공동 stimulatory 신호 봉쇄와 Alloantigen 자극에 의​​해 사람 말초혈 Mononuclear 세포 Alloantigen 특정 Anergy의 유도

요약

본 논문은 인간의 말초 혈액 mononuclear 세포의 alloantigen 특정 anergy를 유도하는 간단한 기술을 설명합니다. 기술은 아닌 alloreactive 기증자의 세포를 생성하는 임상 적용할 수 있습니다. 이러한 세포의 주입은 면역 reconstitution를 개선하고 all​​ogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 독성을 줄일 수 있습니다.

초록

Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (AHSCT)은 선천성과 인수 hematologic 질병 많은 환자에 대한 치료의 가장 좋은 기회를 제공합니다. 불행히도, 건강한 환자 조직을 인식하고 피해 alloreactive 기증자 T 세포의 이식은 이식 - 대 - 호스트 질환 (GvHD) ¹ 발생할 수 있습니다. 성공 AHSCT 한 과제는 기증자의 T 세포, 특히 면역 reconstitution 및 재발 방지에 유익한 효과 관련 장애없이 GvHD의 예방입니다. GvHD는 줄기 세포 이식이나 약리 immunosuppression의 관리에 의해 기증자 T 세포가 아닌 구체적인 고갈로 막을 수 있습니다. 불행히도 이러한 방식을 증가 감염과 질병 재발 ^2-4. 대안 전략은 이식 전에받는 항원 제시 세포 (APC)에 의해 allostimulation 후 선택 alloreactive 기증자 T 세포를 고갈하는 것입니다. 이러한 allodepletion 전략의 초기 임상 시험이 초과 GvHD ^{5, 6} 않고 HLA - 일치 HSCT 후 면역 reconstitution 향상. 그러나 일부 allodepletion 기술은 전문받는 APC 생산 ^{6, 7을} 필요로하고 어떤 접근 방법은 기증자 병원체 특정 T 세포 ⁸ CD4의 고갈을 포함 오프 대상 효과를 규제 세포에게 ⁹ T있을 수 있습니다. 하나의 대안 접근 alloreactive 기증자 T 세포의 불활 성화입니다 alloantigen 특정 hyporesponsiveness의 유도를 통해. CD28 - 중재 공동 자극 신호 ¹⁰ 봉쇄를 제공하면서이 수신자 APC와 함께 자극 기증자 세포에 의해 이루어진다. 체외 ¹¹ 병원체와 종양 - 관련 항원 T 세포 응답을 유지하면서 이러한 "alloanergization"접근법 1-2 로그로 alloreactivity 감소 . 전략은 성공적으로 2 alloanergized 기증자 T 세포가의 역사 제어받는 사람보다 빠른 면역 reconstitution, 몇 가지 감염 이하 중증 급성 및 만성 GvHD의 결과 HLA - 일치 HSCT하는 동안이나 이후에 주입되었던 1 지속적인 임상 시험 연구를 완료 및 채용되었습니다 HLA - 일치 이식 ¹² unmanipulated. 여기 우리는 HLA - 일치 무관 자극기의 PBMC에 alloanergized되었습니다 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)의 생성을 위해 현재 프로토콜을 설명합니다. Alloanergization는 리간드에 단클론 항체의 존재에 allostimulation에 의해 이루어집니다 CD28 - 중재의 costimulation을 차단하는 B7.1와 B7.1. 이 기술은 전문 자극기 APC의 생산을 요구하고 단지 하나의 상대적으로 간단한 전직의 생체내 보육 단계를 필요로하는, 수행 간단하지 않습니다. 따라서 접근 방식은 감소하지만 과도한 alloreactivity GvHD없이 면역 reconstitution을 개선하기 위해 AHSCT의 설정에 입양 전송을위한 유지 병원체 특정 면역과 기증자 T 세포를 생성하기 위해 임상 사용하기 위해 쉽게 표준화 될 수 있습니다.

프로토콜

1. PBMC의 준비

수속이 프로토콜의 수행 중에 준수해야합니다.
1. Ficoll - Hypaque을 사용하여 밀도 기울기 원심 분리하여 건강한 자원 봉사 기증자로부터 PBMC 분리. 또는 cryopreserved PBMC는 resuscitated 수 있습니다.
2. hemocytometer를 사용하여 Trypan 블루와 얼룩 후 가능한 PBMC 카운트. 15mL 팰컨 튜브 1,000,000 가능한 세포 / ML의 농도에서 전체 문화 미디어 Resuspend PBMC (CM).

2. 대량 Alloanergizing 공동 문화를 설정

PBMCs는 alloanergization 문화를 설정할 필요합니다. 응답과 다른 기증자로부터 세포 자극기 (첫 번째 파티 자극기를 칭했다)로 될 것입니다로 하나 기증자의 세포가 될 것입니다.
1. 1 15 ML 팰컨 튜브 만 / ML에서 플레이스 10,000,000 자극기 PBMC 및 costimulation를 차단하는 안티 B7.2 항체의 안티 B7.1과 100mg의 100mg를 추가합니다. 부드럽게 튜브를 선동하고 30 분 알을 품다. 이것과 이후의 모든 단계에 대한 배양 조건은 37 ° C / 5 % CO 아르 ₂ / 80 % 습도
2. 비추다 자극기 PBMC (3.3 쥐)와 T - 25 50cm에 추가 ^{3 세포 배양 플라스크. '일괄 alloanergizing 공동의 문화 "술병을 라벨.}
3. 술병에 응답 PBMC의 10mL (1 CM에서 만 / ML에서) 추가합니다.
4. 72 시간 안티 B7.1 및 안티 B7.2 항체의 각 추가로 100mg을 추가하고 인큐베이터에서 수직으로 술병을 배치하기 전에 부드럽게 믹스

3. 대량 제어 공동 문화를 설정

플레이스 10,000,000 자극기 PBMC (1 만 / ML).
1. 비추다 10,000,000 자극기 PBMC (3.3 쥐). 그리고 50cm에 추가 ³ 세포 배양 플라스크. 라벨 '일괄 통제 공동의 문화 ".
2. 술병에 CM에서 1,000,000 / ML에 응답 PBMC의 10mL를 추가하고 72 시간 보육에 수직으로 술병을 배치하기 전에 가볍게 섞는다.

4. 공동 stimulatory의 봉쇄의 효능을 측정하는 기본 혼합 림프구 반응 (미르)를 설정

1. costimulatory의 봉쇄의 효능은 대량 alloanergizing 및 제어 공동 문화의 PBMC를 사용하여 설정된 기본 미르의 측정
2. 기본 미르는 대량 문화가 설정되었는지 당일에 설정됩니다
3. 첫 번째 레이블이 한 U는 (번호판이 설정되면 주 4, 5, 6) 측정하기위한 세 시간 포인트 각각 96 자 판 "기본 미르"를 바닥.
가만히 따르다 5mL. 피펫 200mL. 라벨이 우물 공동 문화를 alloanergizing 일괄 통제 공동 문화와 대량의 세포에 대해 "CSB"에서 세포에 대해 "전혀 costimulatory의 봉쇄 없음 (CSB)"
4. 부정적인 컨트롤로 각 접시에 6 우물에 CM의 200mL를 추가합니다. 200mL PBS는 증발을 줄이기 위해 모든 빈 우물에 추가됩니다. 인큐베이터에 넣어 접시.

5. Alloanergization의 효능을 측정하는 보조 미르 설정

1. 72시간 공동 문화 일괄 설정 후, alloanergized PBMCs에서 잔류 alloresponses는 보조 미르 단위로 측정됩니다. 보조 미르, PBMC에서 대량 alloanergizing 공동 문화 일괄 통제 공동 문화 모두에서 조사 allostimulator PBMC와 세탁 및 restimulated 아르
2. 보조 미르 레이블을 설정 한 U는 (설정 후 3 일, 5 및 7) 측정하기위한 세 시간 점 각 96 잘 판 "보조 미르"를 바닥.
3. 대량 컨트롤의 각 5mL를 제거하고 공동 문화를 alloanergizing, 15mL 팰컨 튜브로 전송 및 2000에서 50~10분에 대한 원심을 신중하게 뜨는을 rpm.Aspirate, 펠렛을 방해, CM의 10mL를 추가하고 다시 세포를 원심 분리기. 이 세척 단계를 반복합니다.
4. CM의 1mL에있는 세포를 Resuspend. Trypan 블루 얼룩을 사용하여 가능한 세포를 카운트하고, 1,000,000 가능한 응답 전지 / ML에 세포 농도를 조정합니다.
피펫 100mL. 이 우물 "우선 파티 (FP) allorestimulation"를 라벨 피펫 100mL이 우물 "CD3/28 자극"
5. alloanergizing 및 제어 문화의 첫 번째 파티 자극기의 PBMCs를 공급하는 데 사용되는 동일한 건강한 기증자로부터 신선한 혈액 (또는 cryopreserved PBMC를 소생)에서 PBMC 분리, 보조 미르에 대한 자극기 전지를 준비합니다.
6. 1,000,000 / ML 및 비추다 (3.3Gy)의 농도에서 FP의 기증자로부터 PBMC를 일시 중지
7. 웰스 표시 "FP allorestimulation"로 조사 자극기 세포의 100mL 추가
8. 긍정적인 컨트롤, "CD3/28 자극"이라는 우물 1 인 경우에는 3 번 CD에 들어 ML 각과 CD28 단클론 항체와 CM의 98mL를 추가합니다. 빈 우물에 부정적인 제어 및 PBS의 200mL 각 접시에 6 우물에 CM 200 ML을 추가합니다. 인큐베이터에있는 접시를 놓습니다.

6. Alloanergization의 특이성을 측정

1. alloanergization의 특이성은 보조에서 "타사"건강한 기증자 (즉, 첫 번째 파티에 다른 기증자)에서 얻은 조사 PBMC와 자극 후 완료 alloanergizing 및 제어 공동 문화에서 가져온 응답 세포의 증식을 비교하여 결정됩니다 미르.
2. 레이블 세 96 잘 접시 "보조 미르의 특이성"3 일, 5 및 7.
3. 대량 컨트롤의 각 5mL를 제거하고 공동 문화 15mL 팰컨 튜브로 전송 및 2000 rpm으로 5-10분 위해 원심 분리기를 alloanergizing. 신중하게 뜨는을 대기음 펠렛을 방해, CM의 10mL를 추가하고 다시 세포를 원심 분리기. 이 세척 단계를 반복합니다.
4. CM의 1mL에있는 세포를 Resuspend. Trypan 블루 얼룩을 사용하여 계산하고, 1,000,000 가능한 응답 전지 / ML에 세포 농도를 조정합니다.
5. 새로운 건강한 기증자로부터 신선한 혈액 (또는 cryopreserved PBMC를 소생)에서 PBMC 분리, 보조 미르에 대한 타사 자극기 전지를 준비합니다. 각 팰컨 튜브 각 접시의 세중의의 우물로의 세포 현탁액의 피펫 100mL. 이 우물 "TP allostimulation"를 라벨
6. 1,000,000 / ML과 조사하다 (3.3 쥐)에서 TP의 기증자로부터 PBMC를 일시 중지
7. 웰스 표시 "TP의 allostimulation"으로 조사 TP의 자극기 세포의 200mL 추가
특이성은 또한 CMV와 같은 전염성 병원균과 자극 후 완료 alloanergizing 및 제어 공동 문화에서 가져온 응답 세포의 확산을 비교하여 결정 수 있습니다. 이 단계는 CMV lysate 이전에 시연 proliferative 반응과 기증자로부터 응답 PBMC를 사용하는 것이 필수적입니다.
8. 레이블 세 96 잘 접시 "보조 미르 CMV"3 일, 5 및 7.
9. CMV 응답을 측정하는 보조 미르에 대한 응답 세포를 준비하려면, 대량 컨트롤의 각에서 5 ML을 전송 15 ML 튜브에 공동 문화를 alloanergizing하고 씻고, 앞에서 설명한 것처럼 CM에서 1,000,000 세포 / ML에 개수 및 resuspend 각 접시에 3 우물에 각 팰컨 관의 세포 현탁액의. 피펫 100mL.
10. 우물에 100ul CM에서 CMV lysate의 0.1 ML 추가
11. 부정적인 제어와 같은 접시에 6 우물에 CM 200 ML 추가 및 빈 우물에 PBS의 200mL를 추가합니다. 인큐베이터에있는 접시를 놓습니다.

7. 차 및 차 MLRs의 확산을 측정

1. 응답의 세포 증식은 기본 및 보조 MLRs에서 thymidine의 설립 분석에​​ 의해 측정됩니다. 기본 미르 플레이트가 설치되고 3 일, 5 및 7 차 미르 판 이후에 설정되면 증식이 일 4, 5, 6에서 측정됩니다.
1mCi는 수확하기 전에 우물 16시간에 추가됩니다
2. tritiated thymidine의 추가 후, 접시는 다음 Tomtec 수확기 (또는 유사한)를 사용하여 필터 매트에 수확 further16 시간 incubated입니다. 에어 드라이 다음 샘플 가방에 장소가 5 ML의 섬광 유체와 인감을 추가 한 시간 만이라도 filtermat합니다. 카운터 또는 유사 Wallac 마이크로 베타 섬광의 번호판을 읽어보십시오.

8. 기본 미르의 Co - stimulatory의 봉쇄의 효능을 계산

비율 억제 (PI)은 100과 같이 계산됩니다 X [allostimulation 우물에서 노출당 비용 (대량 alloanergy 공동 문화 PBMC) 의미 - allostimulation 우물에서 노출당 비용 (일괄 제어 공동 문화 PBMC)} 의미

9. 차 미르의 Alloanergization의 효능을 계산

2 차 alloresponses의 PI가로 계산됩니다

10. 차 미르의 Alloanergization의 특이성을 계산

1. 인 경우에는 3 번 CD 및 CD28와 세포의 restimulation 후, TP의 allostimulators 또는 이러한 자극에 CMV의 항원, 응답의 PI도이 공식을 사용하여 계산됩니다. 이것은 alloanergization 과정의 특이성의 측정을 제공합니다

11. Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 임상 사용 (HSCT)에 대한 Alloanergized 기증자 PBMC 생성

1. Alloanergized 기증자 PBMC는 위에 설명된 프로토콜을 사용하여 HLA - 일치 allogeneic HSCT 후 임상 사용하기 위해 생성됩니다
2. 임상 사용을위한 세포를 생성할 때, 응답 PBMC는 이식하기 전에 HSCT받는 사람의 HSCT의 기증자와 자극기 PBMC에서 얻을 수 있습니다.
3. 임상 사용 PBMC를 생성할 때, 모든 단계가인가 줄기 세포 처리 시설 좋은 제조 공정 조건 하에서 수행됩니다.
4. 추가 품질 관리 assays은 내독소의 assays 포함하여 임상 사용을위한 사전 세포의 릴리스 안전 기준을 충족 그램 얼룩과 문화 수행됩니다

12. 대표 결과

를 사용하여 HLA를 일치 자극기 및 응답 PBMC, 기본 미르의 costimulatory의 봉쇄의 존재는 약 30 % (표준 편차 - - 10 %, + / 말씀 + /)에 5 일에 응답 PBMC의 의미 alloproliferation 감소 costimulatory의 봉쇄의 부재에서 컨트롤 기본 미르. , D5에 -이 70 % 정도 (10 % + /)의 기본 alloproliferation의 의미 억제하는 것과 동일합니다 그림 1 A와 B.

5 일째에 보조 미르에서 alloanergized PBMC의 FP의 alloproliferation 일반적으로 10-15% (+ / - 10 %)입니다 85-90%의 확산의 의미 억제 (제어 PBMC에 상응과 함께 본 그 + / - 10 %), 그림 2A와 B. 이것은 alloanergized PBMC는 FP의 allostimulators에 hyporesponsive 것을 보여줍니다.

반면 alloanergized PBMC에서 일반적으로 mitogens (CD3/CD28 항체)들의 확산 70~100% 유지, TP의 allostimulators 및 CMV lysate (CMV 반응 기증자에서). 이것은 alloanergized PBMC의 hyporesponsiveness은 FP alloantigens에만 적용됩니다 보여줍니다.

그림 1. A. 확산 (thymidine의 설립이 결정) 항체. 결과는 독특한 자극기 - 응답 쌍을 사용하여 8 대표 실험 (+ / - SD) 의미로 표시됩니다. B. 인간화 단클론 방지 B7.1 및 B7.2 항체를 사용하여 costimulatory의 봉쇄의 존재에서 수행 기본 MLRs에 alloproliferation 비율 억제. 결과는 그림 1A에 묘사된 같은 여덟 독특한 자극기 - 응답 쌍을위한 (+ / - SD) 의미로 표시됩니다.

그림 2. A.의 확산 (thymidine의 설립에 따라 결정). 결과는 그림 1에 묘사된 8 독특한 자극기 - 응답 쌍을위한 (+ / - SD) 의미로 표시됩니다. B. 응답 PBMC가없는 (제어 PBMC) 또는 costimulatory의 봉쇄 (alloanergized PBMC)의 존재에서 수행 기본 MLRs에서 조사 첫번째 파티 stimulators로 restimulated 아르 보조 MLRs 최초 파티 alloproliferation 비율 억제. 결과는 그림 1과 그림 2A에 묘사된 8 독특한 자극기 - 응답 쌍을위한 (+ / - SD) 의미로 표시됩니다.

토론

공동 stimulatory의 봉쇄의 존재에 allostimulation를 통해 기증자 PBMC에서 alloantigen 특정 hyporesponsiveness 또는 anergy의 유도가 감소 alloreactivity와 기증자 PBMC의 생성을위한 간단한 기법입니다. 우리는 실험실에서 그 과정을 개발하고 현재 HLA - 일치 allogeneic HSCT 후 주입에 대한 감소 alloreactivity와 기증자의 PBMC를 생성하기 위해 병원의 전략을 적용하고 있습니다. 이러한 치료를 사용하는 목적은 초과 독성없이 면역 reconstitution을 향상시킬 수 있습니다. 전략 우리의 현재 임상 응용 프로그램이 allogeneic HSCT의 설정으로 제한되지만, 접근은 조직의 손상이 같은 고체 장기 이식이나 면역 조건의 거부로 불필요한 T 세포 반응에 의해 발생 다른 설정을 적용할 수 있습니다.

여러 시약은 alloanergization 공동 문화 과정 CD28 - 중재 공동 stimulatory 신호의 봉쇄에 사용될 수 있습니다. 여기 CD28 (B7.1와 B7.2)의 리간드에 대한 감독 임상 수준의 인간화 단클론 항체 murine를 사용하여 현재 프로토콜을 설명합니다. 비 임상 등급 murine 방지 인간 B7.1와 B7.2 항체는 여러 제조 업체에서 상업적으로 사용할 수 있습니다. 또한, 융합 단백질 세포 독성 T 림프구의 항원 (CTLA) 4 - 면역 글로불린 (IG)은 alloanergization 과정 CD28 - costimulation를 차단하는 데 사용할 수 있습니다. IgG FC 감마 수용체에 연결된 CTLA4 분자의 세포외 부분으로 구성되어 있습니다 CTLA4 - IG는 B7.1와 B7.2 높은 친화력과 바인딩합니다. CTLA4 - IG의 사용은 인간 PBMCs의 alloanergization 비슷한 효능과 특이성을 초래합니다.

alloanergization의 기술 수​​행하는 간단하다. 신선한 또는 이전 cryopreserved 자극기의 PBMCs이 프로세스의 결과에 큰 변화없이 사용할 수 있습니다. 절차를 정렬없이 세포에서만 하나의 비교적 간단한 예의 생체내 보육 단계에 대한 요구 사항은 이전 임상 규모에 적용할 수있는 전략은 비교적 간단하게 주입하는 세포 죽음과 세포의 세균 오염에 대한 가능성이 최소화합니다.

한 제한이 잔류 alloreactivity을 결정하는 실시간 분석의 부재입니다. 확산 assays 사전 제공되는 이러한 assays의 결과를 주입해야 alloreactivity 및 임상 사용을위한 생성 세포의 감소를 확인하기 위해 수행하는 3-5일 가져가라. 수행할 수 있지만 쉽게 또한, thymidine의 설립에 의해 PBMCs의 확산의 측정, T의 세포 증식 이외에 B 세포와 다른 세포 하위 집합의 확산을 측정합니다. 응답 PBMCs의 CFSE의 염료 희석은 다른 분석으로 사용 및 T 세포 부분 집합 특정 alloproliferation 결정을 허용하실 수 있습니다. 우리의 전략적인 접근의 임상적 응용 프로그램을 개선하는 한 가지 방법은 임상 사용을위한 alloanergized 세포의 릴리스하기 전에 수행할 수있는 수행하기 위해 몇 시간 밖에 안 걸립니다 alloreactivity의 분석을 개발하고 검증하는 것입니다.

특이성의 alloanergization 프로세스를 확인하는 것도 중요합니다 전략의 efficiacy를 시연뿐만 아니라. 이것은 쉽게 CMV에 proliferative 응답의 보존하여 타사 allostimulators 특정 alloresponses의 상대 보존 결정 언제 CMV - 반응 기증자 세포 alloanergized되고있다 할 수 있습니다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Hypaque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine 200mM	Invitrogen	25030-081
Gentamicin	Invitrogen	15750-060
Human AB serum (heat inactivated)	Gemini Bio Products	100-512	Use validated batches
Complete Culture Media (500ml)			440ml RPMI 1640, 50ml AB serum, 5ml Hepes, 5 ml Glutamine, 167uL Gentamicin
Irradiator	GammaCell 1000
T-25 Cell Culture Flasks with gas permeable caps	Corning	3056
Humanized Monoclonal anti-B7.1 and anti B7.2 antibodies			See protocol text
U bottomed 96 well culture plates	BD Biosciences	353077
Monoclonal CD3 antibody	Beckman Coulter Inc.	IM0178	Reconstitute with 200ml distilled water
Monoclonal CD28 antibody	Beckman Coulter Inc.	IM1376	Reconstitute with 200ml distilled water
CMV grade 2 antigen	Microbix	EL-01-02
Tritiated Thymidine	NEN	NET027
Scintillation Fluid	PerkinElmer, Inc.	1205-440
Harvester	Tomtec
Printed Filtermat A	PerkinElmer, Inc.	1450-421
Filter Bag	PerkinElmer, Inc.	1450-432
1450 MicroBeta TriLux Scintillation Counter	Wallac
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