L'induzione di anergia Alloantigen specifici nelle cellule mononucleari del sangue periferico di stimolazione Alloantigen con co-stimolatorie blocco del segnale

Riepilogo

Questo documento descrive una semplice tecnica per indurre alloantigen specifiche anergia nelle cellule mononucleari del sangue periferico. La tecnica può essere applicata clinicamente per generare non alloreactive cellule del donatore. L'infusione di queste cellule potrebbero migliorare la ricostituzione immunitario e ridurre la tossicità dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche.

Abstract

Trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (AHSCT) offre le migliori possibilità di cura per molti pazienti affetti da patologie ematologiche congenite ed acquisite. Purtroppo, il trapianto di cellule T del donatore alloreactive che riconoscono e danneggiare i tessuti sani del paziente può portare a Graft-versus-host disease (GvHD) ^1. Una sfida per AHSCT di successo è la prevenzione della GvHD senza compromissione associati degli effetti benefici dei linfociti T del donatore, in particolare la ricostituzione immunitaria e prevenzione delle recidive. GvHD può essere evitato non specifici esaurimento delle cellule T del donatore da innesti di cellule staminali o da somministrazione di immunosoppressione farmacologica. Purtroppo questi approcci infezione e la malattia aumentano ricaduta ^2-4. Una strategia alternativa è quella di esaurire alloreactive selettivamente le cellule T del donatore dopo allostimulation da cellule che presentano l'antigene destinatario (APC), prima del trapianto. Primi studi clinici di queste strategie allodepletion migliorato la ricostituzione immunitaria dopo trapianto HLA-non corrispondenti senza eccessi GvHD ^{5, 6.} Tuttavia, alcune tecniche allodepletion richiedono specializzata destinatario produzione APC ^{6, 7} e alcuni approcci possono avere effetti off-target compreso l'esaurimento del donatore specifici dell'agente patogeno e le cellule T CD4 ⁸ e cellule T regolatorie ^9. Un approccio alternativo è l'inattivazione delle cellule T del donatore alloreactive attraverso l'induzione di specifici alloantigen iporesponsivi. Ciò si ottiene stimolando le cellule del donatore con il destinatario APC, fornendo blocco di CD28-mediata co-stimolazione dei segnali ^10. Questo approccio "alloanergization" riduce alloreattività di 1-2 log preservando patogeni associati al tumore e le risposte delle cellule T antigene in vitro ¹¹ . La strategia è stata impiegata con successo in 2 e 1 completato gli studi in corso clinico pilota in cui sono state infuse alloanergized linfociti T del donatore durante o dopo l'HLA-HSCT non corrispondenti con conseguente rapida ricostituzione immunitaria, infezioni pochi e meno gravi GvHD acuta e cronica di destinatari di controllo storico di non manipolata HLA-trapianto non corrispondenti ^12. Qui si descrive la nostra attuale protocollo per la generazione di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) che sono stati alloanergized per HLA-non corrispondenti PBMC stimolatore indipendenti. Alloanergization si ottiene allostimulation in presenza di anticorpi monoclonali per i ligandi B7.1 e B7.1 di bloccare CD28-mediata costimolazione. Questa tecnica non richiede la produzione di stimolatore APC specializzate ed è semplice da eseguire, che richiedono solo un singolo e relativamente breve fase ex vivo di incubazione. Come tale, l'approccio può essere facilmente standardizzata per l'uso clinico di generare cellule T del donatore con alloreattività ridotta ma mantenendo specifici dell'agente patogeno e l'immunità per il trasferimento adottivo nel contesto di AHSCT per migliorare la ricostituzione immunitaria senza GvHD eccessivo.

Protocollo

1. Preparazione dei PBMC

per sempre tecniche asettiche e precauzioni universali devono essere rispettate durante lo svolgimento di questo protocollo.
1. Isolare PBMC da donatori volontari sani per centrifugazione gradiente di densità con Ficoll-Hypaque. In alternativa PBMC crioconservati possono essere resuscitato.
2. Conte PBMC vitali dopo colorazione con Blu tripan utilizzando un emocitometro. Risospendere PBMC in terreni di coltura completo (CM) ad una concentrazione di 1 milione di cellule vive / ml in un tubo 15 ml Falcon.

2. Impostazione del Alloanergizing Bulk Co-cultura

1. PBMC da due donatori separati per impostare le culture alloanergization. Le cellule da un donatore servirà come il risponditore e le cellule di un altro donatore servirà come stimolatore (definito lo stimolatore First Party).
2. Place 10 milioni stimolatore PBMC a 1 milioni / ml in una provetta da 15 ml Falcon e aggiungere 100 mg di anti-B7.1 e B7.2 100mg di anti anticorpi per bloccare costimolazione. Agitare delicatamente il tubo ed incubare per 30 minuti. Condizioni di incubazione per questo e per tutti i passaggi successivi sono 37 CO ° C / 5% ₂ / 80% di umidità
3. Irradiare stimolatore PBMC (3,3 Gy) e aggiungere ad un T-25 50 centimetri ³ Cultura fiasco cella con un gas-permeabile cap. Etichetta il pallone "Bulk alloanergizing co-cultura".
4. Aggiungi 10 ml di responder PBMC (a 1 milioni / ml in CM) al pallone.
5. Aggiungi un 100mg ogni ulteriore di anti-B7.1 e B7.2 contro gli anticorpi e mescolare delicatamente prima di mettere il pallone in posizione verticale in un incubatore per 72 ore

3. Impostazione del controllo di massa co-cultura

1. Place 10 milioni stimolatore PBMC (a 1 milioni / ml) in una provetta 15 ml Falcon.
2. Irradiare 10 milioni stimolatore PBMC (3,3 Gy). E aggiungere ad un 50 centimetri ^{3 fiasco cultura. Etichetta "massa di controllo co-cultura".}
3. Aggiungi 10 ml di responder PBMC a 1 milioni / ml in CM al pallone e mescolare delicatamente prima di mettere il pallone in posizione verticale in un incubatore per 72 ore.

4. Impostazione della reazione primaria linfocitaria mista (MLR) per misurare l'efficacia della co-stimolatorie blocco

1. L'efficacia del blocco costimolazione è misurata in una MLR primaria che viene configurato tramite PBMC dal alloanergizing massa e di controllo co-culture
2. Il primario MLR è impostato lo stesso giorno che le culture di massa sono stati istituiti
3. Prima etichetta uno U 96 pozzetti a fondo piatto "Primary MLR" per ciascuno dei tre punti di tempo da misurare (giorno 4, 5 e 6 dopo le piastre sono istituiti).
4. 5mL Decantare da ciascuno di controllo di massa e alloanergizing co-colture in tubi Falcon 15 ml.
5. Pipettare 200 ml di sospensione cellulare da ciascuna provetta Falcon in pozzi triplice copia su ogni piatto. Etichetta questi pozzi "no blocco costimolazione (CSB)" per le cellule dal controllo di massa co-culture e "CSB" per le cellule dalla massa alloanergizing co-culture
6. Aggiungi 200 ml di CM a 6 pozzi su ogni piatto come controlli negativi. 200 mL di PBS è aggiunto a tutti i pozzi vuoti per ridurre l'evaporazione. Piastre posto in incubatrice.

5. Impostazione del MLR secondaria di misurare l'efficacia di Alloanergization

1. 72 ore dopo aver impostato la maggior parte di co-culture, alloresponses residuo nelle PBMC alloanergized sono misurati in una MLR secondaria. Nella secondaria MLR, PBMC sia il grosso alloanergizing co-coltura e il controllo di massa co-coltura vengono lavati e restimolato con PBMC irradiati allostimulator
2. Per impostare l'etichetta secondaria MLR uno U 96 pozzetti a fondo piatto "MLR secondaria" per ciascuno dei tre punti di tempo da misurare (Giorno 3, 5 e 7 dopo l'allestimento).
3. Rimuovi 5mL da ciascuno di controllo di massa e alloanergizing co-culture, trasferimento in tubi Falcon 15 ml e centrifugare per 5-10 minuti a 2000 rpm.Aspirate il sopranatante facendo attenzione, disturbare il pellet, aggiungere 10 ml di CM e centrifugare le cellule di nuovo. Ripetere questa fase di lavaggio.
4. Risospendere le cellule in 1 ml di CM. Contare le cellule vitali mediante colorazione blu Trypan, e regolare la concentrazione cellulare a 1 milione di cellule vitali responder / ml.
5. Pipettare 100 ml di sospensione cellulare da ciascuna provetta Falcon in pozzi triplice copia di ogni piatto. Etichetta questi pozzi "First Party (FP) allorestimulation"
6. Pipettare 100 ml di sospensione cellulare da ciascuna provetta Falcon in un ulteriore 3 pozzi in ogni piatto ed etichettare questi pozzi "CD3/28 stimolazione"
7. Per preparare le cellule stimolatore per la secondaria MLR, isolare PBMC dal sangue fresco (o resuscitare crioconservati PBMC) dallo stesso donatore sano usato per prima fornitura PBMC stimolatore partito nella alloanergizing e colture di controllo.
8. Sospendere PBMC dal donatore FP ad una concentrazione di 1 milione / ml e irradiare (3.3Gy)
9. Aggiungi 100 ml di cellule stimolatore irradiati a pozzi etichetta "FP allorestimulation"
10. Per i controlli positivi, aggiungere 1 ml ciascuno di CD3 e CD28 anticorpi monoclonali e 98mL di CM a pozzi etichetta "stimolazione CD3/28". Aggiungere 200 ml di CM a 6 pozzi in ogni piatto come un controllo negativo e 200 mL di soluzione salina in pozzi vuoti. Posizionare le piastre in incubatrice.

6. Misurare la Specificità del Alloanergization

1. La specificità del alloanergization è determinata confrontando la proliferazione delle cellule responder preso dal alloanergizing completato e controllo co-colture dopo stimolazione con PBMC irradiati da un "terzo" donatore sano (cioè un donatore diverso da quello di prima parte) in una secondaria MLR.
2. Etichetta tre piastre a 96 pozzetti "Specificità MLR secondaria" Giorno 3, 5 e 7.
3. Rimuovi 5mL da ciascuno di controllo di massa e alloanergizing co-culture trasferimento in tubi Falcon 15 ml e centrifugare per 5-10 minuti a 2000 giri. Aspirare il surnatante con cura, può interferire sulla pellet, aggiungere 10 ml di CM e centrifugare le cellule di nuovo. Ripetere questa fase di lavaggio.
4. Risospendere le cellule in 1 ml di CM. contare con colorazione blu Trypan, e regolare la concentrazione cellulare a 1 milione di cellule vitali responder / ml.
5. Per preparare le cellule stimolatore terza parte per la secondaria MLR, isolare PBMC dal sangue fresco (o resuscitare crioconservati PBMC) da un donatore sano nuovo. Pipettare 100 ml di sospensione cellulare da ciascuna provetta Falcon in pozzi triplice copia di ogni piatto. Etichetta questi pozzi "TP allostimulation"
6. Sospendere PBMC da un donatore TP a 1 milione / mL e irradiare (3,3 Gy)
7. Aggiungi 200 ml di cellule irradiate stimolatore TP a pozzi etichetta "allostimulation TP"
8. La specificità del alloanergization può anche essere determinata confrontando la proliferazione delle cellule responder preso dal alloanergizing completato e controllo co-colture dopo stimolazione con agenti patogeni infettivi come CMV. Per questa fase è indispensabile l'utilizzo di risponditore PBMC da donatori con precedenza dimostrato risposta proliferativa al CMV lisato.
9. Etichetta tre piastre a 96 pozzetti "Secondario MLR CMV," Giorno 3, 5 e 7.
10. Per preparare le cellule responder per il MLR secondaria di misurare le risposte CMV, trasferimento di 5 ml di ciascuno dei controllo di massa e alloanergizing co-culture di provette da 15 ml e lavare, contare e risospendere a 1 milione di cellule / ml nel CM come descritto in precedenza . Pipettare 100 ml di sospensione cellulare da ciascuna provetta Falcon in una 3 pozzi su ogni piatto.
11. Aggiungere 0,1 mL di CMV lisato in 100ul CM ai pozzi
12. Aggiungere 200 ml di CM a 6 pozzi su tutti piastra come controllo negativo e aggiungere 200 mL di soluzione salina in pozzi vuoti. Posizionare le piastre in incubatrice.

7. Misurare la proliferazione in MLRS primaria e secondaria

1. Proliferazione cellulare risponditore è determinato tramite test timidina nel MLRS primaria e secondaria. Proliferazione è misurata in occasione della Giornata 4, 5 e 6 dopo le piastre MLR primarie sono istituiti e alla Giornata 3, 5 e 7 dopo le piastre MLR secondaria sono istituiti.
di timidina triziata viene aggiunto ai pozzetti 16 ore prima della raccolta
2. Dopo l'aggiunta di timidina triziata, la piastra viene incubata per un further16 ore, raccolte su un tappeto filtro con un harvester Tomtec (o simili). Far asciugare il FILTERMAT per un'ora poi posto in un sacchetto di campione, aggiungere 5 ml di liquido di scintillazione e tenuta. Leggere la piastra in una scintillazione Wallac Micro beta contatore o simili.

8. Calcolo di efficacia di co-stimolatorie blocco nella Primaria MLR

1. La percentuale di inibizione (PI) di alloresponses primario è calcolato come 100 x [media cpm in allostimulation pozzi (bulk alloanergy co-coltura PBMC) - media cpm in allostimulation pozzi (massa di controllo co-coltura PBMC)}
   

9. Calcolo di efficacia di Alloanergization nella secondaria MLR

Il PI di alloresponses secondario è calcolato come

10. Calcolo della Specificità del Alloanergization nella secondaria MLR

1. Dopo restimolazione di cellule con CD3 e CD28, allostimulators TP o antigene CMV, il PI di risposte a questi stimoli possono anche essere calcolato usando questa formula. Questo dà una misura della specificità del processo alloanergization

11. Generazione PBMC Alloanergized donatori per l'uso clinico dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (HSCT)

Alloanergized possono essere generate per l'uso clinico dopo HLA-trapianto allogenico non corrispondenti utilizzando il protocollo di cui sopra
1. Quando si generano le cellule per uso clinico, il rispondente PBMC sono ottenuti dal donatore HSCT e stimolatore PBMC da parte del destinatario HSCT prima del trapianto.
2. Quando si generano PBMC per uso clinico, tutte le misure effettuate in condizioni buone di processo di produzione in strutture accreditate delle cellule staminali di elaborazione.
3. Ulteriori test di controllo di qualità vengono eseguiti anche test endotossine e colorazione di Gram e la cultura per soddisfare criteri di sicurezza prima del rilascio di cellule per uso clinico

12. Rappresentante Risultati

Utilizzo HLA-stimolatore non corrispondenti e risponditore PBMC, la presenza di blocco di costimolazione nel primario MLR riduce alloproliferation media di PBMC responder al 5 ° giorno al 30% circa (+ / - 10%, media + / - deviazione standard) di quello osservato nei controllo primario MLR, in assenza di blocco costimolazione. Questo equivale ad una inibizione media di alloproliferation primaria di circa il 70% (+ / - 10%) a D5, Figura 1 A e B.

Nel MLR secondaria a 5 ° giorno, alloproliferation FP di PBMC alloanergized è generalmente pari al 10-15% (+ / - 10%) di quello osservato con PBMC controllo equivalente ad una media di inibizione della proliferazione del 85-90% (+ / - 10 %), Figura 2A e B. Questo dimostra che PBMC alloanergized sono iporesponsivi a allostimulators FP.

In PBMC contrasto alloanergized trattengono generalmente 70-100% della loro proliferazione ai mitogeni (CD3/CD28 anticorpi), allostimulators TP e CMV lisato (in CMV-reattiva donatori). Questo dimostra che iporesponsività di PBMC alloanergized è specifico per FP alloantigeni.

Figura 1. A. Proliferazione (determinata dalla timidina) in una primaria reazione mista linfocitaria con HLA-stimolatore non corrispondenti e le cellule mononucleate del sangue periferico responder (PBMC) in assenza o la presenza di blocco di costimolazione con monoclonale umanizzato anti-B7.1 e B7.2 anticorpi. I risultati sono mostrati come media (+ /-SD) per 8 esperimenti utilizzando rappresentante unico stimolatore-responder coppie. B. Inibizione percentuale di alloproliferation in MLRS primaria eseguita in presenza del blocco costimolazione con monoclonale umanizzato anti-B7.1 e B7.2-anticorpi. I risultati sono mostrati come media (+ /-sd) per lo stesso 8 unico stimolatore-responder coppie illustrato nella figura 1A.

Figura 2. A. Proliferazione (determinata dalla timidina) in MLRS secondaria dove risponditore PBMC da MLRS primaria eseguiti in assenza (controllo PBMC) o la presenza di blocco di costimolazione (alloanergized PBMC) sono restimolato irradiati con stimolatori primo partito. I risultati sono mostrati come media (+ /-SD) per gli 8 unico stimolatore-responder coppie illustrato nella figura 1. B. Inibizione percentuale di alloproliferation di prima parte in MLRS secondaria dove risponditore PBMC da MLRS primaria eseguiti in assenza (controllo PBMC) o la presenza di blocco di costimolazione (alloanergized PBMC) sono restimolato irradiati con stimolatori primo partito. I risultati sono mostrati come media (+ /-SD) per gli 8 unico stimolatore-responder coppie raffigurato in Figura 1 e Figura 2A.

Discussione

L'induzione di specifici alloantigen iporesponsivi, o anergia, in PBMC donatore attraverso allostimulation in presenza di co-stimolatorie blocco è una semplice tecnica per la generazione di PBMC donatore con alloreattività ridotta. Abbiamo sviluppato il processo in laboratorio e sono attualmente in vigore la strategia in clinica per generare PBMC donatore con alloreattività ridotto per infusione dopo HLA-non corrispondenti trapianto allogenico. L'obiettivo di utilizzare tale terapia è quello di migliorare la ricostituzione immunitaria senza tossicità in eccesso. Anche se il nostro attuale applicazione clinica della strategia è limitata alla definizione di HSCT allogenico, l'approccio potrebbe essere applicato ad altri contesti in cui è causato danni ai tessuti da indesiderate risposte delle cellule T, come il rigetto del trapianto di organi solidi o condizioni autoimmuni.

Reagenti diversi può essere usato per il blocco di CD28-mediata co-stimolatorie segnali durante il processo di alloanergization co-coltura. Qui si descrive il nostro protocollo corrente utilizzando clinica-grade umanizzato anticorpi monoclonali murini diretti contro i ligandi del CD28 (B7.1 e B7.2). Non clinici grado murino anti-umano B7.1 e B7.2 anticorpi sono disponibili in commercio da diversi produttori. In alternativa, la proteina di fusione Antigen linfociti T citotossici (CTLA) 4-immunoglobuline (Ig) può essere utilizzato per bloccare costimolazione CD28-durante il processo di alloanergization. CTLA4-Ig, che consiste della porzione extracellulare della molecola CTLA4 legato al recettore Fc gamma IgG, si lega con alta affinità per B7.1 e B7.2. L'uso di CTLA4-Ig risultati in termini di efficacia simile e la specificità di alloanergization di PBMC umani.

La tecnica di alloanergization è semplice da eseguire. Freschi o crioconservati precedentemente PBMC stimolatore può essere utilizzato senza variazioni significative nel risultato del processo. Il requisito per un solo relativamente breve fase di incubazione ex vivo senza cellulare riduce al minimo le procedure di smistamento potenziale di morte cellulare e la contaminazione batterica delle cellule prima dell'infusione che rende la strategia relativamente semplice da applicare su scala clinica.

Un limite dell'approccio che descriviamo (e altri approcci per ridurre selettivamente alloreattività di cellule umane) è l'assenza di un test in tempo reale per determinare alloreattività residuo. Saggi di proliferazione prendere 3-5 giorni per effettuare per confermare la riduzione del alloreattività e cellule generate per uso clinico deve essere infuso prima dei risultati di questi test sono disponibili. Inoltre, la misurazione della proliferazione delle PBMC per incorporazione timidina, anche se di facile esecuzione, le misure di proliferazione delle cellule B e sottoinsiemi di cellule di altri oltre a proliferazione delle cellule T. Colorante diluizione CFSE di risponditore PBMC può essere utilizzato come un test alternativo e consenta di individuare cellule T sottoinsieme specifico alloproliferation. Un modo per migliorare l'applicazione clinica della nostra strategia di approccio sarebbe quello di sviluppare e validare un saggio di alloreattività che dura solo poche ore per effettuare che potrebbe essere effettuata prima del rilascio di cellule alloanergized per uso clinico.

Oltre a dimostrare la efficiacy della strategia è anche importante per confermare il processo di alloanergization specificità. Questo può essere fatto facilmente determinare la relativa conservazione del alloresponses specifiche per allostimulators di terze parti e quando CMV-reattiva cellule del donatore vengono alloanergized, per la conservazione della risposta proliferativa al CMV

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Hypaque PLUS	GE Life Sciences	17-1440-02
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
L-Glutammina 200mm	Invitrogen	25030-081
Gentamicina	Invitrogen	15750-060
Human siero AB (inattivato con il calore)	Gemini Bio-Prodotti	100-512	Usa lotti convalidato
Media Cultura completo (500ml)			440 ml RPMI 1640, 50ml siero AB, Hepes 5 ml, 5 ml di glutammina, 167uL Gentamicina
Irradiator	GammaCell 1000
Palloni Cultura T-25 celle con gas permeabili tappi	Corning, Inc.	3056
Monoclonale umanizzato anti-B7.1 e B7.2 anticorpi contro			Vedi il testo del protocollo
U fondo 96 piastre di coltura e	BD da laboratorio	353077
Anticorpi monoclonali CD3	Beckman Coulter	IM0178
Anticorpo monoclonale CD28	Beckman Coulter	IM1376
CMV grado 2 antigene	Microbix	EL-01-02
Timidina triziata	NEN	NET027
Scintillazione Fluid	PerkinElmer, Inc.	1205-440
Harvester	Tomtec
Stampato FILTERMAT A	PerkinElmer, Inc.	1450-421
Borsa Filtro	PerkinElmer, Inc.	1450-432
1450 MicroBeta TRILUX contatore a scintillazione	Wallac