Etilen Glikol Tabanlı Vitrifikasyon Fare Embriyolar Kriyoprezervasyon

Özet

Fare embriyoları için etilen glikol tabanlı Vitrifikasyon yöntemi açıklanmıştır. , Sadeliği ve düşük embriyonik toksisite diğer yöntemler için avantajlı olduğunu ve bu nedenle farelerin kendilenmiş ve gen modifiye fareler de dahil olmak üzere birçok suşları, genel olarak uygulanabilir.

Özet

Fare embriyo Kriyoprezervasyon birçok suşu farelerin genetik modifikasyon tarafından üretilen ve sayısı sürekli geçen yıl artmaktadır çünkü, biyomedikal bilimler destekleyen bir teknolojik temelini oluşturmaktadır. Onun teknik gelişme, daha ^sonra, 1980'lerin sonlarında 2 geliştirilen vitrifikasyon ^yöntemleri takip 1970'lerde 1 yavaş dondurma yöntemleri ile başladı. Genellikle, ikinci teknik çabukluk, basitlik, ve kurtarılan embriyoların yüksek beka avantajlıdır. Ancak, içerdiği cryoprotectants son derece toksik ve sonraki embriyo gelişimi etkileyebilir. Bu nedenle, teknik çözümleri 4 soğutulur bile, farelerde belirli suşları için geçerli değildi ° C embriyo işleme sırasında toksik etkisini azaltmak için. RIKEN BioResource Merkezi, 5000'den fazla farklı genetik geçmişleri ve fenotipleri ile fare suşlarının ³ korunur ve bu nedenle bir vitrifikasyon te optimizechnique ile ortam sıcaklığı ⁴ sırlama ve çözülme (veya daha doğrusu, sıvılaştırılarak) sonra yüksek embriyo hayatta kalma faydaları, farelerin birçok farklı suşları embriyolar cryopreserve yapabilirsiniz.

Burada, merkezimizde başarıyla kullanılmakta olan fare embriyoları için bir vitrifikasyon yöntemi sunuyoruz. Kriyoprezervasyon çözüm yerine DMSO embriyolar ⁵ toksisite en aza indirmek için etilen glikol içerir. Aynı zamanda, sırasıyla Devitrifikasyon önlenmesi ve osmotik ayarlama için Ficoll ve sakaroz içerir. Embriyolar, oda sıcaklığında ele ve 5 dakika içinde sıvı azot transfer edilebilir. Orijinal bir yöntem olarak plastik kaplar payet için optimize edilmiş olduğundan, biz biraz laboratuvarlarda daha kolay erişilebilir ve fiziksel hasarlara karşı daha dayanıklı cryotubes için protokol değiştirdiniz. Biz de kritik bir ste çünkü ayrıntılı olarak vitrifiye embriyolar çözülme sürecinin nasıl geliştiğini anlatabilircanlı farelerin etkin kurtarma için p. Bu metodolojileri, güvenli ve maliyet-etkin bir şekilde daha sonra kullanmak için fare suşlarının korunması gereken araştırmacı ve teknisyenler için yararlı olacaktır.

Protokol

Deney genel şeması Şekil. 1.

1. Reaktif Hazırlama

1. Lütfen aşağıdaki grafiğe göre, 100 ml cam şişe taban orta (burada PB1 olarak bilinen) olun:

   	MW	mM	mg/100
   NaCl	58,4	136,98	800,0
   KCl	74,6	2,68	20,0
   KH 2 PO 4	136,1	1,47	20,0
   Na 2 HPO 4 .12 H 2 O	358,14	8,04	288,1
   MgCl 2, 6H 2 O	203,3	0,49	10,0
   Glikoz	180,2	5,56	100,0
   Na piruvat	110	0,33	3,6
   CaCl 2, 2H 2 O	147	0,9	13,2
   Penisilin G			6.0 (yaklaşık)

2. Ficoll-sakkaroz (FS) çözümü:
   1. 14 ml, 50 ml tüp PB1 çözüm için aşağıdaki kimyasallar ekleyin.

      Ficoll 70	6.0 g
      Sakaroz	3.424 g
      BSA	42.0 mg

   2. Ficoll 70 PB1 çözüm sakaroz tamamen eriyene kadar karıştırın ve iyice çalkalayınız.
   3. BSA, üzerinde tam bir çözülme kontrol ettikten sonra, çözüm yüzey eklemek ve bunu tutmakBSA kadar 4oC tamamen çözülmüş (> 4 saat veya gece boyunca).
3. 50 ml tüp dengeleme çözümü (EFS20) ve vitrifikasyon solüsyonu (EFS40):
   • EFS20:% 20 (v / v) etilen glikol,% 24 (w / v) Ficoll ve BSA PB1 0.4 mol / L sakkaroz
   • EFS40:% 40 (v / v) etilen glikol,% 18 (w / v) Ficoll ve BSA PB1 0.3 mol / L ^* sakaroz
     ^* BALB / c veya ICR gerginlik embriyolarında ⁶ cryodamage daha duyarlıdır, çünkü, 0.9 mol / L sakkaroz sakaroz konsantrasyonu artırır.

   	EFS20 çözüm	EFS40 çözüm
   Etilen glikol	1 ml	2 ml
   FS çözüm	4 ml	3 ml

4. Filtrasyon ile 0.45 mikron filte kullanarak çözüm sterilizer. 4, 5 ml polistiren tüpleri ve mağaza alikotları olun ° C Bunlar yaklaşık 6 ay için kullanılabilir.
5. 0.75 M sakkaroz (TS1) içeren embriyo çözülme çözüm hazırlanması
   1. PB1 7.7 g sakaroz (adım 1.1 hazırlanan) çözülür ve toplam hacim 30 ml getirmek. Yavaşça sallayarak sakaroz tamamen eriyene kadar karıştırın.
   2. 90 mg BSA çözüm yüzey üzerine ekleyin ve tamamen eriyene kadar stand it bırakın.
   3. Çözüm filtrasyon ile sterilize edin.
   4. 4 ° C'de kısım ve mağaza Yaklaşık 1 ay süreyle kullanılabilir.
   
   Not: TS1, aynı zamanda piyasada bulunan M2 hazırlanmış olabilir.
   
   6. 7.7 g sakaroz M2 çözülür ve toplam hacim 30 ml getirmek.
   7. Yavaşça sallayarak sakaroz tamamen eriyene kadar karıştırın.
   8. Çözüm filtrasyon ile sterilize edin.
   9. 4oC kısım ve saklayın. Yaklaşık 1 ay süreyle kullanılabilir.
6. TS2 (çözülme çözüm: 0.25 M sukroz) içeren
   1. Uygun olarak, PB1 veya M2 20 ml hacmi 10 ml TS1 seyreltilir.
   2. 4 ° C'de kısım ve mağaza Yaklaşık 1 ay süreyle kullanılabilir.

2. 2-hücre Mouse Embriyolar, Vitrifikasyon

1. Doğal çiftleşme ya da in vitro fertilizasyon teknikleri geleneksel 2-hücreli fare embriyoları hazırlayın.
2. Kısım cryotube içine 50 ul EFS40. Bundan sonra, oda sıcaklığında vitrifikasyon prosedürünün geri kalanını gerçekleştirmek.
3. EFS20 35 mm veya 60 mm plastik Petri kabı alt kısım 50 ul.
4. Kültür ortamı sadece minimum miktarda kılcal bir bardak kullanarak EFS20 30 embriyolar aktarın. 2 dakika için bir zamanlayıcı başlayın.
   Not: embriyolar açılan alt yerleştirin. Bu embriyoların verimli dehidratasyon yapar. Stereomikroskopta embriyo morfolojisi kontrol edin. Şekil olarak Susuz embriyolar çekmiş, bir morfoloji göstermektedir. 2A.Onlar yeterince kurutulmuş değilseniz, 1 veya 2 dakika bekleyin.
5. Yaklaşık 1,5 dakika, çözümün sadece asgari miktarı ile EFS20 damla embriyolar pick up. Adım 2.1 'de hazırlanan cryotube EFS40 aktarabilirsiniz. Not: En iyi sonuç için, tüm embriyolar yaklaşık 2 dakika EFS40 aktarılır, böylece embriyolar toplayıp zamanlamasını ayarlayın.
6. 1 dakika bekleyin.
7. Cryotube doğrudan sıvı azot (LN ₂₎ içine koyun.

3. Vitrifiye 2-hücreli Fare Embriyolar Çözülme

1. Çözülme önce, kurtarılan embriyolar embriyo kültür ortamı 10 ul damla (3.13 adım) bir yemek hazırlayın. CO ₂ inkübatör petrol ve yer ile çanak kullanana kadar örtün. Not: Bu deneyde kullanılan rutin embriyo kültürü için herhangi bir ortam olsa da, M16 orta gibi yüksek ozmolarite medya önermektedir.
2. 37 ° C'ye kadar TS1 Sıcak
3. Bir yüz maskesi ve cryogloves koyun. LN ₂ t açınank ve embriyoları içeren bir cryotube almak.
4. Tüpün üst hızla açmak ve LN ₂ atın. Sonraki aşamada dondurma TS1 önlemek için 30 saniye bekleyin.
5. Tüpe TS1 850 ul (37 ° C) ekleyin ve çözüm eşit eriyene kadar nazik pipettings (25 saniye içinde on kat) tarafından çözüm karıştırmak için bir 1000ul pipet kullanın.
6. , Plastik bir 60 mm Petri kabında (ya da bir saat camı) (Şekil 3A) tüp tüm hacim aktarın . Not: Adım 3.14 CO ₂ inkübatör yerleşene kadar Embriyolar oda sıcaklığında (22-25 ° C) ele alınmalıdır.
7. 3 dakika süreyle bir zamanlayıcı başlayın.
8. Embriyoları içeren orta çanak (Şekil 3B) yüzeyine yayılmış kadar çanak TS1 yaklaşık 2 dakika, hafifçe sallayın. Not: Bu TS1 için transfer yüzeyine yakın yüzen embriyolar nedeniyle dibe yardımcı olacaktır.
9. Th üzerine üç 50 ul TS2 damla koyune kap (Şekil 3C).
10. TS1 3 dakika sonra, bir stereomikroskopta embriyo morfolojisi kontrol edin, onlar biraz çekmiş olmalı. TS1 önceki embriyo morfolojisi (Şekil 2B) ve daha sonra (Şekil 2C). Not: embriyoların hala şiş, 3 dk ile 1 TS1 içinde saklayın.
11. Embriyoların Pick up ve TS2 ilk damla (Şekil 3D) aktarabilirsiniz. 3 dk için Sayacı başlat
12. 3 dakika sonra, üçüncü bir damla (Şekil 3E) sonra ikinci damlasına kadar embriyo transferine ve .
13. Adım 3.1 hazırlanan kültür ortamı embriyoların transferi. Embriyolar Şekil şeklinde. 2D.
14. CO ₂ inkübatör yerleştirin çanak. Yaklaşık 10 dakika sonra, TS2 yapılmıştır sakaroz yıkamak için kültür ortamı sonraki düşüş embriyo transferi.
15. Embriyo transferi kadar CO2 inkübatör kültür devam edin.
    Not: Transferi Embryçözülme, gün alıcı kadın siyon hatası os. , In vitro Uzun kültür farelerin bazı suşları embriyo canlılığı azalabilir .

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Çözülme Tablo 1 ve 2'de sunulmuştur ve in vivo embriyo geliştirme sonra In vitro. Bu protokolün avantajları, farelerde farklı suşları çözülme ve geniş uygulanabilirliği sonra embriyoların yüksek beka.

Gerginlik	Toplam tüpler Sayısı	Vitrifiye embriyoların sayısı	Kurtarılan (No (%))	Morfolojik olarak normal (No (%))	Blastosist geliştirme (No (%))
C57BL/6J	20	400	397 (99)	394 (99)	342 (87)
BALB / CA	15	300	296 (99)	282 (95)	238 (84)
ICR	24	480	474 (99)	443 (93)	398 (90)

Tablo 1, ortak fare suşlarının vitrifiye çözülmüş embriyoların in vitro- geliştirme

Embriyoların Durumu	Alıcı kadın sayısı	Embriyoların No transfer	İmplantasyonu siteleri (No (%))	Canlı yavrular (No (%))
Taze	12	180	141 (78.3)	110 (61.1)
Vitrifiye	16	242	202 (83.5)	125 (51.7)

(Tablo 2). C57BL/6J farelerde vitrifiye çözülmüş embriyoların in vivo- geliştirme.

Şekil 1Deney dengeleme, vitrifikasyon ve embriyo çözülme de dahil olmak üzere genel şeması.

Şekil 2 çözülme her aşamada embriyo morfolojisi.

Şekil 3 embriyo prosedür Eritme. Tüm işlemler, oda sıcaklığında yapılır. (A) cryotube TS1 (37 ° C) 850 ul ekleyin ve bir plastik tabak üzerine cryotube çözümün tüm hacim transferi. Şu anda, embriyoların Şekil gösterildiği gibi şişmiş bekliyoruz. 2B. (B), çanak yüzey üzerinde yavaşça sallayarak Spread çözüm. (C) üç 50 ul damla TS2, plastik tabak yerleştirin. (D), TS2 ilk damlasına kadar embriyolar transfer. Şekil olarak 3 dakika sonra, embriyolar shurunken bekliyoruz. 2C. (E), onları seri transferKalan TS2 içine ly sonra kültür ortamına düşer ve.

Tartışmalar

1985 ² Rall ve Fahy fare embriyo vitrifikasyon ilk rapordan bu yana, çözdürme sonrası embriyo beka artırmak için bazı teknik iyileştirmeler yapılmıştır. En başarılı değişiklikler düşük toksisite ve membran geçirgenliği yüksek, çünkü bir dölveriminin olarak etilen glikol kullanımı sağlandı. Gibi avantajlar sağlar; bize ⁴ oda sıcaklığı donma embriyolar ele diğer vitrifikasyon yöntemleri soğuk ısılarda teslim embriyo gerektirir ve her zaman BALB / c ⁶ farelerin bazı suşları için geçerli değildir. Ilk etilen glikol bazlı vitrifikasyon Kasai ve ark tarafından geliştirilmiştir. 1990 ^5,7. Orijinal bir yöntem olarak plastik kaplar payet için optimize edilmiş olduğundan, biz biraz laboratuvarlarda daha kolay erişilebilir ve fiziksel hasarlara karşı daha dayanıklı cryotubes için protokol değiştirdiniz. Bu nedenle, burada açıklanan Vitrifikasyon yöntemi uygulaması olması olabiliraraştırma modelleri gibi bir çok laboratuar fareleri kullanarak licable. Aynı yöntem morula ve blastosist aşamalarında ⁸ ve sıçan embriyolar ^9, fare embriyoları için de kullanılabilir . Ancak, son zamanlarda cryotubes kalitesi, donma-çözülme sonrası embriyoların sağkalım oranları etkileyebileceğini bulduk. Bu nedenle, iç yüzey sırlama embriyolar (bkz. Tablo özel reaktifler ve ekipman gibi) önce düzgünlük için cryotubes incelemek için esastır.

Vitrifikasyon yöntemleri geleneksel yavaş dondurma yöntemlerine göre birçok avantajı var, ancak doğal olarak ulaştırma amacı açısından bir dezavantaj var. Vitrifiye embriyolar aşağıda -120 tutulmalıdır ° C canlılığını korumak amacıyla, kuru nakliyatçılar genellikle güvenli taşınması için kullanılır. Kuru nakliyatçılar ağır ve hantal, ve bunların gidiş-dönüş, özellikle uluslararası taşımacılık, pahalı. Biz şimdi yeni bir vitrifikasyon yöntemi henüz gelişmekte olanvitrifiye embriyolar en az 7 gün ¹⁰ için (-80 ° C ile ilgili) kuru buz sıcaklığında saklanan olabilir. Bu yöntem, yeni nesil vitrifikasyon olmalıdır.

Malzemeler

Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Sığır serum albümin	Merck Biosciences (Calbiochem)	12657
Etilen glikol	Wako Saf Kimya Endüstrileri	058-00986
Ficoll 70	GE Healthcare	17-0310-10
Glikoz	Wako Saf Kimya Endüstrileri	041-00595
NaCl	Wako Saf Kimya Endüstrileri	191-01665
KCl	Wako Saf Kimya Endüstrileri	163-03545
KH 2 PO 4	Wako Saf Kimya Endüstrileri	169-04245
Na 2 HPO 4 · 12H 2 O	Wako Saf Kimya Endüstrileri	500-04195
MgCl 2 · 6H 2 O	Wako Saf Kimya Endüstrileri	135-00165
CaCl 2 · 2H2O	Wako Saf Kimya Endüstrileri	031-00435
Penisilin G	Sigma-Aldrich	P-4687
Sodyum piruvat	Sigma-Aldrich	P-8574
Sakaroz	Wako Saf Kimya Endüstrileri	196-00015
M16 orta	Sigma-Aldrich	M7292
M2 orta	Sigma-Aldrich	M7167
Cryotube	Sumitomo Bakalit	MS-4501	"Kriyojenik Flakon"