Co-uyarıcı Sinyal Abluka Alloantigen Uyarım İnsan periferik kan mononükleer hücreleri içinde Alloantigen özel anerji indüksiyonu

Özet

Bu yazıda, insan periferik kan mononükleer hücrelerinde alloantigen özel anerji ikna etmek için basit bir teknik anlatılmaktadır. Tekniği olmayan alloreactive donör hücreleri oluşturmak için klinik olarak uygulanabilir. İnfüzyon bu hücrelerin bağışıklık sulandırıldıktan geliştirmek ve allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu sonrası toksisite azaltabilir.

Özet

Allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu (AHSCT), doğumsal ve edinsel hematolojik hastalığı olan birçok hasta için tedavi en iyi şansı sunar. Ne yazık ki, sağlıklı bir hasta dokuları tanımak ve zarar alloreactive donör T hücrelerinin nakli Graft-versus-Host Hastalığı ^(GvHD 1) neden olabilir. Bir meydan okuma başarılı AHSCT donör T hücrelerinin, özellikle bağışıklık sulandırıldıktan ve nüks önleme yararlı etkileri ilişkili bozulma olmadan GvHD önlenmesidir. GvHD donör T hücrelerinin, kök hücre greft ya da farmakolojik immünosupresyon yönetimi tarafından non-spesifik tükenmesi ile önlenebilir. Ne yazık ki bu yaklaşımlar artış enfeksiyon ve hastalık nüksü ^2-4. Alternatif bir strateji alloreactive donör T hücrelerinin nakli öncesinde alıcı antijen sunan hücreler (APC), allostimulation sonra seçici tüketmek için. Bu allodepletion stratejilerin Erken klinik çalışmalarda aşırı GvHD ^{5, 6} olmadan HLA-uyumsuz HSCT sonra bağışıklık sulandırıldıktan geliştirdi. Ancak, bazı allodepletion teknikleri uzman alıcı APC üretim ^{6, 7} gerektiren ve bazı yaklaşımlar-hedef dışı etkileri patojen donör-spesifik T hücreleri ⁸ ve CD4 tükenmesi de dahil olmak ^{üzere düzenleyici} hücreleri 9 T olabilir Bir alternatif bir yaklaşım alloreactive donör T hücrelerinin inaktivasyon alloantigen-özel düşük yanıt indüksiyon yoluyla. CD28 aracılı ortak stimülasyon sinyalleri ¹⁰ abluka sağlarken alıcı APC ile uyarıcı donör hücreleri tarafından sağlanır. Patojen ve tümör ilişkili antijen T hücre yanıtları in vitro ¹¹ korurken Bu "alloanergization" yaklaşımı 1-2 günlükler alloreactivity azaltır . 2 alloanergized donör T hücrelerinin tarihsel kontrol alıcıları daha hızlı immün sulandırıldıktan, birkaç enfeksiyonlar ve daha az şiddetli akut ve kronik GvHD HLA-uyumsuz HSCT sırasında veya sonrasında infüze edildiği 1 devam eden klinik pilot çalışmalar tamamlanmış ve istihdam stratejisinin başarıyla olmuştur HLA-uyumsuz nakli ¹² unmanipulated. İşte biz, HLA-uyumsuz ilgisiz stimülatörü PBMC alloanergized olan periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) üretimi için mevcut protokol açıklar. Alloanergization ligandlar monoklonal antikor varlığı allostimulation elde CD28 aracılı üzere onaylanmıştır engellemek için B7.1 ve B7.1. Bu teknik uzman Stimülatörü APC üretim gerektirmez ve sadece bir tek ve nispeten kısa ex vivo inkübasyon adım gerektiren gerçekleştirmek için basit değildir. Gibi yaklaşım kolayca donör T hücreleri azalır alloreactivity ancak aşırı GvHD olmadan bağışıklık sulandırıldıktan geliştirmek için AHSCT ayarı evlatlık transferi için istinat patojen-spesifik bağışıklık oluşturmak için klinik kullanım için standart olabilir.

Protokol

1. PBMC, hazırlanması

1. Iyi aseptik teknik ve evrensel önlemler Usul Bu protokolün yürütülmesi sırasında uyulması gerekir.
2. Ficoll-Hypaque kullanarak yoğunluk gradiyenti santrifüj sağlıklı gönüllü donörlerden PBMC izole edin. Alternatif Kriyoprezerve PBMC yeniden hayata olabilir.
3. Hemasitometre kullanarak Tripan Blue ile boyandıktan sonra canlı PBMC güvenin. 15 mL Falcon tüp içinde 1 milyon canlı hücre / ml 'lik bir konsantrasyon tam bir kültür ortamı içinde yeniden süspanse hücre (CM).

2. Toplu Alloanergizing Co-kültür Ayarlama

1. Iki ayrı vericilerden PBMC'ler alloanergization kültürleri kurmak için ihtiyaç vardır. Yanıt veren ve başka bir donör hücreleri stimülatörü (Birinci Taraf uyarıcısı olarak adlandırılır) olarak hizmet verecek bir donör hücreleri hizmet edecektir.
2. 1 milyon / ml, 15 ml Falcon tüp içinde 10 milyon Stimülatörü PBMC ve engellemek üzere onaylanmıştır anti B7.2 antikorlar anti-B7.1 ve 100mg 100mg eklemek. Yavaşça tüp ajitasyon ve 30 dakika inkübe edin. Bu ve sonraki tüm adımları için Kuluçka şartları 37 ° C /% 5 CO ₂ / -% 80 nem
3. Işın tedavisi Stimülatörü PBMC (3.3 Gy) ve T-25 50cm eklemek ^{3 hücre kültürü şişesi. "Toplu alloanergizing ko-kültür" şişesi Etiket.}
4. Balon cevaplayıcı PBMC 10ml (1 milyon / ml CM).
5. 72 saat boyunca, her biri, anti-B7.1 ve anti B7.2 antikor bir başka 100mg dik bir kuluçka şişesi yerleştirerek önce ekleyin ve hafifçe karıştırın

3. Toplu Kontrol Co-kültür Ayarlama

1. 15 mL Falcon tüp içinde 10 milyon Stimülatörü PBMC (1 milyon / ml).
2. Işın tedavisi 10 milyon Stimülatörü PBMC (3.3 Gy) ve 50cm ³ Hücre kültürü şişesi. Label "Toplu kontrol ko-kültür".
3. 1 milyon / ml balona CM cevaplayıcı hücre, 10 ml ve 72 saat boyunca dik bir kuluçka şişesi yerleştirerek önce hafifçe karıştırın.

4. Co-uyarıcı Engellere Etkinlik Tedbir İlköğretim Karışık Lenfosit Reaksiyonu (MLR) Ayarlama

1. Kostimülatör ablukanın etkinliği toplu alloanergizing ve kontrol ko-kültür hücre kullanarak bir ilköğretim MLR ölçülür.
2. Birincil MLR toplu kültürler kurulmuş olduğunu, aynı gün kurulur
3. İlk etiketi bir U ölçülecek (plakalar sonra Gün 4, 5 ve 6) üç zaman noktalarının her biri için 96 plaka "Birincil MLR" oturaklı.
4. Toplu kontrolü ve 15 mL Falcon tüpleri içine her ko-kültür alloanergizing Durusu 5ml.
5. Her Falcon tüp her bir plaka üzerinde üç nüsha kuyu içine hücre süspansiyonu Pipet 200ml. Etiket bu kuyulardan ortak kültürler alloanergizing toplu kontrol co-kültürler ve toplu hücreler için "CSB" hücreler "hayır kostimülatör abluka (CSB)"
6. Negatif kontrol olarak her plaka 6 kuyu CM 200ml ekleyin. 200ml PBS buharlaşmayı azaltmak için boş kuyular eklenir. Inkübatör yerleştirin plakalar.

5. Etkinlik, Alloanergization Tedbir İkincil MLR Ayarlama

72 saat sonra, kalıntı alloresponses alloanergized PBMC'ler ikincil MLR ölçülür. Toplu alloanergizing ortak kültür ve toplu kontrol ko-kültür hem de ikincil MLR, hücre ışınlanmış allostimulator hücre ile yıkanır ve restimulated
1. Ikincil MLR etiket kurmak için bir U her ölçülecek (kurduktan sonra Gün 3, 5 ve 7) üç puan için 96 plaka "İkincil MLR" oturaklı.
2. Toplu kontrolü her 5 ml'lik çıkarın ve ortak kültürler alloanergizing, 15 mL Falcon tüpler aktarmak ve 2000 yılında 5-10 dakika santrifüj dikkatle süpernatantı rpm.Aspirate, pelet bozabilir, CM 10 ml ekleyin ve tekrar hücreler santrifüj. Bu yıkama adımı yineleyin.
3. 1mL CM hücrelerin tekrar Tripan mavisi, canlı hücreler kullanarak sayın ve 1 milyon canlı cevaplayıcı hücre / mL hücre konsantrasyonunu ayarlamak.
4. Her Falcon tüp her plaka üç nüsha kuyu içine hücre süspansiyonu Pipet 100 ml. Bu kuyular "İlk Partisi (FP) allorestimulation" Etiket
Pipet 100 ml hücre süspansiyonu bu kuyulardan "CD3/28 stimülasyon"
5. Alloanergizing ve kontrol kültürleri ilk parti stimülatörü PBMC'ler sağlamak için kullanılan aynı sağlıklı bir donörden (veya Kriyoprezerve PBMC diriltmek) taze kan PBMC izole, ikincil MLR stimülatörü hücreleri hazırlamak.
6. 1 milyon / ml ve ışın tedavisi (3.3Gy) bir konsantrasyon FP donör hücre Askıya Alma
7. Kuyuları "FP allorestimulation" ışınlanmış stimülatörü hücrelerinin 100 ml ekle
8. Pozitif kontrol için 1 ml her CD3 ve CD28 monoklonal antikorlar ve CM 98mL, "CD3/28 stimülasyon" etiketli kuyulara ekleyin. Her plaka üzerinde bir negatif kontrol ve PBS 200ml gibi boş kuyulara 6 kuyu CM 200 ml ekleyin. Inkübatör tabak koyun.

6. Ölçüm Alloanergization, Özgünlük

1. Alloanergization özgüllüğü ikincil bir "üçüncü taraf" sağlıklı donör (yani Birinci Parti farklı bir donör) elde ışınlanmış PBMC ile stimülasyon sonra tamamlanmış alloanergizing ve kontrol ko-kültür alınan cevaplayıcı hücrelerin çoğalması ile karşılaştırarak tarafından belirlenir MLR.
2. Etiket üç 96 kuyucuğu "İkincil MLR Özgünlük" Gün 3, 5 ve 7.
3. Toplu kontrolü her 5 ml'lik çıkarın ve ortak kültürler 15 mL Falcon tüpleri transferi ve 2000 rpm'de 5-10 dakika santrifüj alloanergizing. Süpernatantı dikkatle aspire pelet bozabilir, CM 10 ml ekleyin ve tekrar hücreler santrifüj. Bu yıkama adımı yineleyin.
4. 1mL CM hücrelerin tekrar Tripan Mavi boyama kullanarak sayımı ve hücre konsantrasyonu 1 milyon canlı cevaplayıcı hücre / mL ayarlayabilirsiniz.
5. Taze kan, yeni bir sağlıklı bir donörden (ya da Kriyoprezerve PBMC diriltmek) PBMC izole, ikincil MLR için üçüncü taraf stimülatörü hücreleri hazırlamak. Pipet hücre süspansiyonu her Falcon tüp her plaka üç nüsha kuyu içine 100 ml. Bu kuyular "TP allostimulation" Etiket
6. 1 milyon / ml ve ışın tedavisi (3.3 Gy) TP donörden PBMC Askıya Alma
7. Kuyular etiketli "TP allostimulation" ışınlanmış TP stimülatörü hücreleri 200ml ekle
8. Alloanergization özgüllüğü cevaplayıcı gibi CMV gibi bulaşıcı bir patojen ile stimülasyon sonra tamamlanmış alloanergizing ve kontrol ko-kültür alınan hücrelerin yayılması karşılaştırılarak tespit edilebilir. Bu adım için daha önce CMV lizat göstermiştir proliferatif yanıtları vericilerden cevaplayıcı PBMC kullanmak esastır.
9. Etiket üç 96 kuyucuğu "İkincil MLR CMV" Gün 3, 5 ve 7.
10. CMV tepkileri ölçmek için ikincil MLR responder hücreleri hazırlamak için, toplu kontrolü her 5 ml transferi ve 15 ml tüpler için ortak kültürler alloanergizing ve yıkayın, daha önce açıklandığı gibi, 1 milyon hücre / ml CM sayımı ve tekrar süspansiyon 3 kuyu içine her bir plaka üzerinde bir hücre süspansiyonu her Falcon tüpü Pipet 100 ml.
11. Kuyulara 100ul CM CMV lizat 0,1 ml ekleyin
12. Tüm plaka üzerinde bir negatif kontrol olarak 6 kuyu CM 200 ml ekleyin ve boş kuyular PBS 200ml ekleyin. Inkübatör tabak koyun.

7. İlköğretim ve Ortaöğretim MLRS ölçüm Silahların Yayılmasının Önlenmesi

1. Yanıtlayıcı hücre proliferasyonu, birincil ve ikincil MLRS timidin birleşme yöntemi ile ölçülür. İlköğretim MLR plakaları kurmak ve 3, 5 ve 7 Gün Ortaöğretim MLR plakaları sonra kurulur sonra Silahların Yayılmasını Önleme Günü 4, 5 ve 6 ölçülür.
2. Tritiated timidin 1mCi hasat kuyulardan 16 saat önce eklendi
3. Tritiated timidin eklenmesinden sonra, plaka sonra Tomtec hasat (veya benzeri) kullanarak bir filtre elemanı üzerine hasat further16 saat inkübe edilir. Hava bir saat sonra örnek bir torba içinde yer 5 ml sintilasyon sıvı ve conta eklemek için kuru filtermat. Karşı ya da benzer bir Wallac Micro beta sintilasyon plaka okuyun.

8. Birincil MLR Co-uyarıcı Abluka Etkinlik hesaplanması

1. Birincil alloresponses yüzde inhibisyonu (PI), 100 olarak hesaplanmaktadır x [allostimulation kuyuları cpm (toplu alloanergy ko-kültür PBMC) ortalama ortalama allostimulation kuyuları cpm (toplu kontrol ko-kültür PBMC)}
   

9. İkincil MLR Alloanergization Etkilerinin Hesaplanması

Ikincil alloresponses PI olarak hesaplanır.

10. İkincil MLR Alloanergization, Özgünlük hesaplanması

1. CD3 ve CD28 ile hücreleri restimulation sonra, TP allostimulators ya da bu uyaranlara CMV antijen, yanıtların PI de şu formül kullanılarak hesaplanır olabilir. Bu alloanergization sürecinin özgüllüğü bir ölçü verir

11. Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Transplantasyonu Sonrası Klinik Kullanım (HSCT) Alloanergized Donör PBMC oluşturuluyor

1. Alloanergized donör PBMC yukarıda özetlenen protokolünü kullanarak HLA-uyumsuz allojeneik HKHT sonrası klinik kullanım için üretilen olabilir
2. Klinik kullanım için hücreler oluştururken, cevaplayıcı hücre nakli öncesinde HSCT alıcı HSCT donör ve Stimülatörü hücre elde edilmektedir.
3. Klinik kullanım için PBMC oluştururken, tüm adımları akredite edilmiş kök hücre işleme tesisleri Good Manufacturing Process koşullar altında yapılmaktadır.
4. Ek kalite kontrol testleri de dahil olmak üzere endotoksin deneyleri ve klinik kullanım için hücrelerin serbest bırakılması için önce güvenlik kriterlerini karşılamak için gram boyama ve kültür yapılır

12. Temsilcisi Sonuçlar

HLA-uyumsuz Stimülatörü ve cevaplayıcı hücre birincil MLR kostimülatör abluka varlığı% 30 civarındadır (standart sapma -% 10, ortalama + / + /) 5. Gün cevaplayıcı PBMC ortalama alloproliferation azaltır kostimülatör ablukanın yokluğunda kontrolü birincil MLR. , D5 - Bu, yaklaşık% 70 (% 10 + /) birincil alloproliferation ortalama inhibisyonuna eşdeğerdir. Şekil 1 A ve B.

Gün 5 ikincil MLR, FP alloanergized PBMC alloproliferation genellikle% 10-15 (+ / -% 10) ortalama% 85-90 yayılması inhibisyonu (kontrol PBMC eşdeğer görülen + / - 10 %), Şekil 2A ve B. Bu alloanergized PBMC FP allostimulators hiporesponsif olduğunu göstermektedir.

kontrast alloanergized PBMC korumak, TP allostimulators ve CMV lizat (CMV reaktif donörler). Bu alloanergized PBMC bu düşük yanıt FP alloantigens özgü olduğunu göstermektedir.

Şekil 1. A. Yokluğunda, HLA-uyumsuz Stimülatörü ve cevaplayıcı periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) kullanarak İlköğretim Karışık Lenfosit Reaksiyon veya monoklonal anti-B7.1 ve B7.2 kullanarak kostimülatör ablukanın varlığı Silahların Yayılmasının Önlenmesi (timidin kuruluş tarafından belirlenen) antikorlar. Sonuçlar benzersiz Stimülatörü-cevaplayıcı çiftleri kullanılarak 8 temsilcisi deneyler için (+ /-SD) anlamına olarak gösterilir. B. Monoklonal anti-B7.1 ve B7.2 antikorları kullanarak kostimülatör ablukanın huzurunda yapılan birincil MLRS alloproliferation Yüzde inhibisyonu. Sonuçlar Şekil 1A tasvir benzersiz aynı 8 Stimülatörü-cevaplayıcı çiftleri için ortalama (+ /-SD) olarak gösterilmiştir.

Şekil 2. A. Silahların Yayılmasının Önlenmesi (timidin kuruluş tarafından belirlenir). Sonuçlar Şekil 1'de tasvir 8 benzersiz Stimülatörü-cevaplayıcı çiftleri için ortalama (+ /-SD) olarak gösterilmiştir. B. Cevapçı hücre yokluğu (kontrolü PBMC) veya kostimülatör abluka (alloanergized hücre) varlığında yapılan birincil MLRS ışınlanmış ilk parti uyarıcıları restimulated ikincil MLRS İlk Partisi alloproliferation Yüzde inhibisyonu. Sonuçlar Şekil 1 ve Şekil 2A tasvir 8 benzersiz Stimülatörü-cevaplayıcı çiftleri için ortalama (+ /-SD) olarak gösterilmiştir.

Tartışmalar

Co-uyarıcı ablukanın varlığı allostimulation yoluyla donör PBMC alloantigen özel düşük yanıt, ya da anerji indüksiyon, azaltılmış alloreactivity donör PBMC üretimi için basit bir tekniktir. Biz laboratuvar süreci geliştirdik ve şu anda HLA-uyumsuz allojeneik HKHT sonra infüzyon için azaltılmış alloreactivity donör PBMC oluşturmak için klinikte stratejisi uyguluyoruz. Böyle bir tedavi kullanmanın amacı, aşırı toksisite olmadan bağışıklık sulandırıldıktan geliştirmektir. Stratejisinin mevcut klinik uygulama allojeneik HKHT ayarı ile sınırlı olmasına rağmen, bu yaklaşım, katı organ nakli ya da otoimmün koşulları reddedilmesi gibi istenmeyen T hücre yanıtları, doku hasarına neden olduğu diğer ayarları uygulanabilir.

Birkaç reaktifler alloanergization ko-kültür işlemi sırasında CD28 aracılı ko-uyarıcı sinyalleri bloke için kullanılabilir. Burada CD28 (B7.1 ve B7.2) ligandlar yöneltilen dereceli klinik humanize fare monoklonal antikorlar kullanarak mevcut protokol açıklar. Sigara klinik sınıf fare anti-insan B7.1 ve B7.2 antikorlar çeşitli üreticilerin ticari olarak kullanılabilir. Alternatif olarak, füzyon proteini Sitotoksik T Lenfosit Antijen (CTLA) 4-İmmünglobulin (Ig) alloanergization işlemi sırasında CD28 üzere onaylanmıştır engellemek için kullanılabilir. IgG Fc gama reseptör bağlantılı CTLA4 molekülünün ekstrasellüler kısmını oluşur CTLA4 Ig, B7.1 ve B7.2 yüksek afinite ile bağlanır. CTLA4 Ig kullanımı, insan PBMC'ler alloanergization benzer etkinlik ve özgüllük sonuçlanır.

Alloanergization tekniği gerçekleştirmek için basit. Taze ya da önceden Kriyoprezerve Stimülatörü PBMC'ler sürecin sonucu anlamlı farklılıklar ile kullanılabilir. Hiçbir hücre sıralama prosedürleri ile sadece bir tek nispeten kısa ex vivo inkübasyon adım için ihtiyacı için potansiyel klinik bir ölçekte uygulanacak strateji nispeten kolay hale getirir infüzyon önce hücre ölümü ve hücre bakteriyel kirlenme en aza indirir.

Bir sınırlama tanımlayan bir yaklaşım (ve seçici insan hücrelerinin alloreactivity azaltmak için diğer yaklaşımlar) artık alloreactivity belirlemek için gerçek zamanlı bir testin olmaması. Silahların Yayılmasının Önlenmesi testleri kullanılabilir olan bu testlerin sonuçlarına önce aşılanmış olmalıdır alloreactivity ve klinik kullanım için üretilen hücreler azalma onaylamak için gerçekleştirmek için 3-5 gün sürebilir. Ayrıca, timidin kuruluş tarafından PBMC'ler yayılması gerçekleştirmek için kolay olmasına rağmen ölçüm, T hücre çoğalması ek olarak, B hücreleri ve diğer hücre alt yayılması ölçer. Cevaplayıcı PBMC'ler KAKE boya seyreltme bir alternatif tahlil olarak kullanılan ve T hücre alt özel alloproliferation belirlenmesi izin olabilir. Strateji yaklaşımın klinik uygulama geliştirmek için bir yolu, klinik kullanım için alloanergized hücreleri serbest bırakmak için önce yapılabilecek gerçekleştirmek için sadece birkaç saat sürer alloreactivity bir test geliştirmek ve doğrulamak için olacaktır.

Özgüllüğü alloanergization işlemini onaylamak için de önemlidir stratejisi yaklaşımı etkinlik gösteren ek. Bu kolay proliferatif yanıtlarının CMV korunması, üçüncü parti allostimulators özel alloresponses göreli korunması kararlılık ve CMV-reaktif donör hücreleri alloanergized tarafından yapılabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Hypaque PLUS	GE Life Sciences	17-1440-02
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
HEPES 1M	Invitrogen	15630-080
L-Glutamin 200mm	Invitrogen	25030-081
Gentamisin	Invitrogen	15750-060
İnsan AB serum (ısı inaktive)	İkizler Bio-Ürünler	100-512	Valide toplu kullanın
Tam Kültür Medya (500ml)			440ml RPMI 1640, 50ml AB ​​serum, 5ml HEPES, 5 ml Glutamin, 167uL Gentamisin
Işınlama	GammaCell 1000
Corning Inc.	3056
Monoklonal anti-B7.1 ve anti B7.2 antikorlar			Protokol metnine bakın.
U 96 kuyu kültür plakaları oturaklı	BD Laboratuvar	353.077
Monoklonal antikor CD3	Beckman Coulter	IM0178	200ml saf su ile sulandırın
Monoklonal CD28 antikor	Beckman Coulter	IM1376	200ml saf su ile sulandırın
CMV sınıf 2 antijeni	Microbix	EL-01-02
Tritiated timidin	NEN	NET027
Sintilasyon Akışkan	Perkin Elmer, Inc.	1205-440
Harvester	Tomtec
Baskılı Filtermat A	Perkin Elmer, Inc.	1450-421
Filtre Çanta	Perkin Elmer, Inc.	1450-432
1450 MicroBeta Trilux Sintilasyon Sayacı	Wallac