Microtiter 디시 Biofilm 형성 분석

요약

분석은 박테리아와 곰팡이의 초기 biofilm 형성을 측정하는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 미생물의 biofilm 형성에 대한 하층으로 microtiter 접시를 사용하고, biofilm은 크리스탈 바이올렛 스트레인을 사용하여 시각입니다. 분석도 초기 biofilm 형성에 대한 질적 양적 분석 또는를 제공합니다.

초록

Biofilms, 의료 산업 및 자연 환경 설정에서 찾을 수 표면에 부착된 미생물의 커뮤니티입니다. 사실, biofilm의 생활은 대부분의 환경에서 미생물의 성장의 predominate 모드를 나타냅니다. 성숙 biofilms 몇 가지 뚜렷한 특징이있다. Biofilm의 미생물은 일반적으로 구조와 지역 사회에 보호 기능을 제공합니다 세포외 기질에 둘러싸여 있습니다. biofilm의 성장 미생물은 일반적으로 유체 - 채워진 채널 둘러싸인 macrocolonies (수천개의 세포를 포함)로 구성된 특성 아키텍처를했습니다. Biofilm - 재배 미생물은 또한 임상 관련 항생제를 포함하여 항균 대리인의 범위에 그들의 저항에 대한 악명 있습니다.

microtiter 접시 분석은 biofilm 형성의 초기 단계의 연구를위한 중요한 도구이며,이 분석은 또한 곰팡이 biofilm 형성을 연구하는 데 사용되었지만, 세균성 biofilms 연구 주로 적용되었습니다. 이 분석은 정적, 배치 성장 조건을 사용하기 때문에, 그것은 일반적으로 흐름 전지 시스템과 관련된 성숙한 biofilms의 형성에 대한 허용하지 않습니다. 그러나, 분석이 잘 세포외 다당류의 생산에 관련된 유전자와 같은 biofilm 형성의 개시 (즉, flagella, 필리, adhesins, 주기적 - DI - GMP 바인딩과 대사에 관여하는 효소)에 필요한 여러 가지 요인을 식별에 효과가있다. 또한 게시된 작품은 microtiter 요리 재배 biofilms은 면역 시스템 effectors 이러한 항생제 내성 및 저항을 성숙 biofilms의 일부 속성을 개발 할 것을 나타냅니다.

이 간단한 microtiter 접시 분석은 벽 및 / 또는 microtiter 접시의 바닥에 biofilm의 형성 수 있습니다. 분석의 높은 처리량 자연은 유전자 화면에 유용합니다뿐만 아니라, 다양한 성장 조건 하에서 여러 변종에 의해 시험 biofilm 형성합니다. 이 분석의 변종은 미생물을 포함한 다양한위한 초기 biofilm 형성을 평가하는 데 사용되지만 pseudomonads, 비브리오 cholerae, 대장균, staphylocci, enterococci, mycobacteria 및 곰팡이, 이에 국한되지 않음되었습니다.

프로토콜 여기에서 설명한에서, 우리는 모델 유기체 녹농균의 biofilm 형성을 연구하기 위해이 분석의 사용에 초점을 맞출 것이다. 이 분석에서, biofilm 형성의 범위는 염료 크리스탈 바이올렛 (CV)를 사용하여 측정됩니다. 그러나, 다른 colorimetric 및 신진 대사 얼룩의 번호는 microtiter 접시 분석을 사용하여 biofilm 형성의 부량에 대한보고되었습니다. microtiter 접시 분석의 용이성, 저렴한 가격과 유연성은 biofilms 연구를위한 중요한 도구가되었다.

프로토콜

1. Biofilm 성장을

1. 야생 형 녹농균이나 풍부한 매체 박 이상의 돌연변이 스트레인 (즉, LB)의 문화를 성장
2. biofilm의 assays를위한 새로운 매체로 통해 밤 문화를 희석 1:100. P.위한 표준 biofilm 분석 매체 녹농균이라는 박테리아는 황산 마그네슘, 포도당 및 casamino의 지방산 (표 참조) 보충 M63 최소한의 매체입니다. 대안 biofilm - 증진 적은 planktonic의 성장과보다 강력한 biofilm, 포도당 및 casamino의 지방산을 자극 매체는 유일한 탄소 및 에너지원으로 아르기닌으로 대체 될 수 있듯이.
3. 96 잘 접시에 잘 희석 당 100 μL를 추가합니다. 정량 assays을 위해, 우리는 일반적으로 각각의 치료를 위해 4-8 복제 우물을 사용합니다.
4. 37 4-24 시간에 대한 microtiter 접시를 품어 ° C.

2. Biofilm 스테 이닝

1. 부화 후 판을 뒤집어하고 액체를 흔들어하여 세포를 덤프.
2. 물이 작은 욕조에 부드럽게 잠수함 접시 (즉, 욕조 등 P1000 pipetmen에 대한 피펫 팁 상자의 바닥을 사용하여). 물을 흔들어 봐. 이 과정을 다시 한 번 반복합니다. 이 단계는 다음 단계에서 스테인드 수있는 무소속의 세포와 미디어 구성 요소를 제거하는 데 도움이, 그리고 크게 배경 얼룩을 절감.
3. microtiter 접시 각 잘하기 위해 물에 크리스탈 바이올렛의 0.1 % 용액 125 μL를 추가합니다. 솔루션을 제작하는 동안 장갑과 실험 복을 착용하십시오. 가루가 hydroscopic하고 쉽게 얼룩의 의류, 피부 등을 그대로 CV를 무게 경우주의하시기 바랍니다
4. 10-15 분 상온에서 microtiter 접시를 품어.
5. 위에서 설명한대로 물을 욕조에 잠수함이 잠수하여 물 접시 3-4 회 씻어 밖으로 흔들 모든 초과 세포와 염료의 번호판을 제거하기 위해 종이 타월의 스택에 적극적으로 얼룩.
6. 거꾸로 microtiter 접시를 켜고 몇 시간 또는 하루에 대한 건조.
7. 때 건조 질적 assays 들어, 우물이 사진 수 있습니다.

3. Biofilm을 Quantifying

1. 이력서 solubilize하는 microtiter 접시 각 잘 물을 30 % 초산 125 μL를 추가합니다.
2. 10-15 분 상온에서 microtiter 접시를 품어.
3. 새로운 평면 바닥 microtiter 접시에 solubilized CV 125 μL을 전송합니다.
4. 빈으로 물 30 % 아세트산을 사용하여 550 nm의에서 플레이트 판독기에서 흡광도를 계량.

4. 대표 결과 :

그림 1. 녹농균, 모나스 fluorescens 및 포도상 구균에 대한 수행 biofilm 형성 assays에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. P.의 녹농균이라는 박테리아 (8 시간, 37 ° C)의 biofilm와 우물 (A) 측면 볼 수 있습니다. P.의 biofilm와 우물 (B) 측면보기 fluorescens (6 시간, 30 ° C). (C) biofilm의 하향식보기 S.에 의해 형성 평면 바닥 microtiter 플레이트의 구균 (투 웰스, 24 시간, 37 ° C). P. 녹농균이라는 박테리아와 P. fluorescens 모두 운동성이있는 유기체이며, 공기 - 액체 인터페이스에서 biofilm을 형성. S. 구균이 아닌 운동성이있는이고 잘 하단에 biofilm을 형성.

토론

이 방법은 미생물 종의 다양한 사용하기 위해 수정할 수 있습니다. 비 운동성이있는 미생물은 일반적으로 우물의 바닥을 준수하면서 운동성이있는 미생물은 일반적으로, 벽 및 / 또는 우물의 바닥을 준수. biofilm 형성 (즉, 성장 매체, 온도, 부화의 시간)에 대한 최적 조건은 각각의 미생물에 대해 경험적으로 결정되어야합니다. 나는 각각의 접시에 부정적인 컨트롤을 여러 개 수행하는 각각의 변형...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 X M63			Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
K2HPO4	Fisher Scientific	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A5132
Magnesium sulfate	Fisher Scientific	M63-500	Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Glucose	Fisher Scientific	D16-3	Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Casamino acids	BD Biosciences	223050	Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Arginine	Sigma-Aldrich	A5131	Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
Microtiter plates	BD Biosciences	353911	Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated.
Microtiter plate lids	BD Biosciences	353913	The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water.
Crystal violet	Sigma-Aldrich	229641000	Prepare as a 0.1% solution in water.