Sıcak Sulu-fenol Ekstraksiyon tarafından Gram-negatif bakteriler arınma ve Lipopolisakkaritlerinin Görselleştirmesi

Özet

Biz Gram-negatif bakterilerden lipopolisakkarid (LPS) arıtılması için modifiye edilmiş bir sıcak sulu-fenol ekstraksiyon yöntemi açıklar. Bir kez çıkarılan, LPS sonradan SDS-PAGE ile analiz ve direkt boyama ya da Batı immunoblotting tarafından görüntülenebilir.

Özet

Lipopolisakkarid (LPS) Gram-negatif bakterilerin dış zarının önemli bir bileşenidir. Bu lipid oluşan üçlü bir moleküldür dış membran içine gömülü olan A, hücre ^{1, 2} yüzeyinden dışa doğru uzanan temel bir oligosakarit ve tekrar eden O-antijen birimi. LPS Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, ve Escherichia coli ^3-5, ve LPS O-antijen kompozisyonu formunda suşunun serotipleme için temel farklılıkları dahil, birçok bakteri türleri, ölümcüllüğünü ve patogenezine için önemli olan bir bağışıklık ağırlıklı bir moleküldür. LPS enfeksiyon başlangıcında hücreler ev sahipliği ekinde yer alan ve kompleman aracılı öldürülmesine karşı koruma sağlayan; LPS yoksun suşları virulans ^6-8 için zayıflatılmış olabilir. Bu sebeplerden dolayı, özellikle klinik olarak izole edilen, LPS canlandırmak için önemlidir. Belirli bir tarafından desenleri ve tanıma bantlama görselleştirme LPSntibodies gerginlik soy tespit etmek ve çeşitli mutantlar karakterize etmek için faydalı bir araç olabilir.

Bu yazıda, Gram-negatif bakteri hücrelerinin LPS izolasyonu ve saflaştırılması için sıcak sulu-fenol yöntemi açıklar. Bu protokol uzaklıkta ⁹ daha kısa, daha az yoğun ekstraksiyon yöntemleri ile oluşur LPS görselleştirme engelleyebilir nükleik asitlerin ve proteinlerin gelen LPS çıkarılması için izin verir. LPS bu şekilde karbonhidrat / glikoprotein lekeler veya standart gümüş boyama yöntemleri kullanılarak sodyum dodesil sülfat (SDS)-poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) ve doğrudan lekeli ayrılabilir hazırlanmıştır. LPS anti-sera Birçok sürebiliyor dış membran proteinleri veya diğer antijenik hedefleri ile çapraz reaksiyona reaktivite SDS-PAGE ile ayrılmış ham hücre lizatları Batı immunoblotting sonrası gözlenen bu antikorları içerir. Tek başına ham hücre lizatlarının Proteaz tedavi her zaman bu silmenin en etkili yolu değilBu veya diğer görüntüleme yöntemleri kullanılarak arka plan. Dahası, bu arka kaldırmak için bir girişim geniş proteaz tedavisinde de yukarıda belirtilen yöntemlerden herhangi çözülemezse düşük kaliteli LPS yol açabilir. Bu nedenlerle, biz Westpahl ve Jann ¹⁰ uyarlanan aşağıdaki protokol, LPS ekstraksiyon için ideal olduğuna inanıyorum.

Protokol

1. LPS Ekstraksiyon için Bakteri hazırlanması

1. Gerekirse antibiyotikler ile desteklenmiş Luria Broth (LB), 5 mL, bir gece kültüre başlar. Bir 37 kuvöz sallayarak ° C ve 200 rpm (12-18 saat) gece kültürü büyütün.
2. LB ile kültür 01:10 seyreltilir ve bir spektrofotometre bir OD ₆₀₀ okuma alır. OD ₆₀₀ okuma dayanarak, 0.5 OD ₆₀₀ için bir bakteri 1.5 ml süspansiyon olun.
3. Pelet 10 dakika boyunca 10.600 x g hızında bir mikrosantrifüj bakteri. Süpernatantı alın ve atın. LPS hemen ayıklanır olacak değilse pelet, -20 ° C'de saklanabilir.

2. LPS çıkarımı

1. Birincisi, 2x SDS tamponu hazırlamak. 0,1 bir 50 mL% 4 β-mercaptoethanol (BME), 4% SDS solüsyonu ve% 20 gliserol hale M Tris-HCl, pH 6.8. Çözüm boyamak için Bromophenol Mavi bir tutam ekleyin. 2X s seyreltilmesi ile 1x SDS-tampon stok olunsteril distile H ₂ O da tak 01:01 Bu oda sıcaklığında saklanabilir.
2. Steril damıtılmış H ₂ O. in DNase I, RNaz ve Proteinaz K üç ayrı 10 mg / mL çözümler hale
3. 1x SDS-tampon 200 ul adım 1.3 pelet bakteri süspanse edin. Pelet tamamen yavaş yavaş aşağı çözümü pipetleme tarafından süspanse emin olun. Vorteks yapmayın.
4. 15 dakika su banyosunda asılı bakteri kaynatın. 15 dakika için oda sıcaklığında soğumasına izin çözeltisi.
5. 2,2 hazırlanan DNase I ve RNaz çözümler hem 5 ul ekleyin. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe örnekleri. * Bu adım isteğe bağlıdır; nükleaz arıtılmış ve arıtılmamış örnekleri arasında LPS kalitesinde az fark vardır.
6. 2,2 hazırlanan Proteinaz K solüsyonu 10 ul ekleyin. 3 saat boyunca 59 ° C'de inkübe örnekleri. Zaman kısıtlamaları vardır, bu adım, bir gece boyunca gerçekleştirilebilir.
7. Her örnek, reklam içind 200 ul buz Tris-doymuş fenol (Tris-doymuş fenol yoksa suya doymuş fenol bir alternatif olarak kullanılabilir). Tüpler sıkıca kapalı üzerinde kapakları ve yaklaşık 5 ila 10 saniye vorteks her bir örnek olun.
8. Ara sıra vorteks, 15 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe örnekleri. Oda sıcaklığına kadar soğutulur kuluçkaya sonra, daha sonra 1 Her numune için oda sıcaklığında ml dietil eter ve 5-10 saniye vorteks ekleyebilir. Volatil olduğu gibi, bir çeker ocak içinde kolu eter gerçekleştirmek için emin olun.
9. 10 dakika için 20,600 x g'de santrifüje örnekleri. Dikkatlice santrifüj gelen örnekleri kaldırmak ve alt mavi katmanı ayıklayın. Üst, açık tabaka önlemek emin olun. Mavi tabakası küçük bir miktar geride kalacak üst tabaka ile kirlenme tercih edilir.
10. 2.9 - 2.7 adımları tekrarlayarak örnekleri yeniden ayıklayın. İki ekstraksiyonu genellikle yeterlidir. Örnekleri bulanık görünür, daha fazla çekimi performe olabilird. SDS-PAGE ile ayırarak önce ekstre örneklerin her birine 2x SDS-tamponun 200 ul ekleyin. Örnekler 8% -15% SDS-poliakrilamid jel üzerinde çalıştırılabilir. Bu yöntemi kullanarak hazırlanan LPS beş ile on beş ul görünüm için genellikle yeterlidir.

3. Temsilcisi Sonuçlar

Yukarıdaki gibi hazırlanan LPS örnekleri standart bir gümüş boyaması protokol veya piyasada bulunan LPS boyama kiti kullanılarak SDS-PAGE üzerinde ayrılığı takiben direkt boyama ile görülebilmesi. Alternatif olarak, bir poliakrilamid jel üzerinde ayrılır LPS bir nitroselüloz zarına aktarılır ve LPS spesifik anti-serumu kullanılarak immunoblotting Western tabi tutulabilir. Bu protokol için, Pro-Q zümrüt 300 Lipopolisakkaritlerinin Jel Stain Kit (Molecular Probes) kullanılır ve üreticinin talimatlarına izledi.

Bir Pro-Q Emerald 300 lekeli% 12 SDS-poliakrilamid jel Şekil 1'de gösterilmiştir. Her kulvar dif hazırlanan LPS 15 ul içerenBurkholderia dolosa özelliklerine ait farklı suşları kistik fibrozis hastaların balgam örneklerinden izole. Merdiven kalıplarını bantlama Farklı LPS, farklı sayıda oligosakkarit çekirdek bağlı birimleri tekrarlayarak O-antijeni yansıtıcı, bu yöntemi kullanarak belirgindir, örneğin şerit 1 ve 6 örnekleri birbirine benzer bant desenleri var (kırmızı kutulu).

Burkholderia dolosa klinik izole edilen Şekil 1. Pro-S Zümrüt 300 lekeli LPS. Yedi B. LPS Bu protokol açıklandığı gibi kistik fibroz hastalarında salgını gelen dolosa suşu izole edildi. Onbeş ul üreticinin talimatlarına göre, Pro-Q zümrüt 300 ile% 12 SDS-poliakrilamid jel ve vitray üzerine ayrıldı. LPS çekirdekli bir ok gösterilir, ve O-antijen tekrarlarının benzer bant desenleri gösteren LPS kırmızı kutu içinde edilir. M = Moleküler ağırlık işaretleyici.

Tartışmalar

Biz, nükleik asitlerin ve proteinler de dahil olmak üzere diğer hücre bileşenleri, LPS ile saflaştırma uzak bir yöntemi de tarif etmiştik. Bu yöntem, Şekil 1'de gösterildiği gibi, SDS-PAGE jeli karbonhidrat boyama dahil olmak üzere çeşitli görsel yöntem, bir dizi kullanılabilir yüksek kalitede LPS sağlar. Bu yöntem, belirli bir anti-serumu kullanılarak, suşları çeşitli LPS serotip için, ya doğrudan görselleştirme tarafından izole arasındaki akrabalıkları göstermek üzere kullanıl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
DNase I rekombinant, RNaz-free	Roche	04716728001
RNaz A	Roche	10109169001
Proteinaz K	Balıkçı	BP1700
Fenol Tris-Doymuş	Balıkçı	BP1750-100
Dietil eter	Thomas Bilimsel	C313K31
Pro-Q zümrüt 300 Lipopolisakkaritlerinin Jel Stain Kit	Molecular Probes	P20495