Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

Özet

Tahlil, bakteri ve mantar erken biyofilm oluşumunu ölçmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem mikrotiter plate mikrobiyal biyofilm oluşumu için alt tabaka olarak kullanır ve biyofilm kristal viyole suşu kullanılarak görüntülenmiştir. Tahlil ya erken biyofilm oluşumu için bir kalitatif veya kantitatif sağlar.

Özet

Biyofilmler, tıbbi, endüstriyel ve doğal ortamlarda bulunabilir yüzeylere bağlı topluluklar, mikrop. Aslında, bir biyofilm yaşam muhtemelen çoğu ortamda mikropların büyüme baskın modu temsil eder. Olgun biyofilm birkaç farklı özellikleri var. Biyofilm mikropların genellikle toplum yapısı ve koruma sağlayan bir ekstrasellüler matriks ile çevrilidir. Bir biyofilm büyüyen Mikroplar genellikle sıvı dolu kanallar ile çevrili macrocolonies (binlerce hücre içeren) oluşan karakteristik bir mimariye sahip. Biyofilm yetiştirilen mikropların da, klinik olarak ilgili antibiyotik gibi antimikrobiyal ajanların bir dizi karşı direniş için kötü üne sahip.

Mikrotiter çanak testi, biyofilm oluşumu erken aşamalarında çalışma için önemli bir araçtır ve bu testte de, mantar biyofilm oluşumunu incelemek için kullanılmış olmasına rağmen, bakteriyel biyofilm çalışma için öncelikle tatbik edilmiştir. Bu testte, statik, toplu büyüme koşulları kullanır, çünkü genellikle akış hücresi sistemleri ile ilişkili olgun biyofilm oluşumu için izin vermez. Ancak, tahlil ve ekstrasellüler polisakkarit üretimi genler gibi biyofilm oluşumu başlangıcında (yani, kamçı, pili, adhezinleri siklik-di-GMP bağlayıcı ve metabolizmasında yer alan enzimler) için gerekli birçok faktör tespit etkili olmuştur. Ayrıca, yayınlanan iş mikrotiter yemekleri yetiştirilen biyofilm, bağışıklık sistemi etkileyiciler böyle bir antibiyotik hoşgörü ve direnç olgun biyofilm bazı özelliklerini geliştirmek olduğunu gösterir.

Bu basit mikrotiter çanak tahlil duvar ve / veya bir mikrotiter çanak alt bir biyofilm oluşumunu sağlar. Testin yüksek verim doğa genetik ekranlar için yararlı yanı sıra çeşitli büyüme koşulları altında birden fazla suşları tarafından test biyofilm oluşumu yapar. Bu testte Türevleri erken biyofilm oluşumu dahil olmak üzere, mikropların geniş bir yelpazede, değerlendirmek için kullanılan, ancak pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, stafilokoklar, enterokoklar, mikobakteriler ve mantarlar , sınırlı olmuştur.

Burada açıklanan protokol, model organizma Pseudomonas aeruginosa tarafından biyofilm oluşumunu incelemek için bu testin kullanımı üzerinde durulacak. Bu testte, biyofilm oluşumu ölçüde boya kristal viyole (CV) kullanılarak ölçülür. Ancak, diğer kolorimetrik ve metabolik lekeleri sayısı ölçümü için mikrotiter plate assay kullanarak biyofilm oluşumu bildirilmiştir. Mikrotiter plate testinin kolaylığı, düşük maliyet ve esneklik biyofilm çalışma için kritik bir araç haline getirmiştir.

Protokol

1. Biyofilm Büyüyen

1. Yabani tip Pseudomonas aeruginosa veya gece boyunca zengin bir ortamda mutant suş (yani LB) bir kültür büyütün
2. Biyofilm deneyleri için taze ortama aşırı gece kültür 1:100 sulandırınız. P. için standart bir biyofilm tahlil orta aeruginosa M63 minimal orta magnezyum sülfat, glukoz ve casamino asitleri (Tablo) ile desteklenmiş. Alternatif bir biyofilm teşvik etmek, daha az planktonik büyüme ve daha sağlam bir biyofilm, glikoz ve casamino asitler uyarır orta arginin tek karbon ve enerji kaynağı olarak değiştirilebilir.
3. 96 tabak içinde de başına seyreltme 100 mcL ekleyin. Kantitatif testleri için, her tedavi için genellikle 4-8 çoğaltmak kuyu kullanın.
4. Mikrotiter plate inkübe 4-24 saat 37 ° ° C.

2. Biyofilm Boyama

1. Inkübasyondan sonra, plaka ters çevirip sallayarak dışarı sıvı hücreleri dökümü.
2. Su küçük bir teknenin içinde yavaşça batığın plaka (yani, küvet gibi P1000 pipetmen dipleri için pipet ucu kutuları kullanın). Suyu dışarı sallayın. Bu işlemi ikinci kez tekrarlayın. Bu adım, bir sonraki adımda lekeli olabilir unattached hücreleri ve medya bileşenleri kaldırmak yardımcı olur ve arka plan boyama önemli ölçüde düşürür.
3. Mikrotiter plate her bir kuyunun su kristal viyole 0.1% çözelti 125 mcL ekleyin. Çözüm yaparken eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. CV, toz hidroskopik ve lekeleri hazır giyim, deri, vb gibi tartım sırasında dikkatli kullanın
4. Mikrotiter plate 10-15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
5. Yukarıda da belirtildiği gibi su dolu bir küvete daldırarak plaka 3-4 kez su ile durulayın, ayıklandığı ve tüm aşırı hücreleri ve boya plaka kurtulmak için bir yığın kağıt havlu üzerine şiddetle kurulayın.
6. Mikrotiter plate baş aşağı çevirin ve birkaç saat veya gece boyunca kurumaya.
7. Zaman kuru kalitatif testlerde, kuyular fotoğrafı olabilir.

3. Biyofilm miktarının

1. CV çözünür mikrotiter plate her bir kuyunun su% 30 asetik asit 125 mcL ekleyin.
2. Mikrotiter plate 10-15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
3. Yeni bir düz dipli mikrotiter çanak çözündüğünü CV 125 mcL aktarın.
4. Sayısal olarak bir plaka okuyucu boş olarak su% 30 asetik asit kullanılarak 550 nm'de absorbans.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1 biyofilm oluşumu deneyleri için Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens ve Staphylococcus aureus için yapılan temsili bir sonuç göstermektedir. (A) P. aeruginosa (8 saat, 37 ° C) bir biyofilm ile iyi bir yan görünümü. (B) P. biyofilm ile iyi bir yan görünüm fluorescens (6 saat, 30 ° C). (C) biyofilm yukarıdan aşağıya görünüm S. kurdu düz bir alt mikrotiter plate aureus (iki kuyu, 24 saat, 37 ° C) P.. aeruginosa ve P. fluorescens hem hareketli organizmalar ve hava-sıvı arayüzü biyofilm oluşturmaktadır. S. aureus olmayan hareketli ve iyi altındaki bir biyofilm oluşturmaktadır.

Tartışmalar

Bu yöntem, çok çeşitli mikrobiyal türlerin kullanım için modifiye edilebilir. Non-motil mikropların genellikle kuyuların dibine bağlı hareketli mikropların genellikle, duvarlar ve / veya kuyuların dipleri bağlı. Biyofilm oluşumu (yani, büyüme ortamı, sıcaklığı, kuluçka süresi) için optimal koşulları her mikrop için ampirik olarak tespit edilmelidir. Ben her tür ya da durum (4-8) birden fazla performans için her bir plaka üzerinde bir negatif kontrol çoğaltır ve olumlu bir kontrolü de ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 X M63			Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
K2HPO4	Fisher Scientific	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A5132
Magnesium sulfate	Fisher Scientific	M63-500	Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Glucose	Fisher Scientific	D16-3	Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Casamino acids	BD Biosciences	223050	Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Arginine	Sigma-Aldrich	A5131	Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
Microtiter plates	BD Biosciences	353911	Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated.
Microtiter plate lids	BD Biosciences	353913	The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water.
Crystal violet	Sigma-Aldrich	229641000	Prepare as a 0.1% solution in water.