Indução de aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico por Estimulação com aloantígenos Co-estimulatórias bloqueio de sinal

Resumo

Este artigo descreve uma técnica simples para induzir aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico. A técnica pode ser aplicada clinicamente para gerar células não-alorreativas doador. Infusão dessas células poderia melhorar a reconstituição imunológica e reduzir a toxicidade após o transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas.

Resumo

Alogênico de células tronco hematopoiéticas transplante (TACTH) oferece a melhor chance de cura para muitos pacientes com doenças congênitas e adquiridas hematológicas. Infelizmente, o transplante de células do doador alorreativas T que reconhecem e danificar os tecidos do paciente saudável pode resultar em Graft-versus-hospedeiro (GVHD) ^1. Um desafio para TACTH sucesso é a prevenção de DECH sem comprometimento associado aos efeitos benéficos das células T do doador, a reconstituição particularmente imunológico e prevenção de recaída. DEvH pode ser prevenida por não-específicas depleção de células T do doador de enxertos de células-tronco ou por administração de imunossupressão farmacológica. Infelizmente, estas infecções aumentam abordagens e doença recaída ^2-4. Uma estratégia alternativa é seletivamente destroem as células T do doador após alorreativas allostimulation por células do receptor apresentadoras de antígenos (APC) antes do transplante. Os primeiros estudos clínicos dessas estratégias allodepletion melhor reconstituição imunológica após o transplante HLA-incompatíveis, sem excesso de DEvH ^{5, 6.} No entanto, algumas técnicas exigem allodepletion especializados destinatário produção APC ^{6, 7} e algumas abordagens podem ter efeitos fora do alvo, incluindo a depleção de células de doadores de patógenos específicos T ⁸ e T CD4 células regulatórias ^9. Uma abordagem alternativa é a inativação de células T do doador alorreativas através da indução de aloantígenos específicos hiporeactividade. Isto é conseguido através estimulando células do doador com o receptor APC, proporcionando bloqueio de CD28 mediada co-estimulação sinais ^10. Este "alloanergization" abordagem reduz alloreactivity por 1-2 logs preservando patógeno e tumor associado antígeno respostas de células T in vitro ¹¹ . A estratégia tem sido empregada com sucesso em 2 concluídas e 1 em curso estudos-piloto clínicos nos quais as células T do doador alloanergized foram infundidos durante ou após o transplante HLA-incompatíveis, resultando em rápida reconstituição imune, infecções poucos e menos grave DECH aguda e crônica do que os destinatários de controle histórico não-manipulado HLA-incompatíveis transplante ^12. Aqui nós descrevemos nosso protocolo atual para a geração de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), que foram alloanergized para HLA-incompatíveis PBMC estimulador não relacionados. Alloanergization é conseguido através allostimulation na presença de anticorpos monoclonais para os ligantes B7.1 e B7.1 para bloquear CD28 mediada costimulation. Esta técnica não requer a produção de estimulador especializados APC e é simples de executar, requerendo apenas um único e relativamente breve ex passo de incubação vivo. Como tal, a abordagem pode ser facilmente padronizado para uso clínico para gerar células T do doador com alloreactivity reduzida, mas mantendo a imunidade de patógenos específicos para transferência adotiva na definição de TACTH para melhorar a reconstituição imune sem DEvH excessiva.

Protocolo

1. Preparação de PBMC

1. Procedimentos de boa técnica asséptica e precauções universais devem ser observadas durante a realização do presente protocolo.
2. Isolar PBMC de doadores voluntários saudáveis ​​por centrifugação gradiente de densidade Ficoll-Hypaque. Alternativamente PBMC criopreservados pode ser ressuscitada.
3. Conte PBMC viável após coloração com Trypan Blue usando um hemocitômetro. Ressuspender PBMC em meios de cultura completo (MC) na concentração de 1 milhão de células viáveis ​​/ mL em um tubo Falcon 15ml.

2. Configurando o Alloanergizing granel Co-cultura

1. PBMCs de dois doadores distintos são necessários para configurar as culturas alloanergization. Células de um doador servirá de resposta e as células de um outro doador servirá como estimulador (chamado de estimulador de Primeira Parte).
2. Coloque 10 milhões estimulador PBMC menos 1 milhão / ml no tubo Falcon de 15 mL e adicionar 100mg de anti-B7.1 e B7.2 anti 100mg de anticorpos para bloquear costimulation. Agite suavemente o tubo e incubar por 30 minutos. Condições de incubação para esta e todas as etapas subseqüentes são 37 CO ° C / 5% _{2 / 80%}
3. Irradiar estimulador CMSP (3,3 Gy) e adicione 50 centímetros a um T-25 ³ Frasco de cultura celular com um boné de gás-permeáveis. Rótulo do frasco "Bulk alloanergizing co-cultura".
4. Adicionar 10ml de responder PBMC (menos 1 milhão de ml / em CM) ao balão.
5. Adicionar mais a cada 100mg de anti-B7.1 e B7.2 anticorpos anti e misture delicadamente antes de colocar o frasco na posição vertical em uma incubadora por 72 horas

3. Configurando o Controle de Volume Co-cultura

1. Coloque 10 milhões estimulador PBMC (menos 1 milhão / ml) em um tubo Falcon 15ml.
2. Irradiar 10000000 estimulador CMSP (3,3 Gy). E adicione 50 centímetros a um ³ Frasco de cultura celular. Rótulo "Bulk controle de co-cultura".
3. Adicionar 10ml de responder CMSP em 1.000 mil / ml no CM para o frasco e misture delicadamente antes de colocar o frasco na posição vertical em uma incubadora por 72 horas.

4. Configurando a reação de linfócitos Primária Mista (MLR) para medir a eficácia da Co-estimulatórias Blockade

1. A eficácia do bloqueio co-estimulação é medido em uma MLR primária que é configurada usando PBMC do alloanergizing granel e controle de co-culturas
2. O MLR primário é configurado no mesmo dia em que as culturas granel foram criados
3. Em primeiro lugar um rótulo U fundo de 96 poços da placa "MLR primário" para cada um dos três pontos no tempo a ser medido (Dia 4, 5 e 6 após pratos são criados).
4. 5 mL de cada um dos Decantar o controle granel e alloanergizing co-culturas em tubos de 15mL Falcon.
5. Pipetar 200mL de suspensão de células de cada tubo Falcon em poços triplicado em cada placa. Rotular estes poços "não bloqueio co-estimulação (CSB)" para as células do controle granel co-culturas e "CSB" para as células da massa alloanergizing co-culturas
6. Adicione 200 ml de CM a 6 poços em cada prato como controles negativos. 200 ml PBS é adicionado a todos os poços vazios para reduzir a evaporação. Placas lugar na incubadora.

5. Configurando o MLR secundário para medir a eficácia de Alloanergization

1. 72 horas depois de configurar a maior co-culturas, alloresponses residual em PBMCs alloanergized são medidos em um MLR secundário. No secundário MLR, PBMC de ambos a maior parte alloanergizing co-cultura eo controle de volume co-cultura são lavados e irradiados com restimulated allostimulator PBMC
2. Para configurar o rótulo MLR secundário um fundo de 96 poços U placa "MLR secundário" para cada um dos três pontos no tempo a ser medido (Dia 3, 5 e 7 após o set up).
3. Remove 5mL de cada um o controle granel e alloanergizing co-culturas, a transferência para tubos de 15mL Falcon e centrifugar por 5-10 minutos a 2000 rpm.Aspirate o sobrenadante com cuidado, interromper o pellet, adicione 10 ml de CM e centrifugar as células novamente. Repita este passo de lavagem.
4. Volte a suspender as células em 1mL de CM. Contar as células viáveis ​​utilizando Trypan coloração azul, e ajustar a concentração de células de 1 milhão de células viáveis ​​responder / mL.
5. Pipetar 100mL de suspensão de células de cada tubo Falcon em poços triplicado de cada prato. Rotular estes poços "Primeiro Partido allorestimulation (FP)"
6. Pipetar 100mL de suspensão de células de cada tubo Falcon em mais 3 poços em cada prato e rotular esses poços "CD3/28 estímulo"
7. Para preparar células estimulador para o MLR secundário, isolar PBMC de sangue fresco (ou ressuscitar PBMC criopreservados) do mesmo doador saudável usado para fornecer PBMCs estimulador primeiro partido no alloanergizing e culturas controle.
8. Suspender PBMC do doador FP numa concentração de 1 milhão de mL / e irradiar (3.3Gy)
9. Adicionar 100mL de células estimulador irradiada para poços chamado "FP allorestimulation"
10. Para os controlos positivos, adicione 1 mL de cada CD3 e anticorpos monoclonais CD28 e 98mL da CM de poços chamado "estimulação CD3/28". Adicione 200 ml de CM a 6 poços em cada prato como controle negativo e 200mL de PBS aos poços vazios. Coloque as placas na incubadora.

6. Medir a especificidade do Alloanergization

1. A especificidade do alloanergization é determinada pela comparação proliferação de células de resposta tirada do alloanergizing preenchido e controle de co-culturas após estimulação com PBMC irradiados obtidos a partir de um "terceiro" dador saudável (ou seja, um dos doadores para o Partido Primeiro) em um secundário MLR.
2. Rótulo três 96 placas bem "Secundário Especificidade MLR" Dia 3, 5 e 7.
3. Remove 5mL de cada um o controle granel e alloanergizing co-culturas transferência para tubos de 15mL Falcon e centrifugar por 5-10 minutos a 2000 rpm. Aspirar o sobrenadante com cuidado, interromper o pellet, adicione 10 ml de CM e centrifugar as células novamente. Repita este passo de lavagem.
4. Volte a suspender as células em 1mL de CM. contagem usando Trypan coloração azul, e ajustar a concentração de células de 1 milhão de células viáveis ​​responder / mL.
5. Para preparar células estimulador de terceiro para MLR secundário, isolar PBMC de sangue fresco (ou ressuscitar criopreservados PBMC) de um doador saudável novo. 100mL pipeta de suspensão celular de cada tubo Falcon em poços triplicado de cada prato. Rotular estes poços "TP allostimulation"
6. Suspender PBMC de um doador TP menos 1 milhão de mL / e irradiar (3,3 Gy)
7. Adicione 200 ml de células estimulador irradiados TP aos poços chamado "allostimulation TP"
8. A especificidade do alloanergization também pode ser determinada pela comparação de proliferação de células de resposta tirada do alloanergizing preenchido e controle de co-culturas após estimulação com um patógeno infecciosas, tais como CMV. Para essa etapa, é imprescindível a utilização de responder PBMC de doadores com previamente demonstrado respostas proliferativas à CMV lisado.
9. Rótulo três 96 placas bem "Secundário MLR CMV" Dia 3, 5 e 7.
10. Para preparar as células para responder a MLR secundário para medir as respostas CMV, transferir 5 ml de cada um o controle granel e alloanergizing co-culturas para tubos de 15 ml e lavar, contar e ressuspender em 1 milhão de células / ml no CM como descrito anteriormente . Pipetar 100mL de suspensão de células de cada tubo Falcon em 3 poços em cada placa.
11. Adicionar 0,1 mL de lisado CMV em 100ul CM aos poços
12. Adicione 200 ml de CM a 6 em todos os poços da placa como controle negativo e adicionar 200ml de PBS aos poços vazios. Coloque as placas na incubadora.

7. Medição Proliferação na MLRS Primário e Secundário

1. Responder a proliferação celular é medida por ensaio timidina incorporação no MLRS primário e secundário. Proliferação é medido no dia 4, 5 e 6 após as placas primárias MLR são criados e no Dia 3, 5 e 7, após as placas secundárias MLR são criados.
2. 1mCi de timidina tritiada é adicionado aos poços 16 horas antes da colheita
3. Após a adição de timidina tritiada, a placa é incubada por uma hora depois further16 colhidas em uma esteira de filtro usando uma colheitadeira Tomtec (ou similar). De ar seco a filtermat por uma hora em seguida, coloque em um saco de amostra, adicionar 5 mL de líquidos de cintilação e selo. Leia a placa em uma cintilação Wallac beta Micro contador ou similar.

8. Cálculo da eficácia da Co-estimulatórias bloqueio na MLR Primária

1. A percentagem de inibição (PI) de alloresponses primário é calculado como 100 x [média cpm em allostimulation poços (granel alloanergy co-cultura PBMC) - média cpm em allostimulation poços (volume de controle co-cultura PBMC)}
   

9. Cálculo da eficácia do Alloanergization na Secundária MLR

O PI de alloresponses secundário é calculada como

10. Cálculo da Especificidade do Alloanergization na Secundária MLR

1. Após reestimulação de células CD3 e CD28 com a, allostimulators TP ou CMV antígeno, a PI de respostas a esses estímulos pode também ser calculado usando esta fórmula. Isso dá uma medida da especificidade do processo alloanergization

11. Gerando PBMC Doadores Alloanergized para uso clínico Após Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas Alogênico (TCTH)

1. PBMC doador Alloanergized podem ser gerados para uso clínico, após HLA-incompatíveis HSCT alogênico utilizando o protocolo descrito acima
2. Ao gerar células para uso clínico, responder PBMC são obtidos a partir do doador HSCT e PBMC estimulador do destinatário HSCT antes do transplante.
3. Ao gerar CMSP para uso clínico, todas as etapas são realizadas sob condições Good Manufacturing Process credenciados tronco instalações de processamento de célula.
4. Ensaios adicionais de controle de qualidade são realizadas incluindo ensaios de endotoxinas e bacterioscopia e cultura para atender critérios de segurança antes do lançamento de células para uso clínico

12. Resultados representante

Usando o HLA-incompatíveis estimulador e responder PBMC, a presença de bloqueio de co-estimulação na MLR primária reduz alloproliferation média de responder PBMC no dia 5 a cerca de 30% (+ / - 10%, média + / - desvio padrão) de que a observada em controle primário MLR, na ausência de bloqueio de co-estimulação. Isto é equivalente a uma inibição média de alloproliferation primário de cerca de 70% (+ / - 10%) no D5, Figura 1 A e B.

No MLR secundário no dia 5, FP alloproliferation de PBMC alloanergized é tipicamente 10-15% (+ / - 10%) do que a observada com o controle equivalente PBMC a uma inibição média de proliferação de 85-90% (+ / - 10 %), Figura 2A e B. Isso demonstra que PBMC alloanergized são hiporresponsivo para allostimulators FP.

Em contraste PBMC alloanergized tipicamente mantêm 70-100% de sua proliferação a mitógenos (CD3/CD28 anticorpos), allostimulators TP e lisado CMV (CMV em doadores-reativa). Isso demonstra que hiporeactividade de PBMC alloanergized é específico para FP aloantígenos.

Figura 1. A. Proliferação (determinada pela incorporação de timidina), em uma reação mista de linfócitos primários utilizando-HLA incompatíveis estimulador e glóbulos responder mononucleares periféricas (PBMC) na ausência ou presença de bloqueio de co-estimulação usando monoclonal humanizado anti-B7.1 e B7.2- anticorpos. Resultados são apresentados como média (+ /-dp) para 8 experimentos usando representante único estimulador-responder pares. B. Percentual de inibição em alloproliferation MLRS primária realizada na presença de bloqueio de co-estimulação usando monoclonal humanizado anti-B7.1 e B7.2-anticorpos. Resultados são apresentados como média (+ /-dp) para o mesmo único estimulador 8-responder pares representado na Figura 1A.

Figura 2. A. Proliferação (determinada pela incorporação de timidina) no secundário, onde MLRS responder PBMC de MLRS primárias realizadas na ausência (controle PBMC) ou a presença de bloqueio de co-estimulação (PBMC alloanergized) são irradiados restimulated com estimuladores primeiro partido. Resultados são apresentados como média (+ /-dp) para os 8 únicos estimulador-responder pares representado na Figura 1. B. Porcentagem de inibição alloproliferation primeira parte, no secundário, onde MLRS responder PBMC de MLRS primária realizada na ausência (controle PBMC) ou a presença de bloqueio de co-estimulação (PBMC alloanergized) são irradiados restimulated com estimuladores primeiro partido. Resultados são apresentados como média (+ /-dp) para os 8 únicos estimulador-responder pares representado na Figura 1 e Figura 2A.

Discussão

A indução de aloantígenos específicos hiporeactividade, ou anergia, em PBMC de doadores via allostimulation na presença de co-estimulatórias bloqueio é uma técnica simples para a geração de PBMC doador com alloreactivity reduzida. Nós desenvolvemos o processo no laboratório e estão atualmente aplicando a estratégia na clínica para gerar PBMC doador com alloreactivity reduzida para perfusão após HLA-incompatíveis HSCT alogênico. O objetivo de usar essa terapia é melhorar a reconstituição imune sem toxicidade excesso. Embora nossa aplicação clínica atual da estratégia é limitada ao estabelecimento de HSCT alogênico, a abordagem poderia ser aplicada a outros ambientes onde dano tecidual é causado por indesejados respostas de células T, tais como a rejeição de transplante de órgão sólido ou de condições auto-imunes.

Vários reagentes podem ser utilizados para bloqueio de CD28 mediada por co-estimulatórias sinais durante o processo de alloanergization co-cultura. Aqui nós descrevemos nosso protocolo atual usando clínico-grade humanizado anticorpos monoclonais murinos dirigidos contra os ligantes de CD28 (B7.1 e B7.2). Não-clínicos grau murino anti-humano B7.1 e B7.2 anticorpos estão comercialmente disponíveis de vários fabricantes. Alternativamente, a proteína de fusão de linfócitos T citotóxicos antígeno (CTLA) 4 Imunoglobulina (Ig) pode ser usado para bloquear costimulation CD28 durante o processo de alloanergization. CTLA4-Ig, que consiste da porção extracelular da molécula CTLA4 ligada ao receptor gamma IgG Fc, se liga com alta afinidade para B7.1 e B7.2. O uso de CTLA4-Ig resulta em eficácia semelhante e especificidade de alloanergization de PBMCs humano.

A técnica de alloanergization é simples de executar. PBMCs frescos ou previamente criopreservados estimulador pode ser utilizado com nenhuma variação significativa no resultado do processo. A exigência de apenas um relativamente breve etapa única de incubação ex vivo sem celular classificação procedimentos minimiza potencial de morte celular e contaminação bacteriana de células antes da infusão, que torna a estratégia relativamente simples para aplicar em uma escala clínica.

Uma limitação da abordagem que descrevem (e outras abordagens para seletivamente reduzir alloreactivity das células humanas) é a ausência de um ensaio em tempo real para determinar alloreactivity residual. Ensaios de proliferação levar 3-5 dias para realizar a confirmação da redução de alloreactivity e células geradas para uso clínico deve ser infundido antes de os resultados destes ensaios estão disponíveis. Além disso, a medição da proliferação de PBMCs por incorporação de timidina, embora fáceis de executar, as medidas de proliferação de células B e outras subpopulações de células T, além de proliferação celular. Diluição CFSE tintura de responder PBMCs pode ser usado como um teste alternativo e permite a determinação de um subconjunto de células T específicas alloproliferation. Uma forma de melhorar a aplicação clínica da nossa abordagem estratégia seria a de desenvolver e validar um ensaio de alloreactivity que leva apenas algumas horas para realizar o que poderia ser realizada antes da liberação das células alloanergized para uso clínico.

Além de demonstrar o efficiacy da estratégia também é importante para confirmar o processo alloanergization especificidade. Isso pode facilmente ser feito por determinação da preservação relativa de alloresponses específicas para allostimulators de terceiros e quando as células de doadores CMV-reativa estão sendo alloanergized, pela preservação de respostas proliferativas à CMV

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Hypaque PLUS	GE Life Sciences	17-1440-02
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine 200mM	Invitrogen	25030-081
Gentamicina	Invitrogen	15750-060
Humanos soro AB (inactivado pelo calor)	Gemini Bio-Products	100-512	Use lotes validado
Complete Meios de Cultura (500ml)			440 ml RPMI 1640, 50 ml de soro AB, Hepes 5ml, 5 ml Glutamina, 167uL Gentamicina
Irradiador	Gammacell 1000
T-25 frascos de cultura celular com gás permeável tampas	Corning, Inc.	3056
Monoclonal humanizado anti-B7.1 e B7.2 anticorpos anti			Veja o texto do protocolo
U fundo 96 placas de cultura bem	BD para laboratórios	353077
Anticorpos monoclonais CD3	Beckman Coulter	IM0178	Reconstituir com água destilada 200ml
Anticorpo monoclonal CD28	Beckman Coulter	IM1376	Reconstituir com água destilada 200ml
CMV grau 2 antígeno	Microbix	EL-01-02
Timidina tritiada	NEN	NET027
Fluid Cintilação	PerkinElmer, Inc.	1205-440
Harvester	Tomtec
Impresso Filtermat A	PerkinElmer, Inc.	1450-421
Filtro Bag	PerkinElmer, Inc.	1450-432
1450 MicroBeta TriLux Contador de Cintilação	Wallac