에틸렌 글리콜 기반 Vitrification에 의한 마우스 태아의 Cryopreservation

요약

마우스 배아의 에틸렌 글리콜 기반 vitrification 방법이 설명되어 있습니다. 그것은 단순하고 낮은 배아 독성의 다른 방법에 유리하고, 따라서 근친과 유전자 - 수정된 생쥐를 포함하여 마우스의 여러 변종에 광범위하게 적용하실 수 있습니다.

초록

마우스 배아의 Cryopreservation은 생쥐의 많은 변종이 유전자 개조에 의해 생산되어 있고 숫자가 지속적으로 매년 증가하기 때문에, 생명 의학 과학을 지원하는 기술 기반입니다. 그 기술 개발은 다음 후반 1980 년대 ² 개발 vitrification 방법 다음, 1970 년대 ¹ 느린 냉동 방법으로 시작했다. 일반적으로 후자의 기술은 민첩, 단순하고, 복구 배아 높은 survivability에 유리합니다. 그러나 포함된 cryoprotectants는 매우 독성이 있으며, 이후 배아 발달에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 기술은 솔루션 4 냉각 경우에도 생쥐의 특정 변종에 적용 아니었 ° C 배아 처리하는 동안 독성 효과를 완화합니다. RIKEN BioResource 센터에서 서로 다른 유전 배경과 phenotypes와 5000 개가 넘는 마우스 변종 ^3을 유지하고 있으며, 따라서 우리는 vitrification 테를 최적화chnique이있는 우리는 주위 온도가 ⁴ vitrifying 및 (또는 더 정확하게, 액화) 해동 후 높은 배아 생존의 이점과 함께, 마우스의 여러 변종의 배아를 cryopreserve 수 있습니다.

여기, 우리는 성공적으로 우리 센터에서 사용되고 있습니다 마우스 배아의 vitrification 방법을 제시한다. cryopreservation 솔루션은 배아 ⁵ 독성을 최소화하기 위해 대신 DMSO의 에틸렌 글리콜이 포함되어 있습니다. 또한 각각 Ficoll과 devitrification 및 삼투 조정 방지 자당이 포함되어 있습니다. 배아는 상온에서 처​​리하고 5 분 이내에 액체 질소로 전송할 수 있습니다. 원래 메소드가 컨테이너와 같은 플라스틱 빨대에 최적 이었기 때문에, 우리는 약간 실험실에서보다 쉽게​​ 접근하고 물리적 피해에 더 강한 cryotubes에 대한 프로토콜을 수정합니다. 그것이 중요한 ste이기 때문에 우리는 또한 자세한 vitrified 배아를 해동의 과정을 설명사는 생쥐의 효율적인 복구를 위해 P. 이 방법은 안전하고 비용 효율적인 방식으로 나중에 사용하기 위해 마우스 종자 보존이 필요 연구자 및 기술자에게 도움이 될 것입니다.

프로토콜

실험의 전체 구조는 그림에 표시됩니다. 1.

1. 시약 준비

1. 아래의 다음과 같은 차트에 따라 100 ML 유리 병의 기본 매체 (여기에 PB1라고도 함) 확인 :

   	MW	MM	mg/100ml
   NaCl	58.4	136.98	800.0
   KCl	74.6	2.68	20.0
   KH 2 PO 4	136.1	1.47	20.0
   나이 HPO 4 0.12 H 2 O	358.14	8.04	288.1
   MgCl 2 6H 2 O	203.3	0.49	10.0
   포도당	180.2	5.56	100.0
   나의 pyruvate	110	0.33	3.6
   CaCl 2, 2 시간 2 O	147	0.9	13.2
   페니실린 G			6.0 (약)

2. Ficoll - 자당 (FS) 솔루션을 확인하십시오 :
   1. 50 ML 관에서 PB1 용액 14 ML 다음 화학 물질을 추가합니다.

      Ficoll 70	6.0 g
      자당	3.424 g
      BSA	42.0 MG

   2. Ficoll 70 PB1 솔루션에 자당를 섞어 완전히 해산 때까지 잘 흔들.
   3. 위의 완전한 해체를 확인 후, 용액의 표면에 BSA를 추가하고 그것을에서 보관BSA까지 4oC 완전히 (> 4 시간 또는 야간) 해산입니다.
3. 50 ML 튜브의 평균 솔루션 (EFS20)과 vitrification 솔루션 (EFS40)를 확인합니다 :
   • EFS20 :​​ 20 % (V / V) 에틸렌 글리콜, 24 % (W / V) Ficoll, 그리고 BSA와 PB1에 0.4 몰 / L 자당
   • EFS40 : 40 % (V / V) 에틸렌 글리콜 18 % (W / V) Ficoll, 그리고 BSA와 PB1 0.3 몰 / L ^* 자당
     그들은 ⁶ cryodamage에 더 민감한 때문에 ^* BALB / C 또는 ICR 변형에서 배아의, 0.9 몰 / L 자당으로 자당의 농도를 증가시킵니다.

   	EFS20 솔루션	EFS40 솔루션
   에틸렌 글리콜	한 ML	이 ML
   FS 솔루션	4 ML	3 ML

4. 0.45 μm의의 filte를 사용하여 여과하여 솔루션을 소독R. 4에서 5 ML 폴리스티렌 튜브 및 저장소에 aliquots 만들기 ° C. 그들은 약 6 개월 동안 사용할 수 있습니다.
5. 0.75 M의 자당 (TS1)이있는 배아 해동 솔루션의 준비
   1. PB1에서 자당의 7.7 g을 (단계 1.1에서 준비) 용해 30 ML에 전체 볼륨을 가지고. 자당이 완전히 해소되기 전까지 부드럽게 흔들어하여 섞는다.
   2. 표면 솔루션에 BSA의 90 밀리그램을 추가하고 완전히 용해 때까지 서 두십시오.
   3. 여과하여 솔루션을 소독.
   4. 4 ° C.에 나누어지는 및 저장 그들은 약 1 달 동안 사용할 수 있습니다.
   
   참고 : TS1도 상용 M2에서 준비하실 수 있습니다.
   
   6. M2에서 자당의 7.7 g을 용해 30 ML에 전체 볼륨을 가지고.
   7. 자당이 완전히 해소되기 전까지 부드럽게 흔들어하여 섞는다.
   8. 여과하여 솔루션을 소독.
   9. 4oC에서 나누어지는하고 저장합니다. 그들은 약 1 달 동안 사용할 수 있습니다.
6. TS2 (해동 솔루션: 0.25 M의 자당)이있는
   1. 적절하게, PB1 또는 M2 20 ML 볼륨 10 ML TS1을 희석.
   2. 4 ° C.에 나누어지는 및 저장 그들은 약 1 달 동안 사용할 수 있습니다.

2. 2 셀 마우스 태아의 Vitrification

1. 자연 교배 또는 체외 수정의 기법에 의해 기존의 2 셀 마우스 배아를 준비합니다.
2. 나누어지는 cryotube에 50 μl EFS40. 향후, 실온에서 vitrification 절차의 나머지 부분을 수행합니다.
3. 35mm 또는 60mm 플라스틱 페트리 접시의 바닥에 EFS20의 나누어지는 50 μl.
4. 문화 매체에만 최소 금액과 모세관 유리를 사용하여 EFS20 30 배아까지 전송합니다. 2 분 타이머를 시작합니다.
   참고 : 드롭의 하단에있는 장소의 배아. 이것은 배아의 효율적인 탈수를합니다. stereomicroscope에 의한 배아의 형태를 확인합니다. 그림과 같이 탈수 배아는 수축된 형태를 보여줍니다. 2A.그들은 충분히 건조되지 않은 경우, 1 개 또는 2 분 기다립니다.
5. 1.5 분, 솔루션만을 최소한의 금액으로 EFS20 드롭에서 배아를 선택하십시오. 단계 2.1 준비 cryotube에 EFS40에게 전송합니다. 참고 : 최상의 결과를 얻으려면, 모든 배아가 약 2 분 EFS40로 전송할 수 있도록 배아를 수확의 타이밍을 조정합니다.
6. 1 분 기다립니다.
7. 액체 질소 (후면 _2)에 직접 cryotube 놔.

3. Vitrified 2 셀 마우스 배아를 해동

1. 해동하기 전에 복구 배아의 배아 배지 10 μl 방울 (3.13 단계 참조)와 요리를 준비합니다. 사용까지 CO ₂ 배양기에서 석유와 장소 접시를 커버. 참고 : 일상적인 배아의 문화에 대한 미디어가이 실험에 사용될 수 있지만, 우리는 이러한 M16 매체로서 높은 osmolarity와 미디어를 권해드립니다.
2. 37 ° C.에 TS1을 따뜻하게
3. 얼굴 마스크와 cryogloves 쓰세요. 에선 _2t을 엽니다ank와 배아를 포함하는 cryotube를 검색할 수 있습니다.
4. 신속하게 튜브의 상단을 열고 에선 ₂ 폐기. 다음 단계에서 동결에서 TS1을 방지하기 위해 30 초 기다립니다.
5. 튜브에 TS1의 850 μl (37 ° C)를 추가하고 솔루션을 고르게 해산 때까지 부드러운 pipettings (25 초 쯤 배)의 솔루션을 혼합하는 1000ul 피펫을 사용합니다.
6. 플라스틱 60mm 페트리 접시 (또는 시계 유리) (그림 3A)에 관의 전체 볼륨을 전송합니다. 참고 :이 단계에서 3.14 CO ₂ 배양기에 배치되기 전까지는 태아가 실내 온도 (22-25 ° C)에서 처리되어야합니다.
7. 3 분 타이머를 시작합니다.
8. 배아를 포함하는 매체가 접시의 표면 (그림 3B)에 걸쳐 때까지 TS1 2 분 주변에 부드럽게 요리를 흔들. 참고 :이 TS1에게 양도 때 그들이 표면 근처에 떠 있기 때문에 태아가 아래 아래로 내려가서 도움이 될 것입니다.
9. 일에 TS2 세 50 μl 방울을 넣고E 요리 (그림 3C).
10. TS1 3 분 후 stereomicroscope에 의해 태아의 형태를 확인, 그들은 약간 수축된해야합니다. TS1의 앞부분에서 태아의 형태 (그림 2B)를 참조하고 나중에 (그림 2C). 참고 : 배아가 계속 부어있다면, 3 분 1 이상을 TS1에 보관하십시오.
11. 배아를 들고 TS2의 첫 번째 드롭 (그림 3D)에게 전송할 수 있습니다. 3 분 타이머를 시작합니다
12. 3 분 후, 세 번째 드롭 (그림 3E)에 다음 두 번째 드롭에 배아를 전송합니다.
13. 3.1 단계에서 준비한 문화 매체에 배아를 전송합니다. 배아는 그림에 표시되는 모양입니다. 2D.
14. CO ₂ 배양기에 넣어 요리. 약 10 분 후, TS2에서 이월되어 자당을 씻어 문화 매체의 다음 드롭 배아를 전송할 수 있습니다.
15. 배아 전송까지 CO2 배양기에서 문화를 계속합니다.
    참고 : 전송 엠브리해동 당일받는 여성의 oviducts에 OS. 체외에서 오랜 문화는 생쥐의 일부 변종에 태아의 가능성이 저하될 수 있습니다.

4. 대표 결과 :

해동은 표 1과 2에 표시하고 배아의 생체내 개발 이후 - 체외에서. 이 프로토콜의 장점은 생쥐의 다양한 변종에 해동하고 광범위한 적용 후 태아의 높은 survivability 수 있습니다.

변형	튜브의 총 번호	vitrified 배아 개	복구된 (번호 (%))	Morphologically 정상 (번호 (%))	blastocysts로 개발 (제 (%))
C57BL/6J	20	400	397 (99)	394 (99)	342 (87)
BALB / CA	15	300	296 (99)	282 (95)	238 (84)
ICR	24	480	474 (99)	443 (93)	398 (90)

표 1. 일반적인 마우스 종자에 vitrified - 해동 배아의 체외 개발에

배아의 상태	받는 여성의 번호	배아의 번호 전송	주입 사이트 (번호 (%))	(번호 (%)) 새끼 라이브
신선한	12	180	141 (78.3)	110 (61.1)
Vitrified	16	242	202 (83.5)	125 (51.7)

표 2. C57BL/6J 마우스에 vitrified - 해동 배아의 생체내 개발에.

그림 1. 평균, vitrification 및 배아의 융해를 포함하여 실험의 전반적인 체계.

그림 2. 해동의 각 단계에서 배아의 형태.

그림 3. 배아의 절차를 해동. 모든 절차는 실온에서 수행됩니다. (A), cryotube에 TS1 (37 ° C)의 850 μl를 추가하고 플라스틱 접시에 cryotube에있는 솔루션의 전체 볼륨을 전송합니다. 이때 태아는 같은 그림에 표시된 부었습니다. 2B. (B), 부드러운 흔들림으로 접시의 표면에 걸쳐 솔루션을 펴. (C), 플라스틱 접시에 TS2 세 50 μl 방울을 넣으십시오. (D), TS2의 첫 번째 드롭에 배아를 전송합니다. 그림과 같이 3 분 후, 배아는 shurunken보세요. 2C. (E), 그들은 직렬 전송나머지 TS2로 니는 문화 매체 후 방울합니다.

토론

1985 ² Rall와 Fahy로 마우스 배아 vitrification의 첫 번째 보고서 이후, 몇 가지 기술 향상은 해동 후 태아의 survivability을 증가되었습니다. 가장 성공적인 수정 중 하나 때문에 낮은 독성과 높은 막 - 투자율의 cryoprotectant으로 에틸렌 글리콜의 사용에 의해 달성되었다. 이러한 장점은 우리가 상온 ⁴ 냉동 배아를 처리할 수 있도록, 다른 vitrification 방법은 냉각기 온도에서 나눠 배아을 필요로 항상 BALB / C를 포함하여 ⁶ 생쥐의 일부 변종에 적용되지 않습니다. 첫 번째 에틸렌 글리콜 기반 vitrification은 카사이 외에 의해 개발되었습니다. 1990 ^5,7 인치 원래 메소드가 컨테이너와 같은 플라스틱 빨대에 최적 이었기 때문에, 우리는 약간 실험실에서보다 쉽게​​ 접근하고 물리적 피해에 더 강한 cryotubes에 대한 프로토콜을 수정합니다. 따라서, 여기에서 설명한 vitrification 방법은 응용 프로그램 수연구 모델로 마우스를 사용하여 많은 실험실로 licable. 같은 방법도 morula와 blastocyst 단계 ⁸ 쥐 배아 ^9시 마우스 배아 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리는 최근 cryotubes의 품질 냉동 - 해동 후 태아의 생존 속도에 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다. 그러므로, 그것은 vitrifying 배아 (; 특정 시약 및 장비의 테이블에서 참조 예) 전에 매끄러운위한 cryotubes의 내부 표면을 조사하는 것이 필수적입니다.

Vitrification 방법은 기존의 느린 냉동 방법을 통해 많은 장점을 가지고 있지만, 그들은 본질적으로 운송 목적에 대하여에 불이익을했습니다. vitrified 배아 아래 -120에서 보관해야합니다로서 ° C가 자신의 생존을 유지하기 위해, 건조 화주는 일반적으로 자신의 안전 수송을 위해 사용됩니다. 드라이 화주는 무겁고 부피가 있으며, 그들의 왕복 특히 국제 운송을위한, 비싼 수 있습니다. 우리는 지금 현재에 의해 새로운 vitrification 방법을 개발하고 있습니다어떤 vitrified 배아는 최소 7 일 ¹⁰ (-80 ° C 정도) 드라이 아이스 온도에서 저장할 수 있습니다. 이 방법은 다음 세대의 vitrification해야합니다.

자료

시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
소 혈청 알부민	머크 Biosciences (Calbiochem)	12,657
에틸렌 글리콜	와코 순수 화학 산업	058-00986
Ficoll 70	GE 헬스케어	17-0310-10
포도당	와코 순수 화학 산업	041-00595
NaCl	와코 순수 화학 산업	191-01665
KCl	와코 순수 화학 산업	163-03545
KH 2 PO 4	와코 순수 화학 산업	169-04245
나이 HPO 4 명이 12H 2 O	와코 순수 화학 산업	500-04195
MgCl 2 · 6H 2 O	와코 순수 화학 산업	135-00165
CaCl 2 · 2H2O	와코 순수 화학 산업	031-00435
페니실린 G	시그마 - 올드 리치	P - 4687
나트륨 pyruvate	시그마 - 올드 리치	P - 8574
자당	와코 순수 화학 산업	196-00015
M16 중간	시그마 - 올드 리치	M7292
M2 매체	시그마 - 올드 리치	M7167
Cryotube	스미토모 Bakelite	MS - 4501	"극저온 약병"