핫 수성 - 페놀 추출에 의한 그람 음성 박테리아에서 정화와 Lipopolysaccharide의 시각화

요약

우리는 그람 음성 세균의 lipopolysaccharide을 (LPS) 정화를위한 수정된 뜨거운 수성 - 페놀 추출 방법을 설명합니다. 일단 압축을 푼, LPS는 연속적으로 SDS-PAGE에 의해 분석 및 직접 염색법이나 서양 immunoblot에 의해 시각하실 수 있습니다.

초록

Lipopolysaccharide가 (LPS) 그람 음성 세균의 외부 세포막의 주요 구성 요소입니다. 그것은 지방질로 구성된 삼자 간의 분자는 외부 세포막에 박혀있는, 셀 ^{1, 2의} 표면에서 바깥쪽을 확장하는 핵심 올리 고당 및 반복 O-항원 단위. LPS는 녹농균, 살모넬라균 종, 그리고 대장균 ^3-5 및 LPS O-항원 구성 양식 종자의 serotyping의 기초의 차이 등 많은 세균 종의 독성 및 pathogenesis에 중요 immunodominant 분자이다. LPS는 감염의 개시에 세포를 호스트 첨부에 참여하고 보완 - 중재 죽이는에서 보호를 제공합니다; LPS 부족 변종은 독성 ^6-8에 대한 감쇠가 될 수 있습니다. 이러한 이유로, 그것은 특히 임상 분리에서 LPS를 시각화하는 것이 중요합니다. 특정 의해 패턴과 인식을 banding 떠올리 LPSntibodies는 스트레인 lineages를 식별할 수 있도록, 다양한 돌연변이를 특성화하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다.

이 보고서에서 우리는 그람 음성 박테리아 세포에서 LPS의 분리 및 정제를위한 고온 수성 - 페놀 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 멀리 ^구 짧고 덜 집약적인 추출 방법으로 발생 LPS의 시각화를 방해할 수있는 핵산과 단백질에서 LPS의 추출을 허용합니다. LPS이 방법은 탄수화물 / 당단백질 얼룩 또는 표준 실버 염색법 방법을 사용하여 나트륨 dodecyl 황산 (SDS)-polyacrylamide 겔 전기 영동 (PAGE)와 직접 스테인드으로 구분됩니다 준비. LPS로 방지 세라 많은 저해 수있는 외부 막 단백질이나 다른 antigenic 목표와 교차 반응 반응은 SDS-PAGE로 구분 원유 세포 lysates의 서양 immunoblot에 따라 관찰되는 항체가 포함되어 있습니다. 혼자 원유 세포 lysates의 단백 분해 효소 처리는 항상 이것을 제거하는 효과적인 방법 없습니다이 문서나 다른 시각화 방법을 사용하여 배경. 또한, 이러한 배경을 제거하기 위해 광범위한 단백 분해 효소 처리가 잘 앞서 언급한 방법 중 하나가 해결되지 품질의 LPS로 이어질 수 있습니다. 이러한 이유로, 우리는 Westpahl 및 Jann ^{10 일부터} 맞게 다음과 같은 프로토콜, LPS 추출에 이상적이라고 생각합니다.

프로토콜

1. LPS 추출을위한 박테리아의 작성

1. 항생제 필요한 경우에 보충 Luria 국물 (LB), 5 ML에서 하룻밤 문화를 시작합니다. 37시 배양기를 흔들어 ° C ~ 200 RPM의 (12-18시간) 야간 문화를 성장.
2. LB와 문화 1시 10분을 희석하고 분광 광도계에서 OD ₆₀₀ 독서 가져가라. OD ₆₀₀ 독서를 바탕으로 0.5의 OD _{600으로하여} 박테리아의 1.5 ML 서스펜션을합니다.
3. 펠렛은 10 분 10,600 X g에서 microcentrifuge의 박테리아. 표면에 뜨는를 제거하고 폐기. LPS를 즉시 추출되지 않을 경우 펠렛은 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.

2. LPS의 추출

1. 첫째, 2X SDS 버퍼를 준비합니다. 0.1에서 50 ML의 4% β-메르 캅 토 에탄올 (BME) 4 % SDS의 솔루션 및 20 % 글리세롤 만들기 M 트리스-HCL, 산도 6.8. 솔루션을 염색하는 bromophenol 파란색의 핀치를 추가합니다. 2X을 diluting하여 1X SDS-버퍼 주식을 만들기멸균 증류수 H ₂ O에 관련 째깍 1시 1분 이것은 상온에서 저장할 수 있습니다.
2. 멸균 증류수 H ₂ O에에 DNase 나 RNase와 Proteinase K의 세 별도의 10 밀리그램 / ML 솔루션 만들기
3. 1X SDS-버퍼 200 μl의 단계 1.3에서 pelleted 박테리아를 Resuspend. 펠렛 완전히 천천히 아래로 솔루션을 pipetting 및하여 resuspended되었는지 확인하십시오. 와동하지 마십시오.
4. 15 분 동안 물을 욕조에 정지 박테리아를 끓이다. 15 분 동안 상온에서 냉각 솔루션을 허용합니다.
5. 2.2에서 준비 DNase I 및 RNase 솔루션 모두 5 μl를 추가합니다. 30 분간 37 ° C에서 샘플을 품어. *이 단계는 선택 사항입니다, nuclease-대우와 비 대우 샘플 사이 LPS의 품질에 최소한의 차이가있다.
6. 2.2에서 준비 Proteinase K의 솔루션을 10 μl를 추가합니다. 3 시간 동안 59 ° C에서 샘플을 품어. 시간 제약이있는 경우이 단계는 하룻밤 사이에 수행할 수 있습니다.
7. 각 샘플, 광고까지의 D 200 μl는 얼음처럼 차가운 트리스 - 포화 페놀 (트리스 - 포화 페놀를 사용할 수없는 경우에는 수상 포화 페놀은 대신 사용될 수 있습니다.) 튜브가 꽉 닫혀있에 모자, 약 5~10초위한 와동 각 샘플을 확인합니다.
8. 가끔 vortexing, 15 분 동안 65 ° C에서 샘플을 품어. 실온에 시원한 잠복기 후, 다음 1 각 샘플로 룸 온도 디에틸 에테르 ML 5로 10 초간 소용돌이를 추가합니다. 그것이 휘발성이기 때문에, 연기 후드에 핸들 에테르를 수행하십시오.
9. 10 분 동안 20,600 X g에서 샘플을 원심 분리기. 조심스럽게 원심 분리기에서 샘플을 제거하고 아래쪽에 파란색 레이어를 추출합니다. 상위, 투명 레이어를 사용하지 않아야합니다. 파란 레이어의 소량 뒤에두면 상위 레이어와 오염 것이 바람직합니다.
10. 2.9 - 단계 2.7을 반복하여 샘플을 다시 압축을 풉니다. 두 extractions은 일반적으로 충분합니다. 샘플 흐린 나타나는 경우 자세한 extractions는 performe 수 있습니다라. SDS-PAGE로 분리되기 전에 추출된 표본 각 2X SDS-버퍼 200 μl를 추가합니다. 샘플은 8% -15 %는 SDS-polyacrylamide의 젤에서 실행할 수 있습니다. 이 방법을 사용 준비가 LPS의 다섯 데 15 μl는 시각화를 위해 일반적으로 충분합니다.

3. 대표 결과

위와 같이 준비 LPS 샘플 표준 실버 염색법 프로토콜이나 상용 LPS의 염색법 키트를 사용하여 SDS-PAGE에서 분리에 따라 직접 염색법에 의한 시각이 될 수 있습니다. 또는 polyacrylamide 젤에 분리된 LPS는 nitrocellulose 막에게 양도 및 LPS 특정 안티 세라를 사용하여 immunoblotting 서양를 받게됩니다. 이 프로토콜의 경우, 우리는 프로-Q 에메랄드 300 Lipopolysaccharide 젤 얼룩 키트 (분자 프로브)를 사용하고, 제조 업체의 지침을 따라갔다.

프로-Q 에메랄드 300 스테인드 12% SDS-polyacrylamide 겔은 그림 1에 표시됩니다. 각 레인은 DIF에서 준비 LPS의 15 μl를 포함Burkholderia dolosa의 ferent 변종은 낭성 섬유증 환자의 가래 샘플로부터 격리. 사다리 패턴을 banding 다른 LPS, 다른 숫자 올리 고당 코어에 연결된 장치를 반복 O-항원의 반사,이 방법을 사용하여 증거들이, 예를 들어, 레인 1과 6의 샘플이 서로 유사한 banding 패턴을 가지고 (빨간색 박스).

Burkholderia dolosa 임상 분리의 그림 1. 프로-Q 에메랄드 300 스테인드 LPS. 일곱 B.로부터 LPS 이 프로토콜의 설명에 따라 낭성 섬유증 환자의 확산에서 dolosa의 종자는 고립되었다. 열 다섯 μl는 제조 업체의 지침에 따라, 프로-Q 에메랄드 300과 12% SDS-polyacrylamide 젤, 그리고 스테인드에서 분리되었다. LPS 코어는 화살표를 표시하고, O-항원 반복 유사한 banding 패턴을 보여주는 LPS는 빨간색으로 박스가 있습니다. M은 = 분자량 마커.

토론

우리는 핵산과 단백질 등 다른 세포 구성 요소에서 LPS를 멀리 정화하는 방법을 설명했습니다. 이 방법은 그림 1에 표시된 SDS-PAGE의 젤의 탄수화물의 염색법을 포함한 다양한 시각화 방법, 다수에서 사용할 수있는 고품질의 LPS를 제공합니다. 이 방법은 특정 안티 세라를 사용하여 종자의 다양한 LPS를 혈청형하거나 직접 시각화하여 분리 사이 relatedness을 표시하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어,...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
DNase 나 재조합, RNase가없는	로슈	04716728001
RNase	로슈	10109169001
Proteinase K	어부	BP1700
페놀 트리스 - 포화	어부	BP1750-100
디에틸 에테르	토마스 과학	C313K31
프로-Q 에메랄드 300 Lipopolysaccharide 젤 얼룩 키트	분자 프로브	P20495