Криоконсервация эмбрионов мыши на этиленгликоля основе Витрификация

Резюме

Этиленгликоль метода, основанного на стеклования для эмбрионов мыши описано. Это выгодно с другими методами в своей простоте и низкой эмбриональной токсичности, и, следовательно, могут быть широко применимы ко многим линий мышей, в том числе инбредных и генно-модифицированных мышей.

Аннотация

Криоконсервация эмбрионов мыши является технологической основой, поддерживающей биомедицинских наук, потому что много линий мышей были произведены генетические изменения и число постоянно увеличивается из года в год. Его техническое развитие началось с медленного замораживания методы в 1970-х годов ^1, затем следуют стеклования методы, разработанные в конце 1980 года ^2. Как правило, последний метод является выгодным в его быстрота, простота и высокая живучесть восстановленных эмбрионов. Тем не менее, криопротекторов содержащихся обладают высокой токсичностью и может повлиять на дальнейшее развитие эмбриона. Таким образом, техника не относится к определенной линий мышей, даже если решения охлаждают до 4 ° С для смягчения токсического действия во время обработки эмбрионов. В центре RIKEN биоресурсов, более 5000 мышей штаммов с различным генетическим фоном и фенотипы сохраняются ^3, и, следовательно, мы оптимизировали стеклования тэchnique с которой мы можем cryopreserve эмбрионов из разных линий мышей, с преимуществами высокую выживаемость эмбрионов после витрификации и оттаивания (или сжижения, точнее) при температуре окружающей среды ^4.

Здесь мы представляем стеклования метод эмбрионов мыши, которая была успешно использована в нашем центре. Криоконсервация решение содержит этиленгликоль вместо ДМСО, чтобы минимизировать токсичности для эмбрионов ^5. Он также содержит Ficoll и сахарозы для предотвращения расстеклование и осмотического регулировки, соответственно. Эмбрионы могут быть обработаны при комнатной температуре и переданы в жидком азоте в течение 5 мин. Потому что оригинальный метод был оптимизирован для пластиковой соломинки, как контейнеры, мы несколько изменили протокол для cryotubes, которые являются более доступными в лабораториях и более устойчивы к физическим повреждениям. Мы также описать процедуру оттаивания эмбрионов керамической подробно, потому что это критический стер для эффективного восстановления живых мышей. Эти методики будут полезны для исследователей и техников, которые нуждаются в сохранении мыши штаммов для дальнейшего использования в безопасных и экономически эффективным образом.

протокол

Общая схема эксперимента приведена на рис. 1.

1. Подготовка реагентов

1. Сделать базу среде (здесь в известный как PB1) в 100 мл стеклянную бутылку в соответствии со следующей таблице ниже: Глюкоза

   	МВт	мМ	мг/100мл
   NaCl	58,4	136,98	800,0
   KCl	74,6	2,68	20,0
   KH 2 PO 4	136,1	1,47	20,0
   Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O	358,14	8,04	288,1
   MgCl 2, 6H 2 O	203,3	0,49	10,0
   180,2	5,56	100,0
   Na пирувата	110	0,33	3,6
   CaCl 2 2H 2 O	147	0,9	13,2
   Пенициллин G			6.0 (приблизительно)

2. Сделать Ficoll-сахарозы (FS) решение:
   1. Добавить следующие химические вещества до 14 мл PB1 решение в 50 мл трубки.

      Ficoll 70	6,0 г
      Сахароза	3,424 г
      BSA	42,0 мг

   2. Смешайте Ficoll 70 и сахарозы в PB1 решения и взболтать до полного растворения.
   3. После проверки полного растворения выше, добавить BSA на поверхности раствора и держать его на4 ° С до BSA полностью растворяется (> 4 часа или на ночь).
3. Сделать уравновешивания раствора (EFS20) и стеклования решение (EFS40) в 50 мл трубки:
   • EFS20: 20% (объем / объем) этиленгликоль, 24% (вес / объем) Ficoll и 0,4 моль / л сахарозы в PB1 с BSA
   • EFS40: 40% (объем / объем) этиленгликоль, 18% (вес / объем) Ficoll и 0,3 моль / л ^* сахарозы в PB1 с BSA
     ^* Для получения эмбрионов из штамма BALB / с или ICR, повышают концентрацию сахарозы до 0,9 моль / л сахарозы, потому что они более чувствительны к криоповреждения ^6.

   	EFS20 решение	EFS40 решение
   Этиленгликоль	1 мл	2 мл
   FS решение	4 мл	3 мл

4. Стерилизовать раствор фильтрации с использованием 0,45 мкм filteг. Сделать аликвоты в 5 мл пробирки полистирола и хранить при 4 ° C. Они могут быть использованы в течение 6 месяцев.
5. Подготовка эмбриона оттаивания раствора, содержащего 0,75 М сахарозы (TS1)
   1. Растворите 7,7 г сахарозы в PB1 (подготовлен в шаге 1.1) и довести общий объем до 30 мл. Смешать, осторожно встряхивая, пока сахарозы полностью не растворится.
   2. Добавить 90 мг BSA на поверхность раствором и оставьте стоять до полного растворения.
   3. Стерилизовать раствор путем фильтрации.
   4. Алиготе и хранить при температуре 4 ° C. Они могут быть использованы в течение 1 месяца.
   
   Примечание: TS1 также могут быть получены из имеющихся в продаже М2.
   
   6. Растворите 7,7 г сахарозы в М2 и довести общий объем до 30 мл.
   7. Смешать, осторожно встряхивая, пока сахарозы полностью не растворится.
   8. Стерилизовать раствор путем фильтрации.
   9. Алиготе и хранить при температуре 4 °. Они могут быть использованы в течение 1 месяца.
6. TS2 (оттаивания решениесодержащем 0,25 М сахароза):
   1. Развести 10 мл TS1 с 20 мл объема PB1 или M2, по мере необходимости.
   2. Алиготе и хранить при температуре 4 ° C. Они могут быть использованы в течение 1 месяца.

2. Остекловывание 2-клетки эмбрионов мыши

1. Подготовка 2-клетка эмбриона мыши, естественного спаривания или обычный в технике искусственного оплодотворения.
2. Алиготе 50 мкл EFS40 в криоскопической пробирки. Здесь и далее выполнять остальные стеклования процедуру при комнатной температуре.
3. Алиготе 50 мкл EFS20 в нижней части 35 мм или 60 мм пластиковые чашки Петри.
4. Трансфер до 30 эмбрионов EFS20 использованием стеклянный капилляр только с минимальным количеством питательной среды. Начало таймер на 2 мин.
   Примечание: Место эмбрионов в нижней части капли. Это делает эффективным обезвоживание эмбрионов. Проверьте морфология эмбрионов путем стереомикроскопа. Обезвоженная эмбрионов показать сморщенные морфологии, как показано на рис. 2А.Если они не будут достаточно обезвоженная, ждать больше 1 или 2 мин.
5. Примерно в 1,5 мин, забрать эмбрионов из EFS20 падение только с минимальным количеством раствора. Передача их в EFS40 криоскопической пробирки подготовлен в шаге 2.1. Примечание: Для достижения наилучших результатов, корректировать сроки подбирая эмбрионы так, что все эмбрионы могут быть перенесены в EFS40 около 2 мин.
6. Подождите 1 мин.
7. Положите криоскопической пробирки непосредственно в жидкий азот (LN _2).

3. Размораживание керамические 2-клетки эмбрионов мыши

1. Перед оттаиванием, готовить блюда по 10 мкл капли эмбриона питательной среды для восстановленных эмбрионов (см. шаг 3.13). Обложка блюдо с маслом и поставить в CO ₂ инкубаторе до использования. Примечание: Несмотря на любых носителях для рутинных культуры эмбриона могут быть использованы в этом опыте, мы рекомендуем средства массовой информации с более высокой осмолярности, такие как средний М16.
2. Теплый TS1 до 37 ° C.
3. Наденьте маску и cryogloves. Открытое Л. Н. ₂ тАНК и извлекать криоскопической пробирки содержащие эмбрионов.
4. Быстро открывает верхней части трубки и отбросить LN _2. Подождите 30 секунд, чтобы предотвратить TS1 от замерзания на следующий шаг.
5. Используйте 1000ul пипетки добавить 850 мкл TS1 (37 ° С) в трубку и перемешать раствор, осторожно pipettings (примерно в десять раз в 25 секунд), пока раствор равномерно растворились.
6. Передача весь объем трубки 60 мм пластиковые чашки Петри (или часовое стекло) (рис. 3А). Примечание: Эмбрионы должны обрабатываться при комнатной температуре (22-25 ° С), пока они не помещаются в CO ₂ инкубаторе на шаге 3.14.
7. Начало таймер на 3 мин.
8. Около 2 мин в TS1, встряхните блюдо, пока среда, содержащая эмбрионы распространяется на поверхности чашки (рис. 3В). Примечание: Это поможет эмбрионов спуститься на дно, потому что они плавают у поверхности при передаче на TS1.
9. Положите три 50 мкл капли TS2 на гоэлектронной блюдо (рис. 3в).
10. Через 3 минуты в TS1, проверьте морфология эмбрионов путем стереомикроскопа, они должны быть слегка сморщенным. Смотрите морфология эмбрионов в предыдущих (рис. 2В) и выше (рис. 2) в TS1. Примечание: Если эмбрионов до сих пор опухший, держать их в TS1 более 1 до 3 мин.
11. Возьмите эмбрионов и передавать их в первую каплю TS2 (рис. 3D). Начало таймер на 3 мин
12. Через 3 минуты, передачи эмбрионов второго падения, а затем в третьем раскрывающемся (рис. 3Е).
13. Трансфер эмбрионов к культуральной среде подготовлена ​​на шаге 3.1. Эмбрионы в форму, показанную на рис. 2D.
14. Место блюдо в CO ₂ инкубаторе. Около 10 минут спустя, передача эмбрионов на следующий капли культуральной среде, чтобы смыть сахарозы, которая была перенесена из TS2.
15. Продолжить культуры в CO2-инкубаторе до переноса эмбрионов.
    Примечание: Передача ЭмбриОС яйцеводы получателя самок на день оттаивания. Длинные культуры в пробирке может уменьшиться жизнеспособность эмбрионов в некоторых линий мышей.

4. Представитель Результаты:

В пробирке - и в естественных условиях развития эмбрионов после оттаивания представлены в таблицах 1 и 2. Преимущества этого протокола высокой живучести эмбрионов после оттаивания и его широкое применение в различных штаммов мышей.

Напряжение	Общее количество труб	Количество эмбрионов керамической	Восстановленные (№ (%))	Морфологически нормальные (№ (%))	Развитию бластоцист (№ (%))
C57BL/6J	20	400	397 (99)	394 (99)	342 (87)
BALB / сА	15	300	296 (99)	282 (95)	238 (84)
ICR	24	480	474 (99)	443 (93)	398 (90)

Таблица 1. Экстракорпоральное развития керамических-размороженные эмбрионы в общих линий мышей

Состояние эмбрионов	Количество получателей женщин	Количество эмбрионов	Имплантация сайтов (№ (%))	Живая потомства (№ (%))
Свежий	12	180	141 (78.3)	110 (61.1)
Керамические	16	242	202 (83.5)	125 (51.7)

Таблица 2. В естественных условиях развития керамических-размороженные эмбрионы мышей C57BL/6J.

Рисунок 1. Общая схема эксперимента в том числе равновесия, стеклование, и оттаивания эмбрионов.

Рисунок 2. Морфологии эмбрионов на каждом этапе размораживания.

Рисунок 3. Размораживание процедуры эмбрионы. Все процедуры проводятся при комнатной температуре. (А), добавить 850 мкл TS1 (37 ° С) в криоскопической пробирки и передача всего объема раствора в криоскопической пробирки на пластиковую тарелку. В это время эмбрионы выглядят опухшими, как показано на рис. 2B. (B), Spread решение по поверхности блюдо, осторожно встряхивая. (C), место три 50 мкл капли TS2 на пластиковые тарелки. (D), трансфер эмбрионов первой капли TS2. Через 3 минуты, эмбрионы выглядят shurunken, как показано на рис. 2C. (E), передачи их серийногоLy в оставшиеся TS2 капель, а затем в культуральной среде.

Обсуждение

С первым докладом мыши витрификации эмбриона Ралль и Fahy в 1985 году ^2, ряд технических улучшений было сделано увеличить выживаемость эмбрионов после размораживания. Один из самых успешных модификаций было достигнуто за счет использования ЭГ, как криопротектора из-за его низкой токсичностью и высокой мембранной проницаемости. Такие преимущества позволяют нам справиться замораживания эмбрионов при комнатной температуре ^4; другими методами витрификации эмбриона требует передачи при более низких температурах и не всегда применим к некоторым линий мышей в том числе BALB / с ^6. Первый этиленгликоля основе стеклования был разработан Касаи и соавт. в 1990 году ^5,7. Потому что оригинальный метод был оптимизирован для пластиковой соломинки, как контейнеры, мы несколько изменили протокол для cryotubes, которые являются более доступными в лабораториях и более устойчивы к физическим повреждениям. Таким образом, стеклование метод, описанный здесь, может быть приложениеlicable для многих лабораториях на мышах, как научные исследования моделей. Тот же метод может также использоваться для эмбрионов мыши на морулы и бластоцисты этапы ⁸ и ⁹ крысиных эмбрионов. Тем не менее, мы недавно обнаружили, что качество cryotubes может повлиять на выживаемость эмбрионов после замораживания-оттаивания. Таким образом, крайне важно для изучения внутренней поверхности cryotubes для ее гладкости перед витрификации эмбрионов (например, см. в таблице конкретных реагентов и оборудования).

Витрификация методы имеют много преимуществ по сравнению с обычными методами медленного замораживания, но они по своей сути имеют невыгодное положение в отношении транспортировки цели. Как керамической эмбрионы должны храниться при температуре ниже -120 ° С для поддержания их жизнеспособности, сухой грузоотправителей, как правило, используются для их безопасной транспортировки. Сухой грузоотправителей тяжелы и громоздки, и их туда-обратно стоит дорого, особенно для международных перевозок. Сейчас мы находимся в настоящее время разрабатывает новый метод остекловывания покоторые керамической эмбрионы могут храниться при сухого льда температура (около -80 ° С) в течение не менее 7 дней ^10. Этот метод должен быть остекловывания следующего поколения.

Материалы

Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (необязательно)
Бычий сывороточный альбумин	Merck Biosciences (Calbiochem)	12657
Этиленгликоль	Вако Pure Chemical Industries	058-00986
Ficoll 70	GE Healthcare	17-0310-10
Глюкоза	Вако Pure Chemical Industries	041-00595
NaCl	Вако Pure Chemical Industries	191-01665
KCl	Вако Pure Chemical Industries	163-03545
KH 2 PO 4	Вако Pure Chemical Industries	169-04245
Na 2 HPO 4 · 12H 2 O	Вако Pure Chemical Industries	500-04195
MgCl 2 · 6H 2 O	Вако Pure Chemical Industries	135-00165
CaCl 2 · 2H2O	Вако Pure Chemical Industries	031-00435
Пенициллин G	Sigma-Aldrich	P-4687
Натрия пируват	Sigma-Aldrich	P-8574
Сахароза	Вако Pure Chemical Industries	196-00015
M16 среда	Sigma-Aldrich	M7292
М2 среда	Sigma-Aldrich	M7167
Криоскопической пробирки	Sumitomo бакелита	MS-4501	"Криогенные флакон"