × g à 5 °C pendant 5 min.
   4. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans un milieu chaud pour les rincer.
   5. Répétez cette centrifugation et rincez l’étape deux fois de plus.
      REMARQUE: Si vous le souhaitez, passez à l’étape 7.3.6 pour créer des sphéroïdes immédiatement après ce processus.
3. Fabrication de sphéroïdes cellulaires
   1. Réchauffer la solution de trypsine/acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 % à 37 °C.
   2. CGV de culture dans les milieux¹⁷ de la CGC (tableau 1) et les cellules de gloima maligne (MG) U-118 dans le milieu de culture U-118 (voir tableau 1). Utilisez une capsule confluente de 10 cm pour la préparation d’une assiette de sphéroïdes de 35 mm. Ajouter les facteurs de croissance du FGFb (concentration finale de 10 ng/mL) et du TGF-α (concentration finale de 20 ng/mL) aux CGS dans un premier temps, puis tous les 3 jours.
      REMARQUE : Les cellules utilisées dans la présente étude étaient le vert GSC15-2/K72, le vert GSC16-4/K72, le rouge U-118/L1LE/mCherry2x et le rouge U-118/1879/mCherry2x. Une plaque de sphéroïdes devrait suffire pour deux plaques de 6 puits de tranches de cerveau sur des inserts membranaires.
   3. Rincer les cellules sur les plaques avec du PBS stérile et placer 1 ml de solution de trypsine sur une boîte de 10 cm. Placer dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 2-3 minutes jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher.
   4. Inactiver la trypsine en ajoutant 10 mL de milieux de culture appropriés contenant du sérum dans la capsule de 10 cm et détacher les cellules en les pipetant de haut en bas. Placer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique de 15 mL.
   5. Enduire les cellules par centrifugation à 800 × g pendant 5 min à 4 °C.
   6. Aspirer le média de la pastille cellulaire et remettre les cellules en suspension dans 10 ml de média.
   7. Placer 2 mL de suspension cellulaire sur chaque boîte de 35 mm revêtue de poly-HEMA et ajouter 2 mL supplémentaires de milieu approprié pour obtenir 4 mL de média total par boîte. Si vous utilisez des CGV, ajoutez des facteurs de croissance.
   8. Incuber les cellules dans un incubateur cellulaire jusqu’à ce que les agrégats atteignent une taille de 100-200 μm, ce qui pourrait être 1-2 jours selon la densité des cellules qui ont été plaquées.

8. Dissection cérébrale d’embryons de poussins vivants et tranches de tissus vibrants

1. Préparation à la dissection
   1. Préparez une plaque d’insertion à membrane en polyester à 6 puits avec 1 mL de milieu de culture de tranches de cerveau (voir le tableau 1) sous l’insert à membrane.
   2. Stérilisez la zone de travail et les outils avec de l’éthanol à 70 %.
   3. Placez la plaque d’insertion à 6 puits sur de la glace pendant la dissection.
   4. Préparer 100 mL de trancheuse à tissulaire vibrant (tableau 1) et déposer sur de la glace.
   5. Placer un flacon d’agarose à bas point de fusion à 4 % dans du PBS au bain-marie jusqu’à ce qu’il fonde en liquide (environ 50 °C).
   6. Remplissez la cuve vibrante de la trancheuse à mouchoirs avec de la glace.
2. Dissection cérébrale d’embryon de poussin E14/15 aseptique
   1. À l’aide d’un chandelier à œufs, tracez le long du périmètre de la poche d’air au-dessus de l’embryon E14 ou E15 avec un crayon et couvrez la zone délimitée avec du ruban adhésif transparent.
   2. À l’aide de ciseaux incurvés ou fins, coupez doucement autour de la zone tracée, en veillant à ne pas couper dans la membrane embryonnaire ou les vaisseaux sanguins, et jetez le morceau supérieur de la coquille.
   3. À l’aide d’une pince incurvée, retirez la membrane de l’espace aérien sur le dessus de l’embryon et localisez la tête de l’embryon de poussin.
   4. Décapitater l’embryon et placer la tête dans une boîte de 10 cm avec une solution froide stérile de FMC. Voir la figure supplémentaire 2.
   5. À l’aide de pinces fines stériles, retirez la peau qui recouvre le cerveau pour révéler la dure-mère sous-jacente. Enlevez les os du crâne en formation sur les côtés gauche et droit du cerveau. Les os du crâne en formation ne couvrent pas encore la majorité du cerveau.
   6. Utilisez doucement des pinces fines pointues (#5 ou #55) pour déchirer les méninges recouvrant le centre du cerveau et pelez-les de chaque côté pour découvrir le cerveau.
   7. À l’aide de fines pinces incurvées, ramassez le cerveau par le bas vers le haut et retirez-le doucement de sa cavité.
   8. Disséquer le cerveau en ses trois parties principales: cerveau antérieur, mésencéphale (tecta optique), cervelet. Consultez un atlas du développement des poussins, au besoin.
   9. Retirez la pie-mère sus-jacente du tecta à l’aide de pinces fines.
      REMARQUE: Le pia se sépare facilement du tecta, mais pas du cerveau antérieur ou du cervelet. Le pia peut être retiré du cerveau antérieur en le touchant ou en le roulant sur de la gaze stérile.
   10. Placez les régions cérébrales disséquées dans une petite boîte stérile sur de la glace.
3. Intégrer et trancher le cerveau
   1. À l’aide d’une pince incurvée comme cuillère, prenez doucement le tectum optique ou la région du cerveau antérieur et épongez légèrement sur de la gaze stérile pour éliminer le liquide supplémentaire afin d’assurer l’adhérence de l’agarose à la surface externe du cerveau.
   2. À l’aide d’une pipette de transfert stérile, remplir le moule d’agarose à bas point de fusion. Préparez un moule simple en formant une feuille d’aluminium autour d’un objet de taille appropriée. Le petit bloc de trancheur de tissu vibrant métallique rectangulaire est couramment utilisé comme objet. Voir la figure supplémentaire 3.
   3. Placez rapidement la région du cerveau dans l’agarose et laissez-la se solidifier (environ 4-5 minutes) sur la glace.
      REMARQUE: Le cerveau peut couler au fond du moule avant que l’agarose ne durcisse. Si cela se produit, attendez 1 minute pour laisser la gélose commencer à prendre, puis placez la région du cerveau dans l’agarose. Essayez de suspendre la région du cerveau directement au milieu de l’agarose.
   4. Retirez la feuille d’aluminium autour du cerveau incrusté dans l’agarose solidifiée et coupez l’excès d’agarose sur les côtés à l’aide d’une lame de rasoir ou d’un scalpel stérile.
   5. Placez une goutte de colle cyanoacrylate sur le carré en acier inoxydable du plat/plateau à trancher, placez le bloc d’agarose avec le cerveau et laissez la colle se lier pendant 1 min. Placez le plat ou le plateau dans le mandrin vibrant de la trancheuse à mouchoirs, serrez et remplissez le plateau avec un fluide de tranchage pour couvrir le dessus du bloc d’agarose.
   6. Coupez les sections d’une trancheuse à papier vibrant à 250-350 μm à l’aide d’un couteau en saphir, ce qui entraînerait moins de dommages aux tissus vivants qu’une lame de rasoir en acier.
   7. Lorsque les tranches de cerveau sont coupées et flottent librement dans le plateau de tranchage, utilisez une spatule stérile pour ramasser et retirer la tranche du plateau. Faites glisser doucement la section hors de la spatule et sur un insert à membrane à l’aide d’une autre spatule stérile.
      REMARQUE: Normalement, deux ou trois tranches de cerveau peuvent être placées sur chaque insert de membrane, si désiré. L’agarose entourant la tranche de cerveau peut se détacher si le cerveau n’est pas suffisamment épongé avec de la gaze stérile pour éliminer l’excès de liquide. Si cela se produit encore après un buvard suffisant avant l’encastrement, ramassez doucement la tranche sans l’agarose environnante et faites-la glisser sur l’insert à membrane.
   8. Placer la plaque à 6 puits de tranches de cerveau sur des inserts membranaires dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 5% de CO₂.
   9. Le lendemain du placage, utilisez une pipette Pasteur stérile pour aspirer le média sous l’insert (il y a des espaces sur les côtés des inserts pour permettre à une pipette d’accéder au média en dessous). Ajouter 1 mL de fluide en tranches fraîches à chaque puits sous l’insert à membrane. Continuez à changer de média tous les deux jours par la suite.
   10. Attendez quelques jours que les tranches de cerveau se fixent fermement aux inserts membranaires et semblent s’aplatir quelque peu. C’est un signe que les tranches sont viables et prêtes pour l’introduction des cellules GBM.

9. Introduction de cellules GBM sur des tranches de cerveau

1. Méthode sphéroïde
   1. Une fois que les sphéroïdes cellulaires ont atteint une taille de 150 à 200 μm, utilisez une micropipette de 20 μL réglée à 5 μL pour retirer un à plusieurs sphéroïdes de leur boîte de culture. Voir la figure supplémentaire 3.
   2. Expulser doucement le média avec des sphéroïdes sur la tranche de cerveau désirée.
      REMARQUE: Les sphéroïdes cellulaires doivent être visibles dans l’embout de la pipette. L’utilisation d’une pointe de pipette transparente les rendra plus faciles à voir dans la pointe. Si le sphéroïde tombe de la tranche de cerveau lorsque le liquide est libéré, un cil stérilisé à l’éthanol collé à un mince bâtonnet d’applicateur en bois doit être utilisé pour pousser doucement le sphéroïde sur la tranche de cerveau.
   3. Laissez les sphéroïdes se cultiver sur les tranches de cerveau pendant 2 à 5 jours.
      REMARQUE: La limitation ici semble être la dégradation éventuelle des vaisseaux sanguins et des cellules cérébrales dans la tranche. Les vaisseaux sanguins dégradés apparaîtront sous forme de boules discontinues dans la tranche lorsqu’ils seront colorés pour la laminine.
2. Méthode de biopsie
   1. Laissez les tranches de cerveau se fixer en semblant s’aplatir sur l’insert membranaire (peut prendre de 2 à 5 jours en culture).
   2. Décongeler la matrice cellulaire sur la glace.
   3. Dans l’enceinte de biosécurité de culture cellulaire, connectez un poinçon de biopsie stérile de 1 mm de diamètre à un tube d’aspiration sous vide.
   4. Touchez doucement la tranche de cerveau avec le poinçon de biopsie pour créer un trou de 1 mm au centre de la tranche de cerveau.
      REMARQUE: Le tissu dans le poinçon de biopsie sera aspiré dans le poinçon par le vide.
   5. Préparer une suspension de matrice cellulaire en trypsinisant une boîte confluente de cellules de 10 cm à 60 % à 70 % et en la remettant en suspension dans 10 ml de milieu; Ensuite, mélangez 1 mL de cette suspension avec 100 μL de matrice.
   6. À l’aide d’une micropipette de 20 μL, placer 1 μL du mélange de matrice cellulaire dans chaque trou des tranches de cerveau.
   7. Une fois le placement du mélange cellulaire terminé, replacez le plat de tranches de cerveau avec des cellules intégrées dans l’incubateur et permettez à la matrice de se solidifier et aux cellules d’envahir potentiellement la tranche de cerveau environnante.

10. Microscopie accélérée à fluorescence à grand champ

1. Placez du ruban amovible autour du bord de la plaque à 6 puits pour empêcher l’évaporation du média, en laissant un petit espace d’un côté pour l’échange gazeux.
2. Placez les plaques dans une chambre de culture personnalisée sur une platine automatisée réglable sur un microscope à épifluorescence inversée.
   NOTE: La chambre a été maintenue à des conditions atmosphériques de 5% de CO₂ et 95% d’air à l’aide d’un contrôleur d’injection de gaz, et la température a été maintenue à 37 ° C avec un régulateur de température de l’air chaud et un insert de platine à température contrôlée. Voir Fotos et ^coll.18 pour plus de détails sur le système utilisé ici.
3. À l’aide d’un logiciel de contrôle de microscope approprié, créez un programme d’acquisition en accéléré qui recueille des images fluorescentes des zones d’intérêt une fois toutes les 10 minutes pendant 20 h.
   REMARQUE : Si une étiquette fluorescente verte est utilisée dans les cellules (p. ex., protéine fluorescente verte [GFP]), utilisez la quantité minimale de lumière d’excitation bleue requise pour visualiser les cellules afin de prévenir la phototoxicité. Les étiquettes rouges (par exemple, mCherry) et rouges lointaines (par exemple, DiD) ne semblent pas avoir ce problème potentiel en raison de l’excitation de longueur d’onde plus longue.

11. Immunomarquage des tranches de cerveau après microscopie accélérée

REMARQUE: Ce protocole d’immunomarquage est optimisé pour colorer les vaisseaux sanguins avec de la laminine et les noyaux avec du bisbenzimide. Utilisez des anticorps appropriés pour la ou les molécules d’intérêt souhaitées.

1. Aspirer le média sous l’insert membranaire à l’aide d’une pipette Pasteur et placer 1 mL de PFA à 2 % dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M sous l’insert et 1 mL sur le dessus de l’insert pour couvrir la tranche de cerveau. Laisser les tranches fixer pendant la nuit à 4 °C.
2. Retirez le fixateur sous l’insert membranaire et tout fixateur restant sur la tranche de cerveau (le fixateur a tendance à fuir à travers l’insert membranaire dans le puits inférieur).
3. Retirez l’insert avec les tranches du puits de 35 mm et placez-les dans un plat en plastique plus grand.
4. Préparez une assiette de 24 puits en ajoutant 350 μL de PBS dans autant de puits qu’il y a de tranches de cerveau (une tranche / puits lors de l’immunomarquage).
   1. À l’aide d’une fine spatule, retirez doucement l’agarose autour de la tranche de cerveau sans détacher la tranche de cerveau de l’insert membranaire. Assurez-vous que l’agarose se détache facilement du bord extérieur de la tranche de cerveau. Sinon, laissez l’agarose attachée à la tranche de cerveau.
   2. À l’aide d’un scalpel tranchant, couper à travers la membrane autour de la tranche de cerveau jusqu’à ce que la tranche avec la membrane sous-jacente soit libre du reste de l’insert. Ramassez la membrane avec la tranche de cerveau attachée, en utilisant une pince fine pour saisir la membrane, et placez-la dans un puits de la plaque de 24 puits dans PBS.
5. Rincer les tranches 3x avec du PBS pendant 1 h dans la chambre froide avec une agitation douce constante ou un balancement, de sorte que la tranche se déplace dans le puits.
6. Pendant le rinçage, préparez la solution d’anticorps primaire.
   1. Diluer l’antilaminine à 2 μg/mL dans PBSTG (voir tableau 1).
7. Retirer le PBS des puits et incuber pendant la nuit dans une solution d’anticorps primaires dans une chambre froide avec une agitation douce.
8. Après au moins 20 h d’incubation, aspirer la solution d’anticorps primaires et rincer les sections 3x pendant 1 h dans PBSTG.
9. Pendant le rinçage, préparer la solution d’anticorps secondaire.
   1. Diluer le fluorescent-GAM avec le fluorochrome spécifique nécessaire à une dilution de 1:200 dans PBSTG avec une concentration de bisbenzimide de 0,1 μg/mL.
   2. Retirer le PBSTG et incuber pendant une nuit dans une chambre froide en agitant dans la solution d’anticorps secondaires fluorescents.
   3. Retirer l’anticorps secondaire et rincer 2x sur 1 h dans PBSTG et 1x sur 1 h dans PBS.
   4. Laisser dans PBS jusqu’à ce que vous soyez prêt à monter sur des lames de microscope (section 5) et visualiser.

Discussion

Les étapes critiques du protocole pour l’injection de cellules dans le ventricule du mésencéphale (tectum optique) comprennent le fait de ne pas endommager les vaisseaux sanguins de la membrane chorio-allantoïdienne de l’œuf ou entourant l’embryon avant et pendant l’injection, bien que la membrane amnionique entourant immédiatement l’embryon puisse être doucement tirée et maintenue pour positionner la tête lors de l’injection des cellules dans le mésencéphale. L’amnion est relativement dur et peut être tiré avec une pince fine pour positionner la tête et la maintenir stable d’une main, pour l’injection de cellules de l’autre main dans le tectum optique, qui est la grande structure ronde au milieu du cerveau. Généralement, la viabilité des embryons injectés varie de 25% à 75%, en fonction de facteurs inconnus, et pratiquement chaque embryon qui survit contient au moins une petite tumeur dans le tectum optique. Les étapes critiques dans la génération de tranches de cerveau viables comprennent le buvard du tissu de l’excès de liquide afin que l’agarose adhère au cerveau pendant le découpage et pour garder les tissus et les tranches froids jusqu’à ce qu’ils soient placés sur l’insert membranaire. Comme différents types de cellules forment les sphéroïdes différemment (en vitesse et en taille), la densité cellulaire plaquée sur les plaques poly-HEMA et le temps avant la récolte des sphéroïdes doivent être optimisés pour chaque type de cellule.

Le travail ici n’a pas fait l’objet d’une étude longitudinale formelle de la viabilité des tranches de cerveau. Yang et al. ont utilisé des cultures de tranches de cerveau d’embryons de poussins similaires à celles utilisées ici et ont montré une bonne viabilité des tranches pendant au moins 7 jours¹⁶. Des travaux antérieurs ont montré que lorsque le tissu OT était conservé dans des milieux sous-optimaux, de nombreux noyaux pyknotiques apparaissaient dans le tissu, ce qui ne se produisait pas dans les tranches du travail ici. De plus, lorsque les tranches dégénèrent dans des conditions sous-optimales, les vaisseaux sanguins se fragmentent et apparaissent sous forme de rangées de sphères positives à la laminine (non représentées). Ainsi, bien que la viabilité ici n’ait pas été vérifiée par des méthodes telles que l’électrophysiologie ou l’expression active de la caspase-3, aucun des indicateurs de mort cellulaire observés dans des conditions de culture sous-optimales n’est apparu ici.

L’ergothérapie a été concentrée pour des expériences in vivo sur les tumeurs cérébrales parce que c’est la région la plus facilement injectable avec le plus gros ventricule. À E5, qui est le dernier jour où l’embryon est assez petit pour rester accessible au-dessus du jaune, les injections doivent être faites dans un ventricule, car toutes les régions du cerveau ne sont rien de plus qu’une mince zone ventriculaire. Néanmoins, ces injections aboutissent avec succès à des tumeurs intégrées avec des cellules qui envahissent le parenchyme cérébral. Parfois, les tumeurs résultantes se trouvent dans le cerveau antérieur ou le cervelet, mais ce n’est pas commun. Les tranches ex vivo de tectum optique E15 ont été principalement utilisées pour des expériences ici, de sorte que les résultats de co-culture ex vivo peuvent être corrélés avec les expériences d’injection in vivo . Cependant, les tranches du cerveau antérieur conviennent également et ont une plus grande surface et un ventricule très mince par rapport au tectum optique, ce qui pourrait rendre le cerveau antérieur plus approprié pour les co-cultures ex vivo qui ne sont pas corrélées avec des injections in vivo .

Il a été démontré ici que les injections in vivo , suivies d’une fixation tissulaire, d’une section vibrante de trancheuses de tissus et d’une immunocoloration de la laminine et d’autres marqueurs, ont abouti à des images à haute résolution de cellules GBM et de GSC dans les tissus cérébraux à proximité immédiate des vaisseaux sanguins. La capacité de déterminer les interrelations entre les cellules tumorales et les vaisseaux sanguins a été grandement facilitée par la création de rendus de volume 3D à partir de piles z de sections optiques confocales à l’aide du logiciel confocal et des instructions du fabricant. L’imagerie accélérée utilisant la microscopie à fluorescence à grand champ de cellules marquées GFP, mCherry et DiD était possible; Cependant, les cellules migrantes qui se trouvaient à proximité des sphéroïdes hautement fluorescents étaient parfois obscurcies par la « lueur » du sphéroïde. Cet effet indésirable peut être quelque peu minimisé en ajustant soigneusement les temps d’exposition pour la collecte d’images à grand champ. L’imagerie accélérée utilisant des piles z confocales au fil du temps (4D) a éliminé la lueur floue des sphéroïdes et a abouti à des cellules migratrices nettement définies avec un arrière-plan sombre. Cela n’a pas été décrit dans le protocole, mais a été réalisé de la même manière que l’imagerie accélérée à grand champ, qui a été réalisée alors que des tranches de cerveau étaient sur les inserts de membrane transparente dans une plaque en plastique à 6 puits. Bien que l’imagerie confocale en accéléré donne des images nettement plus claires des cellules individuelles et de leur comportement, une expérience en accéléré multipoint collectant des piles z de 10 plans z / point, à des intervalles de 10 minutes sur une période de 20 heures, est une utilisation intensive des galvanomètres à tête de balayage. Comme cela pourrait réduire considérablement la durée de vie des galvanomètres, cette méthode est utilisée judicieusement.

Bien que le système embryonnaire de poussin soit très approprié pour les expériences d’injection in vivo et de co-culture ex vivo qui étudient le comportement des cellules GBM, ce système modèle présente plusieurs limites. Comme pour tout système de xénogreffe, l’environnement dans lequel les cellules humaines sont implantées n’est pas le cerveau humain, mais le comportement des cellules GBM semble imiter celui des modèles de rongeurs et des patients humains. Après avoir effectué des expériences d’injection in vivo sur E5, les tumeurs sont normalement autorisées à se former pendant 10 jours, jusqu’à E15. Ce n’est clairement pas assez de temps pour étudier tous les aspects de la tumorigenèse et de l’invasion cellulaire. Cependant, il a été démontré ici que des tumeurs solides se forment dans le parenchyme cérébral, que les cellules interagissent et se réorganisent au sein de la tumeur, et qu’une invasion cérébrale significative se produit à la fois le long des vaisseaux sanguins et de manière diffuse dans ce laps de temps relativement court. Une autre limite du système embryonnaire in vivo de poussin est qu’il ne convient pas aux traitements médicamenteux ou autres en raison du grand jaune et du système circulatoire extraembryonnaire qui fonctionne pendant le développement de l’embryon de poussin. Les traitements médicamenteux liquides topiques entraîneraient une concentration très variable et inconnue dans le cerveau en raison de la diffusion loin de l’embryon dans la masse vitelline beaucoup plus grande. De même, l’injection intraveineuse de médicaments dans le système circulatoire extraembryonnaire très délicat fuirait ou diffuserait hors des vaisseaux sanguins et entraînerait également des concentrations inconnues dans le cerveau. C’est l’une des principales raisons pour lesquelles la méthode de culture ex vivo en tranches a été adoptée, afin que non seulement le comportement cellulaire puisse être observé et suivi par microscopie accélérée, mais aussi pour que les traitements qui ont réussi à modifier le comportement des cellules GBM dans une boîte⁴ puissent être testés dans un environnement de tissu cérébral plus pertinent.

Le développement du système modèle de tumeur cérébrale orthotopique de l’embryon de poussin est considéré comme un ajout important aux systèmes et outils disponibles pour l’étude de la formation de tumeurs GBM et du comportement cellulaire invasif. Les œufs de poule fécondés sont susceptibles d’être facilement disponibles dans la plupart des régions, ils sont peu coûteux par rapport aux rongeurs, il n’y a pas de coûts de soins aux animaux, les embryons sont très résistants et résistants aux infections (c.-à-d. que la plupart du travail est effectué sur une paillasse), les embryons sont hautement manipulables et peuvent être cultivés en culture sans coquille¹⁹, et les embryons de poussins ne sont pas considérés comme des animaux vertébrés et ne nécessitent donc pas l’approbation de l’IACUC par les directives des NIH (exigences institutionnelles peut varier). Ainsi, ces multiples avantages rendent le système embryonnaire de poussin très attractif si l’on limite leurs questions et expériences à celles qui en rentrent dans ses limites. Plusieurs études sur les cellules GBM ont été réalisées par d’autres en utilisant l’embryon de poussin, mais celles-ci ont presque exclusivement utilisé la membrane chorio-allantoïdienne (CAM) de l’embryon 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 et le bourgeon du membre ³⁰, et non le cerveau. Il y a également eu un rapport implantant un médulloblastome dans le cerveau du poussin sur E2³¹. Sans aucun doute, l’utilisation de l’embryon de poussin comme système modèle de xénogreffe orthotopique, comme décrit ici, devrait donner des résultats beaucoup plus significatifs pour la biologie tumorale du GBM humain que les études utilisant le CAM.

Bien que ces études aient seulement commencé à utiliser pleinement le système de modèle de tumeur cérébrale embryonnaire de poussin pour des études sur les cellules GBM humaines et le comportement de GSC, on espère que d’autres étendront les utilisations et trouveront d’autres applications potentielles. On pourrait imaginer que non seulement ce système découvrira des mécanismes qui régulent la formation de tumeurs GBM et le comportement cellulaire, mais permettra également des tests précliniques de médicaments et de substances spécifiques sur des cellules de patients spécifiques. Par exemple, si des cultures de tranches cérébrales étaient mises en place à l’avance, des cellules tumorales, des morceaux de résections tumorales chirurgicales ou des organoïdes GBM dérivés de patients³² pourraient être placés directement en co-culture ex vivo , et divers traitements pourraient être évalués en quelques jours. De même, des cellules de patients dissociées pourraient être injectées directement dans le mésencéphale E5 in ovo pour évaluer leur capacité à former des tumeurs et à envahir le parenchyme cérébral. Ainsi, on espère que les descriptions des méthodes et les résultats représentatifs ici faciliteront et encourageront une utilisation accrue de ce système hautement sous-utilisé pour la recherche sur le cancer du cerveau.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cm x 1 cm square hole paper punch	Birabira	N/A
1 mm biopsy punch pen	Robbins Instruments	20335
6 well insert plate (Corning Transwell)	Millipore Sigma	CLS3450
9" Disposable Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20C
15 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-12
24 well plate	Corning Costar	3526
50 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-9
Agar	Fisher BioReagents	BP1423-500	for embedding fixed brains
Alexafluor 488-conjugated GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-605-146
Alexafluor 647-conjugated GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-146
Aluminum foil	ReynoldsWrap	N/A
Ampicillin	Sigma Aldrich	A-9518
anti-integrin alpha-6 monoclonal antibody GOH3	Santa Cruz Biotechnology	sc-19622
anti-L1CAM monoclonal antibody UJ127	Santa Cruz Biotechnology	sc-53386
anti-laminin monoclonal antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	3H11
anti-nestin monoclonal antibody 10c2	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
anti-Sox2 monoclonal antibody E-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
B27 supplement without vitamin A	GIBCO	17504-044
bisbenzimide (Hoechst 33258)	Sigma-Aldrich	B2883	nuclear stain
Cell culture incubator	Forma		standard humidified CO2 incubator
Centrifuge	Beckman Coulter
Confocal microscope	Nikon Instruments	C2si+	With custom-made cell incubator chamber
Confocal microscope objective lenses	Nikon Instruments		Plan Apo lenses, except S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA objective lens for confocal time-lapse imaging
Confocal microscope software	Nikon Instruments	NIS Elements	Version 5.2
Curved foreceps	World Precision Intruments	504478
Curved scissors	Fine Science Tools
Curved spatula	Fisher Scientific	14-375-20
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue	KG-585 12R
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270
DiD far red fluorescent dye	Invitrogen	V22887	Vybrant DiD
DMEM	Sigma Aldrich	D5671
DMEM/F12	Sigma Aldrich	D8437
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-1L
egg incubator	Humidaire
electrical tape (10 mil thick/254 µm)	Scotch	N/A
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories	2701
Fast green FCF dye	Avocado Research Chemicals	16520
FBS	Gemini Bio-products	900-108
filter paper	Fisher Scientific
Gauze	Dynarex	3353
Glass Capillaries for microinjection	World Precision Instruments	TW100-4
Glycerol	Fisher BioReagents	BP228-1	for mounting media
GSCs (human glioblastoma stem cells)	Not applicable		Isolated from patient GBM specimens in Galileo laboratory in GSC media and then transduced with a GFP encoding lentiviral vector.  Cells used were between passage 10 and 30.
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-020-CV
Hemacytometer	Hausser scientific
Heparin	Fisher Scientific	BP2524-100
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H0887
Horse Serum (HI)	Gibco	26050-088
Human FGF-2	BioVision	4037-1000
Human TGF-α	BioVision	4339-1000
Inverted phase contrast microscope	Nikon Instruments	TMS	for routine viewing of cultured cells
KCl	Fisher Scientific	BP366
KH2PO4	Fisher Scientific	P284
Laboratory film	Parafilm
Labquake Shaker	LabIndustries	T400-110
L-Glut:Pen:Strep	Gemini Bio-products	400-110
Low-melt agarose	Fisher Scientific	BP1360	for embedding live brains
Matrix	Corning Matrigel	354234
Medium 199	GIBCO	11150-059
MEM	Corning	10-010-CV
Metal vibratome block
Micropipette tips (20, 200, 1,000 µL)	Fisherbrand
Micropipettors (20, 200, 1,000 µL)	Gilson
Microscope Coverglass (no. 1.5 thickness)	Fisherbrand	12544A
NaCl	Fisher Scientific	S271
NaH2PO4 + H2O	Fisher Scientific	S369
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
Normal goat serum	Millipore Sigma	526-M
N-propyl gallate	Sigma Aldrich	P3130	for mounting media
Parafilm	Parafilm
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS	Sigma Aldrich	P5493-1L
Pencil
Plain Microscope slides	Fisherbrand	12-550-A3
Plastic 35 mm Petri dish	Becton Dickinson	351008
pneumatic picopump	World Precision Intruments	PV830
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)  (poly-HEMA)	Sigma Aldrich	P-3932
razor blade- double edge	PACE		for cutting fixed brain slices
sapphire knife	Delaware Diamond Knives		for cutting live brain slices
Scalpel	TruMed	1001
Sodium cacodylate buffer 0.2 M pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11652
Specimen chamber for vibratome	custom-made
Stereo Dissecting Microscope	Nikon Instruments	SMZ1500	Equipped with epifluorescence
straight foreceps	World Precision Intruments	500233
straight scissors	Fine Science Tools
Sucrose	Mallinckrodt	7723
Time-lapse fluorescence microscope (widefield fluorescence)	Nikon Instruments	TE2000-E	With custom-made cell incubator chamber (see Fotos et al., 2006)
Tissue culture dish polystyrene 100 mm	Thermo Fisher Scientific	130182	for cell culturing
Tissue culture dish polystyrene 60 mm	Becton Dickinson	353004	for cell culturing
Transfer pipette	American Central Scientific Co.	FFP011
Transparent tape	Scotch
Triton X-100	Sigma Aldrich	T-8787
Trypsin (0.25%) + 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
U-118 MG human GBM cell line	ATCC	HTB-15	Cells were transduced with a lentiviral vector encoding the entire ectodomain sequence of the L1CAM adhesion protein and then with lentiviral vector pUltra-hot encoding mCherry.  Passage numbers are unknown.
Vacuum pump	Cole-Parmer	EW-07532-40	"Air Cadet"
Vibrating tissue slicer	Vibratome	3000	for cutting live and fixed brain slices