Индукция аллоантигена конкретных анергии в населенных мононуклеарных клеток периферической крови путем стимуляции аллоантигена с сопредседателями стимулирующий сигнал блокады

Резюме

Этот документ описывает простую технику, чтобы побудить аллоантигена конкретных анергии в человеческом мононуклеарных клеток периферической крови. Техника может быть применена в клинике для порождают не alloreactive клетки донора. Настой этих клеток может улучшить восстановления иммунитета и снижения токсичности после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Аннотация

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic diseases. Unfortunately, transplantation of alloreactive donor T cells which recognize and damage healthy patient tissues can result in Graft-versus-Host Disease (GvHD)¹. One challenge to successful AHSCT is the prevention of GvHD without associated impairment of the beneficial effects of donor T cells, particularly immune reconstitution and prevention of relapse. GvHD can be prevented by non-specific depletion of donor T cells from stem cell grafts or by administration of pharmacological immunosuppression. Unfortunately these approaches increase infection and disease relapse^2-4. An alternative strategy is to selectively deplete alloreactive donor T cells after allostimulation by recipient antigen presenting cells (APC) before transplant. Early clinical trials of these allodepletion strategies improved immune reconstitution after HLA-mismatched HSCT without excess GvHD^{5, 6}. However, some allodepletion techniques require specialized recipient APC production^{6, 7}and some approaches may have off-target effects including depletion of donor pathogen-specific T cells⁸and CD4 T regulatory cells⁹.One alternative approach is the inactivation of alloreactive donor T cells via induction of alloantigen-specific hyporesponsiveness. This is achieved by stimulating donor cells with recipient APC while providing blockade of CD28-mediated co-stimulation signals¹⁰.This "alloanergization" approach reduces alloreactivity by 1-2 logs while preserving pathogen- and tumor-associated antigen T cell responses in vitro¹¹. The strategy has been successfully employed in 2 completed and 1 ongoing clinical pilot studies in which alloanergized donor T cells were infused during or after HLA-mismatched HSCT resulting in rapid immune reconstitution, few infections and less severe acute and chronic GvHD than historical control recipients of unmanipulated HLA-mismatched transplantation¹². Here we describe our current protocol for the generation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) which have been alloanergized to HLA-mismatched unrelated stimulator PBMC. Alloanergization is achieved by allostimulation in the presence of monoclonal antibodies to the ligands B7.1 and B7.1 to block CD28-mediated costimulation. This technique does not require the production of specialized stimulator APC and is simple to perform, requiring only a single and relatively brief ex vivo incubation step. As such, the approach can be easily standardized for clinical use to generate donor T cells with reduced alloreactivity but retaining pathogen-specific immunity for adoptive transfer in the setting of AHSCT to improve immune reconstitution without excessive GvHD.

протокол

1. Подготовка РВМС

1. Процедуры для хорошего асептики и универсальные меры предосторожности необходимо соблюдать при проведении этого протокола.
2. Изолят РВМС здоровых доноров добровольцев по центрифугирования в градиенте плотности использованием Ficoll-Hypaque. Кроме криоконсервированных РВМС может быть реанимирован.
3. Count жизнеспособной РВМС после окрашивания Голубой Трипан использованием гемоцитометра. Ресуспендируют РВМС в полном питательных сред (СМ) в концентрации 1 миллион жизнеспособных клеток / мл в 15 мл трубки Falcon.

2. Настройка Массовая Alloanergizing сотрудничеству культуры

1. МНПК из двух отдельных доноров, необходимые для установки alloanergization культур. Клетки от одного донора будет служить ответчик и клеток от другого донора послужит стимулятором (называется первый стимулятор партии).
2. Место 10 миллионов стимулятор РВМС на 1 млн / мл в 15 мл трубки Сокол и добавить 100 мг анти-B7.1 и 100 мг анти В7.2 антител блокировать costimulation. Аккуратно агитировать трубки и инкубировать 30 минут. Инкубационный условия для этого и всех последующих шагов 37 ° С / 5% СО ₂ / 80% влажности
3. Радиация стимулятор РВМС (3,3 Гр) и добавить к Т-25 50 см ³ Клеточной культуре колбу с газопроницаемых шапку. Этикетка колбе "Массовая alloanergizing со-культуры".
4. Добавить 10 мл ответчик РВМС (на 1 млн / мл в КМ) в колбу.
5. Добавить дальнейшем 100 мг каждая из анти-B7.1 и против В7.2 антител и аккуратно перемешать до размещения колбу в вертикальном положении в инкубаторе в течение 72 часов

3. Настройка управления Массовая культура сотрудничества

1. Место 10 миллионов стимулятор РВМС (на 1 млн / мл) в 15 мл трубки Falcon.
2. Радиация 10 миллионов стимулятор РВМС (3,3 Гр). И добавить к 50 см ³ Клеточной культуре колбу. Этикетка "Массовая контроль со-культуры".
3. Добавить 10 мл ответчик РВМС на 1 млн / мл в СМ в колбу и аккуратно перемешать до размещения колбу в вертикальном положении в инкубаторе в течение 72 часов.

4. Настройка первичного смешанную реакцию лимфоцитов (MLR) для измерения эффективности применения костимулирующих блокады

1. Эффективность костимуляторных блокады измеряется в первичной MLR который настроен с помощью РВМС от alloanergizing натуральном и контроль со-культур
2. Первичные MLR устанавливается на тот же день, что основная часть культуры были созданы
3. Во-первых этикетке один U дном 96-луночный планшет "Первичная MLR" для каждого из трех моментов времени для измерения (День 4, 5 и 6 после пластин устанавливаются).
4. Декантировать 5 мл с каждой объемной контроля и alloanergizing со-культур в 15 мл пробирки Falcon.
5. Внесите 200 мл клеточной суспензии из каждой пробирки Сокол в трех экземплярах скважин на каждую тарелку. Этикетка этих скважин "нет костимуляторных блокады (ЦБС)" для клеток из объема контроля со-культур и "ЦБС" для клеток из объема alloanergizing совместно культур
6. Добавить 200 мл СМ до 6 скважин на каждую пластину в качестве отрицательного контроля. 200 мл PBS добавляется ко всем пустой скважины, чтобы уменьшить испарение. Место пластин в инкубаторе.

5. Настройка вторичного MLR для измерения Эффективность Alloanergization

1. 72 часов с момента создания объемных со-культур, остаточные alloresponses в alloanergized МНПК измеряются в вторичном MLR. На вторичном MLR, РВМС с обеих объемных alloanergizing совместно культура и массовый контроль со-культуры промывают и restimulated с облученным allostimulator РВМС
2. Чтобы настроить вторичный этикетке MLR один U дном 96-луночный планшет "Вторичные MLR" для каждого из трех моментов времени для измерения (День 3, 5 и 7 после настройки).
3. Удалить 5 мл с каждой объемной контроля и alloanergizing совместно культур, трансфер в 15 мл Сокол труб и центрифуги в течение 5-10 минут при 2000 rpm.Aspirate супернатант тщательно, нарушить гранул, добавить 10 мл СМ и центрифуги клетки снова. Повторите эту стиральную шаг.
4. Ресуспендируют клеток в 1 мл СМ. Граф жизнеспособных клеток с использованием Голубой Трипан окрашивания, а также настроить концентрацию клеток до 1 млн. жизнеспособных клеток ответчик / мл.
5. Внесите 100 мл клеточной суспензии из каждой пробирки Сокол в трех экземплярах скважин каждой пластины. Этикетка этих скважин "Первая партия (ФП) allorestimulation"
6. Внесите 100 мл клеточной суспензии из каждой пробирки Сокол в дальнейшем 3 скважины на каждой пластине и маркировать эти скважины "CD3/28 стимуляции"
7. Для подготовки стимулятор клеток для вторичных MLR, изолировать РВМС из свежей крови (или реанимировать криоконсервированных РВМС) из того же здорового донора используется для предоставления первой МНПК стимулятор партии в alloanergizing и управления культуры.
8. Приостановить РВМС от донора FP в концентрации 1 млн / мл и облучать (3.3Gy)
9. Добавить 100 мл облученных клеток стимулятор к скважинам с надписью "FP allorestimulation"
10. При положительных элементов управления, добавить 1 мл каждая из CD3 и CD28 моноклональных антител и 98mL СМ к скважинам с надписью "CD3/28 стимуляции". Добавить 200 мл CM до 6 скважин на каждую пластину в качестве отрицательного контроля и 200 мл PBS, чтобы пустые колодцы. Место пластин в инкубаторе.

6. Измерение Специфика Alloanergization

1. Специфика alloanergization определяется путем сравнения пролиферацию клеток, взятых из ответчик завершена alloanergizing и контроля со-культур после стимуляции облученных РВМС получить "третья сторона" здоровых доноров (например, различные доноры Первая партия) во вторичной MLR.
2. Label три 96-луночных "Вторичные Специфика MLR" День 3, 5 и 7.
3. Удалить 5 мл с каждой объемной контроля и alloanergizing совместно культур передачи 15мл Сокол труб и центрифуги в течение 5-10 минут при 2000 оборотах в минуту. Аспирируйте супернатант тщательно, нарушить гранул, добавить 10 мл СМ и центрифуги клетки снова. Повторите эту стиральную шаг.
4. Ресуспендируют клеток в 1 мл СМ. счет использования Голубой Трипан окрашивания, а также настроить концентрацию клеток до 1 млн. жизнеспособных клеток ответчик / мл.
5. Для подготовки третьего клетки стимулятор партия для вторичной MLR, изолировать РВМС из свежей крови (или реанимировать криоконсервированных РВМС) от нового здорового донора. Внесите 100 мл клеточной суспензии из каждой пробирки Сокол в трех экземплярах скважин каждой пластины. Этикетка этих скважин "TP allostimulation"
6. Приостановить РВМС от донора ТП на 1 млн / мл и облучать (3,3 Гр)
7. Добавить 200 мл облученного стимулятор клетки ТП к скважинам с надписью "allostimulation ТП»
8. Специфика alloanergization также может быть определена путем сравнения пролиферацию клеток, взятых из ответчик завершена alloanergizing и контроля со-культур после стимуляции инфекционных патогенов, таких как ЦМВ. На этом этапе очень важно использовать ответчик РВМС от доноров с ранее продемонстрировали пролиферативный ответ к ЦМВ лизат.
9. Label три 96-луночных "Вторичные MLR ЦМВ" День 3, 5 и 7.
10. Для подготовки ответчик клеток для вторичных MLR для измерения CMV ответы, передача 5 мл с каждой объемной контроля и alloanergizing совместно культур до 15 мл пробирок и помыть, считать и ресуспендирования на 1 млн. кл / мл в СМ, как описано выше . Внесите 100 мл клеточной суспензии из каждой пробирки Сокола в 3 скважины на каждой пластине.
11. Добавить 0,1 мл ЦМВ лизат в 100 мкл CM к скважинам
12. Добавить 200 мл CM до 6 скважин на всех пластину в качестве отрицательного контроля и добавить 200 мл PBS, чтобы пустые колодцы. Место пластин в инкубаторе.

7. Измерение распространения в первичный и вторичный реактивный миномет

1. Ответчика пролиферации клеток измеряется тимидина в первичный и вторичный реактивный миномет. Распространения измеряется в 4 день, 5 и 6 после Первичные пластинки MLR настроены и на 3 дня, 5 и 7 после вторичного пластин MLR настроены.
2. 1mCi из тритием тимидина добавляется в ячейки 16 часов перед сбором урожая
3. После добавления тритием тимидина, пластины выдерживают в течение часа further16 затем собирают на фильтре мата использованием Tomtec комбайн (или аналогичный). Высушите FILTERMAT в течение одного часа, то место в камере для отбора проб, добавляют 5 мл жидкости сцинтилляционных и печатью. Прочитано пластины в Wallac Micro бета сцинтилляционных счетчиков или аналогичный.

8. Расчет эффективности применения костимулирующих блокады в первичной MLR

1. Процент ингибирования (PI) первичных alloresponses рассчитывается как 100 х [означает копий в минуту в allostimulation скважин (насыпной alloanergy совместно культуры РВМС) - среднее копий в минуту в allostimulation скважин (насыпной контроль со-культуры РВМС)}
   

9. Расчет эффективности применения Alloanergization на вторичном MLR

П. И. вторичных alloresponses рассчитывается как

10. Расчет Специфика Alloanergization на вторичном MLR

1. После рестимуляции клеток с CD3 и CD28, Т. П. allostimulators или антиген, П. И. ответов на эти стимулы могут также рассчитываться по этой формуле. Это дает меру специфики процесса alloanergization

11. Создание Alloanergized РВМС донора для клинического использования после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)

1. Alloanergized РВМС донора может быть создан для клинического использования после HLA-несоответствие аллогенных ГСК с использованием протокола указано выше
2. При создании клеток для клинического использования, отвечающий РВМС получаются из доноров ГСК и стимулятора РВМС из ГСК получателя до пересадки.
3. При создании РВМС для клинического использования, все действия выполняются при надлежащей производственной Рабочие условия в аккредитованных центров обработки стволовых клеток.
4. Дополнительные тесты контроля качества выполняются в том числе эндотоксина анализов и Граму и культуры для удовлетворения критериям безопасности до выпуска клеток для клинического использования

12. Представитель Результаты

Использование несоответствующих HLA-стимулятор и ответчик РВМС, наличие костимуляторных блокады в первичной MLR снижает средний пролиферация аллогенных клеток от ответчика РВМС в день от 5 до 30% (+ / - 10%, среднее + / - стандартное отклонение), которое наблюдалось в контроль первичной MLR при отсутствии костимуляторных блокады. Это эквивалентно означает торможение первичного пролиферация аллогенных клеток составляет около 70% (+ / - 10%), D5, На рисунке 1 и В.

На вторичном MLR на 5-й день, Ф. П. пролиферация аллогенных клеток из alloanergized РВМС, как правило, 10-15% (+ / - 10%), которое наблюдалось с управлением РВМС эквивалентно означает торможение распространения 85-90% (+ / - 10 %), Рисунок 2А и В. Это показывает, что alloanergized РВМС являются hyporesponsive к FP allostimulators.

В отличие alloanergized РВМС обычно сохраняют 70-100% от их распространения на митогены (CD3/CD28 антитела), Т. П. allostimulators и ЦМВ лизат (в ЦМВ-реактивного доноров). Это показывает, что hyporesponsiveness из alloanergized РВМС специфичен для FP alloantigens.

Рисунок 1. А. Распространение (определяется тимидина) в первичной Смешанная реакция лимфоцитов использованием несоответствие HLA-стимулятор и ответчик мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) в отсутствии или наличии костимуляторных блокады использованием гуманизированные моноклональные анти-B7.1 и-В7.2 антител. Результаты представлены как среднее (+ /-SD) в течение 8 представителя экспериментов с использованием уникального стимулятора-ответчик пар. B. Процент ингибирования пролиферация аллогенных клеток в первичных реактивный миномет осуществляется в присутствии костимуляторных блокады использованием гуманизированные моноклональные анти-B7.1 и В7.2-антител. Результаты представлены как среднее (+ /-SD) для тех же 8 уникальных стимулятор-ответчик пар, изображенный на рис 1А.

Рисунок 2. А. Распространение (определяется тимидина) в средних реактивный миномет, где ответчик РВМС из первичных реактивный миномет осуществляется в отсутствие (контроль РВМС) или наличие костимуляторных блокады (alloanergized РВМС) являются restimulated с облученным первой стимуляторы стороны. Результаты представлены как среднее (+ /-SD) для 8 уникальных стимулятор-ответчик пары изображены на рисунке 1. B. Процент ингибирования Первая партия пролиферация аллогенных клеток в средней реактивный миномет, где ответчик РВМС из первичных реактивный миномет осуществляется в отсутствие (контроль РВМС) или наличие костимуляторных блокады (alloanergized РВМС) являются restimulated с облученным первый стимуляторы стороны. Результаты представлены как среднее (+ /-SD) для 8 уникальных стимулятор-ответчик пары изображены на рисунках 1 и 2А.

Обсуждение

Индукции аллоантигена конкретных hyporesponsiveness или анергии, в донорских РВМС через allostimulation в присутствии костимулирующих блокада простую технику для генерации доноров РВМС с пониженным alloreactivity. Мы разработали процесс в лаборатории и в настоящее время применение стратегии в клинику для получения доноров РВМС с пониженным alloreactivity для инфузий после HLA-несоответствие аллогенных ГСК. Целью использования такой терапии является улучшение восстановления иммунитета без лишнего токсичности. Хотя наши нынешние клинического применения стратегии ограничена установка аллогенных ГСК, подход может быть применен в других условиях, где повреждение тканей вызывает нежелательные Т-клеточные реакции, такие как отказ от твердых трансплантации органов или аутоиммунных состояний.

Несколько реагенты могут быть использованы для блокады CD28-опосредованный костимулирующих сигналов во время alloanergization совместно культуры процесс. Здесь мы описываем наш текущий протокол, используя клинико-класса гуманизированные мышиные моноклональные антитела, направленные против лигандов CD28 (B7.1 и В7.2). Доклинические класса мышиные анти-человеческий B7.1 и В7.2 антитела являются коммерчески доступными от нескольких производителей. Кроме того, гибридный белок цитотоксических Т-лимфоцитов антигена (CTLA) 4-иммуноглобулинов (Ig) могут быть использованы для блокирования CD28-costimulation во alloanergization процесса. CTLA4-Ig, который состоит из внеклеточной части молекулы CTLA4 связаны с гамма рецептор IgG Fc, связывается с высоким сродством к B7.1 и В7.2. Использование CTLA4-Ig приводит сходную эффективность и специфичность alloanergization от человека МНПК.

Техника alloanergization прост для выполнения. Свежие или ранее криоконсервированных стимулятор МНПК можно использовать без каких-либо значительных изменений в исходе процесса. Требование только одно относительно короткий бывших естественных условиях инкубации без каких-либо сортировки клеток процедур сводит к минимуму вероятность смерти клеток и бактериальной загрязненности клеток до инфузии что делает стратегию относительно прост в применении в клинической шкале.

Одно из ограничений подхода мы описываем (и другие подходы к селективно восстанавливать alloreactivity клеток человека) является отсутствие в режиме реального времени анализ для определения остаточного alloreactivity. Распространение анализов в течение 3-5 дней, чтобы выполнить, чтобы подтвердить снижение alloreactivity и клеток создается для клинического использования должны быть пронизаны до результатов этих анализов будут доступны. Кроме того, измерение распространения МНПК по тимидина, хотя легко выполнить, меры распространением В-клеток и других подмножеств ячейки в дополнение к распространению Т-клеток. CFSE красителя разбавлением ответчик МНПК могут быть использованы в качестве альтернативного анализа и позволяет определить подмножество Т-клеток конкретных пролиферация аллогенных клеток. Один из способов улучшить клиническое применение нашей стратегии подхода будет заключаться в разработке и проверке количественное определение alloreactivity, что занимает всего несколько часов, чтобы выполнить которые могут быть выполнены до выпуска alloanergized клеток для клинического использования.

В дополнение к демонстрации efficiacy стратегии также важно, чтобы подтвердить процесс специфику alloanergization. Это можно легко сделать путем определения относительного сохранения alloresponses конкретным третьим allostimulators партии и при ЦМВ-реактивного клетки донора в настоящее время alloanergized по сохранению пролиферативный ответ к ЦМВ

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Hypaque PLUS	GE Life Sciences	17-1440-02
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
L-глютамин 200 мМ	Invitrogen	25030-081
Гентамицин	Invitrogen	15750-060
Human АВ сыворотки (тепло инактивированная)	Близнецы био-продукты	100-512	Использовать проверку партий
Полный медиа-культуры (500 мл)			440ml RPMI 1640, 50 мл сыворотки АВ, 5 мл Hepes, 5 мл глутамина, 167uL Гентамицин
Облучателя	GammaCell 1000
Т-25 культуре клеток Колбы с газовой шапки проницаемой	Corning, Inc	3056
Гуманизированные моноклональные анти-B7.1 и против В7.2 антител			См. текст протокола
U дном 96-луночных культуры	BD лабораторное	353077
Моноклональных антител CD3	Beckman Coulter	IM0178	Развести в 200 мл дистиллированной воды
Моноклональных антител CD28	Beckman Coulter	IM1376	Развести в 200 мл дистиллированной воды
2-й степени ЦМВ антигена	Microbix	EL-01-02
Тритием тимидина	NEN	NET027
Сцинтилляционные жидкости	PerkinElmer, Inc	1205-440
Харвестерные	Tomtec
Печатные FILTERMAT	PerkinElmer, Inc	1450-421
Фильтр сумка	PerkinElmer, Inc	1450-432
1450 MicroBeta TRILUX сцинтилляционных счетчиков	Wallac