A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
פרופיילינג גנטי וסינון נשירה בקנה מידה גנומי לזיהוי מטרות טיפוליות במודלים עכבריים של גידול ממאיר במעטפת עצב היקפית
In This Article
Summary
פיתחנו גישה אונקוגנומית השוואתית חוצת מינים המשתמשת בניתוחים גנומיים ובמסכים גנומיים פונקציונליים כדי לזהות ולהשוות מטרות טיפוליות בגידולים הנובעים ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית וסוג הגידול האנושי המתאים.
Abstract
גידולי מעטפת עצב היקפית ממאירים (MPNST) נגזרים מתאי Schwann או מבשריהם. בחולים עם תסמונת רגישות הגידול נוירופיברומטוזיס סוג 1 (NF1), MPNST הם הממאירות הנפוצה ביותר וסיבת המוות המובילה. סרקומות נדירות ואגרסיביות אלה של רקמות רכות מציעות עתיד עגום, עם שיעורי הישרדות ללא מחלות במשך 5 שנים של 34-60%. אפשרויות הטיפול עבור אנשים עם MPNST מוגבלות באופן מאכזב, כאשר ניתוח מעוות הוא אפשרות הטיפול המובילה. טיפולים רבים שהיו בעבר מבטיחים כגון tipifarnib, מעכב איתות Ras, נכשלו קלינית. כמו כן, ניסויים קליניים שלב II עם erlotinib, אשר מכוון גורם גדילה אפידרמיס (EFGR), ו sorafenib, אשר מכוון קולטן גורם גדילה אנדותל כלי הדם (VEGF), קולטן גורם גדילה נגזר טסיות (PDGF), ו Raf, בשילוב עם כימותרפיה סטנדרטית, גם לא הצליחו לייצר תגובה בחולים.
בשנים האחרונות, שיטות סינון גנומיות תפקודיות בשילוב עם פרופיל גנטי של קווי תאים סרטניים הוכחו כיעילות לזיהוי מסלולי איתות ציטופלזמיים חיוניים ולפיתוח טיפולים ספציפיים למטרה. במקרה של סוגי גידולים נדירים, וריאציה של גישה זו המכונה אונקוגנומיקה השוואתית בין מינים משמשת יותר ויותר לזיהוי מטרות טיפוליות חדשות. באונקוגנומיקה השוואתית בין מינים, פרופיל גנטי וגנומיקה פונקציונלית מבוצעים במודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEM) והתוצאות מאומתות לאחר מכן בדגימות האנושיות הנדירות ובקווי התאים הזמינים.
מאמר זה מתאר כיצד לזהות מוטציות גנטיות של מניעים מועמדים בתאי MPNST אנושיים ועכבריים באמצעות ריצוף אקסומי שלם (WES). לאחר מכן אנו מתארים כיצד לבצע מסכי shRNA בקנה מידה גנומי כדי לזהות ולהשוות מסלולי איתות קריטיים בתאי MPNST של עכברים ובני אדם ולזהות מטרות ניתנות לסמים במסלולים אלה. מתודולוגיות אלה מספקות גישה יעילה לזיהוי מטרות טיפוליות חדשות במגוון סוגי סרטן אנושיים.
Introduction
גידולי מעטפת עצב היקפיים ממאירים (MPNST) הם גידולים אגרסיביים ביותר של תאי ציר המתעוררים בקשר עם תסמונת רגישות הגידול נוירופיברומטוזיס מסוג 1 (NF1), באופן ספורדי באוכלוסייה הכללית ובאתרים של הקרנות קודמות 1,2,3. חולי NF1 נולדים עם עותק פראי של הגן מדכא הגידול NF1 ואלל NF1 שני עם מוטציה של אובדן תפקוד. מצב זה של אי ספיקת הפלואים הופך את חולי NF1 לפגיעים למוטציה שנייה של אובדן תפקוד בגן NF1 הפראי שלהם, המעוררת גידולים. כאשר מוטציית NF1 "מכה שנייה" זו מתרחשת בתא בשושלת תאי Schwann, הגידול שנוצר הוא נוירופיברומה עורית המתעוררת בעור או נוירופיבר....
Protocol
לפני תחילת המחקרים, יש לבדוק ולאשר נהלים ופרוטוקולים של בעלי חיים לטיפול בווקטורים נגיפיים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) והוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית (IBC). הנהלים המתוארים כאן אושרו על ידי מועצות IACUC ו- IBC של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה ובוצעו על ידי אנשי ?.......
Representative Results
איור 5 מציג ציוני דלדול של גנים חיוניים לליבה (CEGs) שסומנו כ-TRUE בהשוואה לגנים שאינם CEG (שסומנו כ-FALSE) בכל קו תאים אנושי שנבדק. נקודות מייצגות log2 של ציוני דלדול קיפול עבור גנים בודדים, אשר משורטטים על פני תרשים תיבה המייצג את התפלגות הניקוד הכוללת. מבחן t של סטודנט שימש לבדיק?.......
Discussion
השיטות המפורטות המוצגות כאן פותחו כדי לחקור neoplasia מערכת העצבים ההיקפית ופתוגנזה MPNST. למרות שמצאנו שיטות אלה כיעילות, יש להכיר בכך שיש כמה מגבלות פוטנציאליות לשיטות שאנו מתארים כאן. להלן, נדון בכמה ממגבלות אלה ובאסטרטגיות אפשריות להתגבר עליהן במערכות מודל אחרות.
מצאנו כי ריצ.......
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ (R01 NS048353 ו- R01 NS109655 ל- S.L.C.; R01 NS109655-03S1 ל- D.P.J.), המכון הלאומי לסרטן (R01 CA122804 ל- S.L.C.), ומשרד ההגנה (X81XWH-09-1-0086 ו- W81XWH-12-1-0164 ל- S.L.C).
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioruptor Sonication System | Diagenode | UCD-600 | |
| CASAVA 1.8.2 | |||
| Cbot | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software | |||
| Citrisolve Hybrid | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Corning 96-well Black Microplate | Millipore Sigma | CLS3603 | |
| Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes | Diagenode | C30010009 | |
| dNTP mix | Clontech | 639210 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Elution buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’ | |||
| FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’ | |||
| GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ | HPLC purified | ||
| GraphPad Prism | Dotmatics | ||
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Illumina HiScanSQ | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| PLUS Transfection Reagent | Thermo Scientific | 11514015 | |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR1003G | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Qiagen Buffer P1 | Qiagen | 19051 | |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’ | |||
| RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’ | |||
| Titanium Taq polymerase | Clontech | 639210 | |
| Trimmomatic software | www.usadellab.org |
References
- Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
- Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L.
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved