İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

Özet

Biz tek bir insan kan bağışında düzenleyici, bellek ve naif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Polarize Tregs sonra da burada ayrıntılı bir bastırma testi dahil olmak üzere genetik homojenlik ile genetik ve fonksiyonel uygulamalar çeşitli diğer komutlara göre olabilir.

Özet

Immünsupresif CD4 ⁺ düzenleyici T hücreleri (Tregs) geliştirilmesi ve bakım ve insan bedeni üzerinde kendini ve ortakçı antijenlerin büyük miktarda immünolojik homeostazisde kalmak için ihtiyaç duyulan periferik tolerans katkıda bulunur. Tregs ve inflamatuvar konvansiyonel T hücrelerinin arasındaki dengeye Pertürbasyonu İmmünopatolojiye veya kansere neden olabilir. Tregs terapötik enjeksiyon kolit, ^1, tip I diyabet ^2, romatoid artrit ve graft versus host hastalığı, insan karşı fare Treg biyolojisi ⁵ in ⁴ birkaç temel farklılıklar murin modellerinde etkili olduğu gösterilmiştir olmakla birlikte şimdiye kadar klinik kullanımı engellemiştir sahiptir. Yeterli sayıda, saflık, stabilite ve terapötik Tregs yuvalandırma özgüllük eksikliği kendi ex vivo genişlemesi ⁶ koşulları optimize etmek için hangi insan Treg gelişimi dinamik bir platformu gerektirmiştir.

Burada beğendimdört aşamadan ayrılabilir tek bir insan periferik kan donörden bağlı Tregs (iTregs) farklılaşması için bir yöntem escribe: periferik kan mononükleer hücreleri, CD4 manyetik seçimi ⁺ T hücre izolasyonu, in vitro hücre kültürü ve floresan aktive T hücre alt gruplarının hücre sıralama (FACS). Treg imza transkripsiyon faktörü forkhead kutusu P3 (FoxP3) insanlarda ⁷ aktivasyon bağlı transkripsiyon faktörü ve hiçbir diğer benzersiz belirteç var, damgalı bir kombinatoryal paneli baskılayıcı aktivite ile T hücrelerini tanımlamak için kullanılması gerekir beri. Kültüründe altı gün sonra, sistemindeki hücrelerin saf T hücreleri, CD25 ve CD45RA bunların bağıl ifade göre bellek T hücreleri veya iTregs içine olarak belirli edilebilir. Bellek ve naif T hücrelerinin farklı rapor kutuplaşma gereksinimleri ve plasticities ⁸ sahip olduğu gibi, CD45RA ⁺ ve CD45RO içine ilk T hücre popülasyonunun öncesi sıralama ⁺ alt kümeleri olabilir be bu farklılıklar incelemek için kullanılır. Diğerleri ile uyumlu olarak, bizim CD25 ^Hi CD45RA ^- FoxP3 ⁹ iTregs ekspres yüksek düzeyde, GITR ve CTLA-4 ¹¹ ve CD127 ¹² düşük seviyelerde. Her nüfusun FACS ardından, elde edilen hücreler carboxyfluorescein süksinimidil ester (KAKE)-etiketli T hücrelerinin proliferasyonu otolog geciktirmek üzere göreli yeteneği hesaplayan bir bastırma deneyde kullanılabilir.

Protokol

1. Buffy Coat gelen İnsan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) İzolasyonu

1. Hastane veya yakındaki kan merkezi yerden buffy coat bir birim edinin. Bizim kan merkezi normal kan vericilerden elde birim buffy coat, 40-60 mL bize sağlar.
2. Buffy coat sulandırmak için steril PBS içeren bir otoklav 500 ml cam şişe içine kan dökün. PBS + buffy kaplamanın son hacim 250 mL olmalıdır.
3. 20 mL Lymphoprep çözeltisi ile, her on 50 ml konik tüpler doldurun.
4. Yavaşça Lymphoprep çözüm rahatsız dikkat ederek, seyreltilmiş buffy coat 25 mL Lymphoprep çözüm bindiriyoruz.
5. 500 x g hızında, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca boru dönerler.

Tartışmalar

Treg transferi, bunların verimli üretimi ve istikrarlı bakım yöntemleri otoimmünite rejeksiyon ve diğer immün veya inflamatuvar aracılı hastalıklar ile mücadelede çok büyük tedavi umut vaat ederken henüz geliştirilmiş değil. Insan T hücreleri dolaşımdaki sadece% 1-5 Tregs oldukları için kontrollü genişleme ve farklılaşma kliniğe Tregs uygulanması önemli bir caydırıcı olarak bu yetersizlik üstesinden gelir. Bu deneme TGN1412 ¹³ öğrenilebilir gibi, diğer yandan, bu derece m...

Malzemeler

Reaktif Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
Lymphoprep	Eksen-Shield	1114547	Oda sıcaklığında tutmak
Soğutmalı Tezgah Üstü Santrifüj	Eppendorf	5810R
Parlak-Line hemositometre	Hausser Bilimsel	3110
EasySep İnsan CD4 + T hücre Zenginleştirme Seti	Kök Hücre Teknolojileri	19052
EasySep İnsan Belleği CD4 + T hücre Zenginleştirme Seti	Kök Hücre Teknolojileri	19157
EasySep İnsan naif CD4 + T hücre Zenginleştirme Seti	Kök Hücre Teknolojileri	19155
Big Easy EasySep Magnet	Kök Hücre Teknolojileri	18001	Gümüş
5 ml'lik tabanı yuvarlak bir polistiren Tüpler	BD Falcon	352008
15 ml polipropilen santrifüj tüpünde	VWR	89004-368
14 mL Polipropilen Yuvarlak Alt Tüpler	BD Falcon	352059
50 ml polipropilen santrifüj tüpünde	VWR	89004-364
İnsan anti-CD3 antikoru	Bio X Hücre	BE0001-2	Klonlama: OKT3
24 Well Polistiren Kültür Plakalı	BD Falcon	353047
96 Şey Yuvarlak Alt Doku Kültürü Plakalı	Grenier Bio-One	650180
Glutamax-I ve HEPES tamponu ile RPMI 1640	Gibco	72400
Fetal bovin serumu (FBS)	Gibco	16000
β-merkaptoetanol	Sigma	M7522
TGF-β1 Rekombinant İnsan	eBioscience	14-8348-62
Rekombinant İnsan IL-2	eBioscience	14-8029-63
Bovine Serum Albumin (BSA)	MP Biomedicals Inc	810531
0.5 M EDTA	Amresco	E177
Fare anti-insan CD25-PE	Miltenyi Biotec	130-091-024	Klonlama: 4E3
Fare anti-insan CD45RA-PE-Cy5	eBioscience	15-0458-42	Klonlama: HI100
Fare anti-insan CD127-APC	Miltenyi Biotec	130-094-890	Klonlama: MB15-18C9
DNaz II	MP Biomedicals Inc	190370
MoFlo Akış Sitometresi	Beckman Coulter
FlowJo Yazılım	Ağaç Yıldız, Inc
Hücre Görev Pro Yazılımı	BD Biosciences
Yenidoğan Buzağı Serumu	Gibco	16010
L-glutamin	Gibco	25030
AIM-V	Gibco	0870112
CellTrace KAKE Hücre Çoğalması Kiti	Invitrogen	C34554
Bastırma Müfettiş Boncuk Treg	Miltenyi Biotec	130-092-909
Penisilin-Streptomisin	Gibco	15140
40 uM Naylon Hücre Gerginliker	BD Falcon	352340