Градиента плотности многослойных полимеризации (DGMP): новый метод для создания Multi-купе, Настраиваемые Строительные леса для тканевой инженерии

Резюме

Здесь мы опишем уникальную стратегию для создания биосовместимых, слоистые матрицы с непрерывным интерфейсы между различными слоями для тканевой инженерии. Такие леса могли бы обеспечить идеальную настраиваемую среду для модуляции поведения клеток различных биологических, химических или механических сигналов

Аннотация

Комплекс культуры тканей матрицы, в которой типы и концентрации биологических раздражителей (например, факторы роста, ингибиторы, или малых молекул) или матричной структуры (например, состава, концентрации и жесткости матрицы) изменяются в пространстве, позволит широкому кругу исследований о том, как эти переменные влияют на клеточную дифференцировку, миграцию и другие явления. Основной проблемой в создании слоистых матриц поддержания структурной целостности слоя интерфейсы без диффузии отдельных компонентов друг от слоя ^1. Современная методология для достижения этой цели включает photopatterning ^2-3, литографии ^4, последовательное functionalization5, сублимационной сушки ^6, микрофлюидики ^7, или центрифугирования ^8, многие из которых требуют сложных приборов и технических навыков. Другие полагаются на последовательное присоединение отдельных слоев, которые могут привести к расслоению слоев ⁹ DGMP преодолевает эти проблемы с помощью инертного модификатора плотности, таких как иодиксанол создавать слои различной плотности ^10. Поскольку плотность модификатора может быть смешано с любым форполимера или биологически активные молекулы, DGMP позволяет каждому слою эшафот, чтобы быть настроены. Просто различной концентрации модификатора плотности предотвращает смешивание соседних слоев, пока они остаются водный. После одной стадии полимеризации приводит к структурно непрерывной многослойной леса, в котором каждый слой имеет различные химические и механические свойства. Плотность модификатора могут быть легко удалены с достаточным количеством воды без возмущения отдельных слоев или их компонентов. Эта методика поэтому хорошо подходит для создания гидрогелей различных размеров, форм и материалов.

Протокол для изготовления 2D-полиэтиленгликоля (PEG) гель, в котором чередующиеся слои включают Rgds-350, приводится ниже. Мы используем PEG бecause это биосовместимых и инертным. Rgds, клеточной адгезии пептидов ^11, используется для демонстрации пространственных ограничений биологического кия, и сопряжение флуорофора (Alexa Fluor 350) позволяет визуально различать различные слои. Эта процедура может быть адаптирован и для других материалов (например, коллаген, гиалуроновая кислота и т.д.) и может быть расширен для изготовления 3D гели с некоторыми изменениями ^10.

протокол

1. Синтез флуоресцентно меченые акрилоил-PEG-Rgds

1. Реакция Rgds пептида с акрилоил-PEG-сукцинимидил карбоксиметил эфира (aPEG-SCM, PEG МВт: 3400 г / моль) и Н. Н. диизопропилэтиламина (DIPEA) в 1.2:1:2 молярные соотношения в диметилсульфоксид (ДМСО) в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение ночи.
2. Подтвердите сопряжение матрицы-активированной лазерной десорбции / ионизации времени пролета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии. Добавить 1 мкл aPEG-Rgds реакционного раствора на образец пятно на целевую MALDI и сухой. Подготовка насыщенным раствором универсального MALDI матрицы в тетрагидрофуране (ТГФ) и вихря в течение 1 мин. Добавить ~ 1 мкл этого раствора на том же месте образца. Повторите процедуру для aPEG-SCM для сравнения. Загрузите и анализировать. Молекулярная масса aPEG-Rgds должно быть больше, чем aPEG-SCM (рис. 2).
3. Для сопряженных флуорофора, добавить эквимолярного количества Alexa Fluor 350 карбоновой кислоты (succinimydyl эфир), растворенныйв минимальном объеме ДМСО, в aPEG-Rgds реакционного раствора с 1,1 и реагируют в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение ночи.
4. Очищают aPEG-Rgds-350 от диализа (MW 3500 Да) против DI-H ₂ O при температуре 4 ° С в течение 48 ч при объемном соотношении 1000:1, обмен диализата по крайней мере, дважды в день.
5. Замораживание сухой очищенный aPEG-Rgds-350 в Labconco Freezone Plus или эквивалент сухого замораживания системы и хранят при температуре -20 ° C.

2. Подготовка 2D форм и изготовление 2D гель ПЭГ с переменным Rgds-350 Слои

1. Подготовьте предметные стекла гидрофобной. Поместите чистые предметные стекла в стеклянной посуде в вакуумной печи. Нагреть до 80 ° С в течение 30 мин до полного высыхания поверхности. Место блюдо с горки в вытяжном шкафу и добавить 250 мкл Sigmacote для каждого слайда, осторожно покачивая в течение 30 секунд, чтобы покрыть всю поверхность. Тщательно промойте покрытием слайды со 100% метанола, с последующей промывкой в ​​дистиллированной воде, впитывая в два раза в течение 5 мин в лизингт 10 мл.
2. Вырезать силиконовые прокладки (0,8 мм) с 10 мм удары биопсии.
3. Автоклав силиконовые прокладки и Sigmacote обработанных предметные стекла.
4. Формулировка решения для каждого соответствующего слоя в отдельных труб микроцентрифуге путем смешивания PEG диакрилат (PEGda) предшественника (конечная концентрация 15% вес / объем) с различным количеством иодиксанол (60% раствор в воде) с получением различных конечных концентраций (например, 40%, 30%, 20% и 10%), дополняя остальные тома с фосфатным буферным раствором (PBS) для получения решения градуированных плотности. Аналогичным образом, для чередующихся слоев, смешать aPEG-Rgds-350 (конечная концентрация 8 мМ) с иодиксанол и PBS для получения различных концентраций (например, 35%, 25% и 15%).
5. Добавить фотоинициатора (2-гидрокси-4'-(2-гидрокси)-2-methylpropiophenone, 333mg/ml складе в N-винилпирролидон) для каждого решения для различных слоев (10 мкл раствора в мл каждого слоя раствора). Фотоинициатора яс добавлен последним для предотвращения полимеризации до слоев гелей в форме, так как он чувствителен к свету.
6. Последующие этапы этого протокола будет выполнена в шкафу биобезопасности для обеспечения стерильности.
7. Фильтр-стерилизовать каждого решения с помощью стерильного шприца 1 мл и 0,2 мкм. Соберите установку по форме сэндвич прокладку между двумя Sigmacore обработанных стеклах и безопасную зажимы размещения, как показано на рисунке 1.
8. В ролях слоистых гелей, добавив самой густой раствор (например, PEGda с 40% иодиксанол) первым, а затем менее плотный раствор (например aPEG-Rgds-350 с 35% иодиксанол). Повторите дополнительное иерархическое для достижения нескольких слоев требуемого состава и плотности, как показано на рисунке 1.
9. Облучать формы с 365 нм свет в течение 3 минут с помощью портативного UVR-9000 ламп. Разрешить полимеризоваться гели для лечения в течение 5 мин. Снимите зажимы, затем осторожно поднимите верхнее стеклослайдов и плесени; стратифицированную гели DGMP останется на слайдах. С помощью стерильного шпателя, осторожно поместите гелей в 50 мл пробирку, содержащую стерильный ФСБ или культуральной среды для стирки.
10. Вымойте полимеризованный гелей в PBS в объемном соотношении 1000:1, обмен буфер по крайней мере, два раза в день, чтобы удалить плотность модификатора, фотоинициатор, и непрореагировавших полимеров. Кроме того, PBS может быть обменен с клеточной среде роста. Хранить DGMP гелей в PBS или питательной среды для эксперимента культуры клеток, изложенных в пункте 3.
11. Для визуализации чередующихся слоев, организовать DGMP гель (эти гели не будут использоваться для культивирования клеток) вдоль линейки на образец лоток документации блока гель VersaDoc. Expose гелей в 350 нм, время экспозиции будет варьироваться в зависимости от концентрации флуорофора. Чередующихся темных и синих полос в DGMP гидрогель продемонстрировать формирования отдельных слоев различных химического состава (рис. 3).

3. 2D культуре клеток на гели DGMP

1. Для включения гели Rgds пептид, использовать сцепление зависимых клеток, таких как C2C12 миобластов.
2. Аккуратно вставьте DGMP гели (хранится в PBS) в лунки 48-луночных культуре клеток пластины, используя стерильные скребком ячейки в кабинет биобезопасности.
3. Предварительно теплой питательной среды (среда Игла, модифицированной Eagle или DMEM с добавлением 10% об / об эмбриональной телячьей сыворотки и 1% V / V 100x пенициллина-стрептомицина раствора) и PBS в водяную баню при температуре 37 ° C.
4. Вымойте 60% сливной пластины (10 мм) C2C12 клеток в три раза с PBS. Аспирируйте с PBS и урожай клеток путем добавления 1 мл 0,25% трипсина-EDTA и инкубации при температуре 37 ° С в течение 2 мин. Ресуспендируют клеток в среде, рост и количество клеток. Семенной DGMP гель-содержащих клеточных культур хорошо с C2C12 миобластов (20.000 клеток / см ^2). Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% CO _2/95% относительной влажности. Аккуратно обмен среду после 4 часов, осторожно, чтобы не повторнодвигаться легко придерживаться клеток.
5. После 24 часов, крепление C2C12 миобластов на Rgds содержащих слои DGMP гели могут быть подтверждены эпифлуоресцентной и фазового контраста микроскопии (Zeiss Axiovert 200).

Результаты

MALDI-TOF анализ подтверждает сопряжения Rgds пептида акрилоил-PEG (рис. 2). Гель изображений показывает переменного Rgds-350 (синий) слоев после фотополимеризации (рис. 3А). Как показано на рисунке 3А, 2D DGMP гель размер может быть изменен на основе диаметра силиконовые формы (10 мм, левое, 8 мм, справа), и, следовательно, легко настраиваемый для использования в нескольких анализах - в этом случае, чтобы соответствовать 48 хорошо пластина культуры клеток (рис. 3В). Эпифлуоресцентной и фазового контраста микроскопии C2C12 миобластов культивировали на DGMP гель показывает выборочный крепления на Rgds-350-содержащих ПЭГ слоев (рис. 4), что свидетельствует расчлененность пептида клеточной адгезии (Rgds).

Рисунок 1. Молекулярная weigHT анализа MALDI-TOF сравнения aPEG-СКМ aPEG-Rgds, полученные после конъюгации пептидов Rgds.

Рисунок 2. Схематическое изображение изготовлению DGMP гель. После градиенты слоистым, они могут осесть в течение различных периодов времени _(T S) для создания градуированной интерфейсов, а затем фотополимеризации. Стратифицированных гели DGMP можно легко извлечь из формы для дальнейшего использования. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 3.) 2D многослойный гель, полученный после фотополимеризации отображаемого использованием 350 нм и белый свет каналов VersaDoc гель документации устройства. Черно-белое изображение показывает чередующиеся слои содержащие Rgds в белый цвет. B) Введение геля DGMP в 48-луночных планшетах культуре клеток.

Рисунок 4. Объединенные фазового контраста и эпифлуоресцентной образ C2C12 миобластов, выращенных на DGMP гели (шкалы 50 мкм).

Рисунок 5. Влияние иодиксанол на гель упругости поверхности. Атомно-силовой микроскопии измерения статических образцов сшитого PEG подложках с использованием ранее установленных методов с 2 NN силу триггера ^12. * Р <0,05 и ** р <0,01.

Обсуждение

DGMP является простой стратегией для подготовки многослойные гели, которые не полагаются на дорогой аппаратуры. Этот протокол может быть адаптирован для создания лесов, используя другие биосовместимые материалы, такие как коллаген и гиалуроновая кислота. Биологически активные маленькие молекулы, например, клеточной адгезии способствующих Rgds пептида, могут быть привязаны к полимерной матрице для предотвращения смешивания сигналов между слоями. Белки могут быть заключены в отдельные слои без необходимости химического сопряжения, как они, в зависимости от размера сетки матрицы, являются менее склонными к диффундировать через гидрогелей ^10. Здесь мы использовали иодиксанол (Nycoprep), инертные модификатора плотности, который ранее использовался для жизнеспособного приложений клетки. Другие модификаторы плотности, такие как сахароза и глюкоза также может быть использован. Изменяя время установления _(T S), можно точно настроить интерфейс между двумя слоями производить плавным или резким переходам по мере необходимости (больше времени установления дает плавные переходы) ^{10. Например, плавные переходы между слоями геля DGMP может быть использован для создания непрерывного градиента биологических Кий для изучения клеточных процессов, таких как хемотаксис.}

Эффект плотности модификатор геля жесткости показано на рисунке 5 для 15% aPEGda гель; более полную характеристику жесткости и пористости в зависимости от PEGda и иодиксанол концентрации в настоящее время оценивается. В то время как концентрация PEGda в этом примере является относительно высокой, мы наблюдали 60% больше упругости в гелях с 30% иодиксанол по сравнению с гелями без. Изменения в гель жесткость можно регулировать путем модуляции для концентрации макромера или плотность сшивки.

Мы также применили DGMP технику для создания 3D многослойный гель использованием полиакриламида и PEG прекурсоров ^10. Варьируя концентрации или степень сшивания форполимера позволяет структурные изменения влеса, который может быть использован для изучения поведения клеток, таких как поляризованные рост и миграцию в 3D.

Таким образом, DGMP является адаптируемой метод, который можно применять для изготовления 2D и 3D леса из различных биосовместимых материалов для широкого спектра биомедицинских и основных исследовательских задач.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реагент или инструмента	Компания	Номер в каталоге
Полиэтиленгликоль succinimydyl карбоксиметилцеллюлозы (-PEG-SCM)	Лейсан	120-64
Polyethelyene гликоля диакрилат (PEGda)	Dajac Labs	9359
Аргинин-глицин-аспарагиновой кислоты, серина (Rgds)	Американский пептида	49-01-4
N, N - диизопропилэтиламин (DIPEA)	Сигма	D125806
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Сигма	D2438
N, N-диметилформамид (DMF)	Рыбак	D119-4
Тетрагидрофуран (ТГФ)	Рыбак	T397
Диализ кассеты (3500Da)	Thermo Scientific	66330
Alexa Fluor 350 карбоновой кислоты succinimydyl эфир	Life Technologies	-10168
Sigmacote	Сигма	SL2
Силиконовые прокладки	Грейнджер	1MWA4
Биопсия ударов	Acuderm	P1025 (10 мм) P850 (8 мм)
Фосфатом Дульбекко буферном растворе (DPBS)	Hyclone	SH30028
Иодиксанол (NycoPrep)	Рыбак	NC9388846
2-гидрокси-4'-(2-гидрокси)-2-methylpropiophenone	Сигма	410896
Игла, модифицированной Орла среде (DMEM)	Life Technologies	11054
Эмбриональной бычьей сывороткой	Life Technologies	10082
Пенициллин-стрептомицин	Life Technologies	15140
C2C12 миобластов	ATCC	CRL-1772
MALDI	Bruker	N / A
УВР-9000	Bayco	УВР-9000
VersaDoc	Bio-Rad	N / A