Yoğunluk Gradient Katmanlı Polimerizasyonu (DGMP): Multi-bölmesi oluşturma için A Novel Tekniği, Doku Mühendisliği için Özelleştirilebilir İskelesi

Özet

Burada doku mühendisliği için farklı katmanları arasında sürekli arabirimleri ile biyouyumlu, katmanlı matrisler oluşturmak için benzersiz bir strateji belirlemelidir. Böyle bir iskele çeşitli biyolojik, kimyasal ya da mekanik yardımlar yaparak hücre davranışı modüle ideal özelleştirilebilir ortamı sağlayabilir

Özet

Türleri ve biyolojik uyarıcı (örneğin büyüme faktörleri, inhibitörler, veya küçük molekül) veya matris yapısı konsantrasyonları (örneğin, matris bileşimi, konsantrasyonu ya da sertliği), uzay içinde değişebilir olan kompleks doku kültürü matrisler araştırmalar geniş bir yelpazede izin verecek Bu değişkenler hücre farklılaşmasını, göç ve diğer fenomenler nasıl etkilediğini ilgili. Katmanlı matrisler yaratmada önemli bir sorun her katman ¹ tek tek bileşenlerin difüzyon olmadan katman arayüzleri yapısal bütünlüğünü muhafaza edilir. Bunu başarmak için, Mevcut metodolojiler photopatterning ^2-3, litografi ^4, sıralı functionalization5, ⁶ dondurularak kurutulur, ve arayüz ^7, ya da hangi birçok gelişmiş enstrümantasyon ve teknik beceri gerektiren santrifüj ^8, içerir. Diğer katmanlar ⁹ delaminasyon yol açabilir bireysel katmanların, sıralı eki güveniyor DGMP yoğunlukları ¹⁰ değişik katmanları oluşturmak için böyle iodixanol gibi inert bir yoğunluk değiştirici kullanarak bu sorunların üstesinden. Yoğunluk değiştirici herhangi prepolimer ya da biyolojik olarak aktif molekül ile karışabilir olduğundan, DGMP her bir iskele katman özel izin verir. Bunlar sulu kalırken Bunun için yoğunluk değiştiricisi yoğunluğunu çeşitlendirerek bitişik tabakaların karıştırma önler. Müteakip tek adım polimerizasyon her katmanı ayrı kimyasal ve mekanik özelliklere sahip olduğu yapısal olarak sürekli katmanlı iskele, yol açmaktadır. Yoğunluk değiştirici kolaylıkla tek tek katmanları ya da bunların bileşenleri karışıklık olmadan yeterli çalkalama ile temizlenebilir. Bu teknik, bu nedenle de çeşitli boyutlarda, şekiller ve malzemelerin hidrojeller oluşturmak için uygundur.

Alternatif tabakalar RGDS-350 dahil edildiği bir 2D-polietilen glikol (PEG) jel, imalatı için bir protokol aşağıda verilmiştir. Biz PEG b kullanınbu biyouyumlu ve hareketsizdir ecause. Rgds, bir hücre adezyon peptid ^11, biyolojik bir işaret mekansal kısıtlama göstermek için kullanılan ve bir fluorofor (Alexa Fluor 350) konjugasyon bize görsel çeşitli katmanlarını ayırt etmek mümkün kılınmaktadır. Bu işlem diğer malzemeler için adapte edilebilir (örneğin kollajen, hyaluronan, vb) ve ¹⁰ bazı değişiklikler ile 3D jeller imal uzatılabilir.

Protokol

1. Floresan etiketli akriloil-PEG-RGDS sentezi

1. , Oda sıcaklığında, argon altında, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 1.2:1:2 molar oranda ve NN diizopropiletilamin (DIPEA): akriloil-PEG-karboksimetil süksinimidil ester (3400 g / mol aPEG-SCM, PEG MW) RGDS peptid React gecede.
2. Uçuş matriks destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon zamanı (MALDI-TOF) kütle spektrometresi ile konjugasyon onaylayın. MALDI hedef ve kuru bir örnek nokta aPEG-Rgds Reaksiyon çözeltisi 1 ul ekleyin. Üniversal MALDI tetrahidrofuran Matris (THF) ve 1 dakika süreyle girdap doymuş bir çözeltisi hazırlayın. Aynı örnek nokta bu çözüm ~ 1 ul ekleyin. Karşılaştırma için aPEG-SCM için prosedürü tekrarlayın. Yük ve analiz. APEG-Rgds molekül ağırlığı aPEG-SCM (Şekil 2) fazla olmalıdır.
3. Florofor olarak konjuge edifmesi için, çözülmüş Alexa Fluor 350 karboksilik asit (succinimydyl ester) bir eşit mol miktarı eklemekDMSO en az bir hacim içinde, 1.1 'dan aPEG-RGDS reaksiyon çözeltisi ile ve gece boyunca oda sıcaklığında, argon altında reaksiyona girerler.
4. Günde en az iki kez diyalizat değişimi, 1.000:1 hacimsel oranı az 48 saat süreyle 4 ° C'de DI-H ₂ O karşı (MW 3500 Da) diyaliz tarafından aPEG-Rgds-350 arındırın.
5. Saflaştırılmış bir Labconco Freezone Plus veya eşdeğer bir dondurma kuru sisteminde aPEG-Rgds-350 ve -20 ° C'de mağaza kuru dondurun

2. Rgds-350 Katmanlar Alternatif bir 2D PEG Jel bir 2D Kalıp ve İmalat hazırlanması

1. Hidrofobik cam slaytlar hazırlayın. Bir vakumlu fırın içinde bir cam tabak içine temiz cam slaytlar yerleştirin. Isı 80 ° C'de 30 dakika süre ile tamamen yüzeyler kuru. Sıra bir davlumbaz slaytlar ile çanak ve hafifçe kat tüm yüzeyine 30 sn sallanan, her slayt için 250 ul Sigmacote ekleyin. İyice açılacak en az 5 dakika süreyle iki defa ıslatma, distile su ile yıkama, ardından% 100 metanol ile kaplanmış slaytlara durulamat 10 ml.
2. 10 mm biyopsi yumruklar ile silikon parçaları (0.8 mm kalınlığında) kesin.
3. Silikon spacers ve Sigmacote işlenmiş cam slaytlar otoklavlayınız.
4. Karıştırma PEG diakrilat (PEGda) tarafından ayrı mikrofüj tüpler içinde her bir katman için ilgili çözümler formüle öncü (son konsantrasyon% 15 w / v) ve değişen nihai konsantrasyonlarda (örneğin,% 40 verim ile iodixanol farklı miktarlarda (su içinde% 60 stok çözelti) ile % 30,% 20 ve% 10), fosfat ile takviye dereceli kalan hacim yoğunlukları çözeltileri elde etmek için (PBS) ile tamponlu salin. Benzer bir tarzda, alternatif tabakalar için, iodixanol ve PBS ile bir karışımı aPEG-RGDS-350 (nihai konsantrasyon 8 mM), çeşitli konsantrasyonlarda (örneğin,% 35,% 25 ve% 15) elde edildi.
5. Çeşitli tabakalar (her bir katman, bir ml solüsyon başına stok solüsyonu 10 ul) için her bir çözeltisi (2-Hidroksi-4'-(2-hidroksietoksi)-2-methylpropiophenone, N-vinil pirolidon içinde stok 333mg/ml) foto başlatıcı ekleyin. Photoinitiator is ışığa karşı hassas olduğu için, kalıp jellerin katmanlama önce polimerizasyonu önlemek için son eklenen.
6. Bu protokolün sonraki adımları kısırlık sağlamak için bir biyogüvenlik kabini yapılacaktır.
7. Steril 1 ml şırınga ve 0.2 mikron filtre kullanarak her çözüm filtre sterilize. İki Sigmacore işlenmiş cam slaytlar ve Şekil 1'de gösterildiği gibi yerleştirerek kelepçeler ile güvenli arasındaki boşluk sandwiching tarafından kalıp kurulum birleştirin.
8. Daha az yoğun bir çözelti (% 35 iodixanol örn. aPEG-RGDS-350) ve ardından en yoğun çözelti (% 40 iodixanol örn. PEGda) ilk olarak, ekleme tarafından katmanlı jel döküm. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, istenen bileşim ve yoğunluklarda çeşitli katmanları elde etmek için alternatif katman tekrarlayın.
9. Bir taşınabilir UVR-9000, lamba kullanarak, 3 dakika için 365 nm ışık ile kalıp saçmak. Polimerize jeller 5 dakika dinlenmeye bırakılmalıdır. Kelepçeleri çıkarın, sonra yavaşça üst camı kaldırınslayt ve kalıp; tabakalı DGMP jeller slaytlar üzerinde kalacaktır. Steril bir spatula kullanarak, dikkatli steril PBS veya yıkama için kültür ortamı içeren 50 ml'lik bir tüp jel yerleştirin.
10. Yoğunluk değiştirici, photoinitiator ve reaksiyona girmemiş polimerleri kaldırmak için günde en az iki kez tampon değişimi, 1.000:1 hacimsel oranında PBS içinde polimerize jeller yıkayın. Alternatif olarak, PBS hücre büyüme ortamı ile değiştirilebilir. PBS veya Adım 3 de ana hatları hücre kültürü deneyi için büyüme ortamında DGMP jeller saklayın.
11. Alternatif katmanları görselleştirmek için bir VersaDoc jel dokümantasyon birimi örnek tepsi üzerinde bir cetvel boyunca DGMP jel (bu jelleri hücre kültürü için kullanışlı olmayacaktır) ayarlayabilir. 350 nm de jeller Açığa, maruz kalma süresi fluorofor konsantrasyonuna bağlı olarak değişebilir. DGMP hidrojel karanlık ve mavi şeritler farklı kimyasal bileşimi (Şekil 3) ayrık tabakalarının oluşumu göstermektedir.

3. DGMP Jeller 2B Hücre Kültürü

1. RGDS peptid içeren jeller için, bu tür C2C12 iskelet hücreleri gibi bağımlı yapışma hücreleri kullanılır.
2. Yavaşça bir biyogüvenlik kabini içinde steril bir hücre kazıyıcı kullanarak 48-iyi hücre kültürü tabak kuyulara DGMP jeller (PBS içinde saklanan) takın.
3. Ön-ılık büyüme ortamı (Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı ya da DMEM,% 10 v / v cenin sığır serumu ve% 1 v / v 100x penisilin-streptomisin ile takviye çözelti) ve 37 olarak ayarlanmış bir su banyosu içinde PBS ° C.
4. PBS ile C2C12 hücreleri üç kez 60% konfluent plakası (10 mm) yıkayın. % 0.25 tripsin-EDTA, 1 ml ekleme ve 2 dk için 37 ° C 'de kuluçkaya alarak PBS ve hasat hücrelerini aspire. Büyüme ortamı ve hücre sayımı hücrelerin yeniden süspanse edin. Tohum DGMP jel içeren C2C12 miyoblastları (20,000 hücre / cm ²⁾ ile iyi bir hücre kültürü. _% 5 CO2 /% 95 bağıl nem altında 37 ° C 'de hücreler inkübe edin. Dikkatli 4 saat sonra yavaşça döviz orta, yeniden değilhafifçe yapıştırılmış hücreleri hareket.
5. 24 saat sonra, DGMP jel RGDS içeren katmanların C2C12 miyoblastları eki Epifloresans ile faz kontrast mikroskop (Zeiss Axiovert 200) ile teyit edilebilir.

Sonuçlar

MALDI-TOF analiz akriloil-PEG RGDS peptid (Şekil 2) birleşme teyit etmektedir. Jel görüntüleme fotopolimerizasyon (Şekil 3A) sonra Rgds-350 (mavi) katmanlar ortaya koymaktadır. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, 2B DGMP jel boyut silikon kalıp (sol 10 mm, 8 mm, sağ) çapına göre değişebilir, ve bu nedenle birden fazla tahlillerde kullanım için kolayca özelleştirilebilir - bu durumda uygun bir 48. iyi hücre kültür plakasına (Şekil 3B). Epifloresans ve bir DGMP jel üzerinde kültive C2C12 miyoblastları faz kontrast mikroskop üzerinde seçici bağlanma gösteren RGDS-350-ihtiva eden hücre yapışması peptid (RGDS) arasında bölmelere gösteren PEG analiz edilmiştir (Şekil 4).

Şekil 1. Moleküler weigMALDI-TOF RGDS peptid birleşme sonrası elde edilen aPEG-RGDS ile aPEG-SCM karşılaştırarak HT analizi.

Şekil 2. DGMP jel üretim şematik gösterimi. Gradyanlar katmanlı sonra, fotopolimerizasyon ardından mezun arabirimleri oluşturmak için zaman dönemleri (t _s) değişen yerleşmek için izin verilebilir. Tabakalı DGMP jeller kolayca daha fazla kullanım için kalıp elde edilebilir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3. Fotopolimerizasyon sonra elde A) 2D katmanlı jeller 350 nm ve Versa beyaz ışık kanalları kullanarak görüntülendiDoktor jel dokümantasyon birimi. Görüntü. B) DGMP jel yerleştirilmesi 48-iyi hücre kültür kaplarına beyaz Rgds içeren katmanlar alternatif ortaya tonlamalı.

Şekil 4. Birleştirilmiş faz kontrast ve DGMP jeller (ölçek çubuğu 50 mikron) yetiştirilen C2C12 miyoblastları arasında Epifloresans görüntü.

Şekil 5,. 2 nN kuvvet tetik ¹² ile daha önce kurulan yöntemler kullanarak çapraz PEG substratların statik örneklerinin jel yüzey esnekliğinden iodixanol Etkisi. Atomik kuvvet mikroskobu ölçümleri. * P <0.05 ve ** p <0.01.

Tartışmalar

DGMP pahalı aletlerle dayanmaz katmanlı jeller hazırlamak için basit bir stratejidir. Bu protokol, kollajen ve hyaluronik asit gibi diğer biyolojik olarak uyumlu malzemeler kullanılarak, iskeleler oluşturmak için adapte edilebilir. Tabakalar arasındaki kuyruklarının karıştırma önlemek için Biyoaktif küçük moleküller, örneğin, hücre yapışma arttırıcı RGDS peptid, polimer matris için gergin edilebilir. Bunlar, matris ağ boyutuna bağlı olarak, hidrojeller ile ^{10 arasındaki} yaymak için daha az eğilimli olduğunu Proteinler kimyasal konjugasyon için gerek kalmadan farklı katmanlar halinde yerleştirilebilir. Burada iodixanol (Nycoprep), önceden canlı hücre uygulamalar için tercih edilen bir atıl yoğunluk değiştirici kullanılmaktadır. Sukroz ve glukoz gibi diğer yoğunluk değiştiriciler de kullanılabilir. Yerleşme zamanı (t _s) değiştirerek, bir ihtiyaç olarak iki katman arasındaki arabirimleri (uzun yerleşme zamanı yumuşak geçişler verir) yumuşak veya keskin geçişler üretmek için ince ayar yapabilirsiniz <> 10 sup. Örneğin, DGMP jel tabakalar arasında yumuşak geçiş örneğin kemotaksisi gibi hücre çalışma süreçleri için bir biyolojik işaret sürekli bir gradyan oluşturmak için kullanılabilir.

Jel üzerinde yoğunluk sertlik değiştirici etkileri bir% 15 jel aPEGda için, Şekil 5'te gösterilmiştir; PEGda ve iodixanol konsantrasyonlarının bir fonksiyonu olarak sertlik ve gözeneklilik daha ayrıntılı bir tanımlama şu anda değerlendirilmektedir. Bu örnekte PEGda konsantrasyonu nispeten yüksek olsa da, bu olmadan jel ile karşılaştırıldığında% 30 iodixanol ile jeller içinde% 60 daha fazla elastik modül görülmektedir. Jel sertlik değişim modüle makromer konsantrasyon veya çapraz bağ yoğunluğu için ayarlanabilir.

Biz de poliakrilamid ve PEG öncüleri ¹⁰ kullanarak 3D katmanlı jeller oluşturmak için DGMP tekniği uyguladık. Konsantrasyon veya prepolimerin çapraz bağlanma derecesi değişen sağlayan yapısal varyasyon3D polarize büyüme ve göç gibi hücre davranışlarını incelemek için kullanılabilir iskelelerinin.

Özet olarak, DGMP biyomedikal ve temel araştırmalar, geniş bir uygulama yelpazesi için biyo-uyumlu malzemeler çeşitli 2D ile 3D iskelelerinin üretmek için uygulanabilir bir uyarlanabilir bir tekniktir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif veya Enstrüman	Şirket	Katalog numarası
Polietilen glikol succinimydyl karboksimetil (a-PEG-SCM)	Laysan	120-64
Polyethelyene glikol diacrylate (PEGda)	Dajac Labs	9359
Arginin-glisin-Aspartik asit-serin (RGDS)	Amerikan Peptid	49-01-4
N, N - Diisopropiletilamin (DIPEA)	Sigma	D125806
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma	D2438
N, N-dimetilformamid (DMF)	Balıkçı	D119-4
Tetrahidrofuran (THF)	Balıkçı	T397
Diyaliz kaset (3500Da)	Thermo Scientific	66330
Alexa Fluor 350 karboksilik asit ester succinimydyl	Yaşam Teknolojileri	A-10168
Sigmacote	Sigma	SL2
Silikon tutucular	Grainger	1MWA4
Biyopsi yumruklar	Acuderm	P1025 (10 mm) P850 (8 mm)
Dulbecco'nun fosfat (DPBS) tamponlu salin	Hyclone	SH30028
Iodixanol (NycoPrep)	Balıkçı	NC9388846
2-Hidroksi-4'-(2-hidroksietoksi)-2-methylpropiophenone	Sigma	410896
Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM)	Yaşam Teknolojileri	11054
Fetal bovin serumu	Yaşam Teknolojileri	10082
Penisilin-streptomisin	Yaşam Teknolojileri	15140
C2C12 miyoblastları	ATCC	CRL-1772
MALDI	Bruker	N / A
UVR-9000	Bayco	UVR-9000
VersaDoc	Bio-Rad	N / A