밀도 그라데이션 Multilayered 중합 (DGMP) : 멀티 칸 만들기위한 소설 기법, 조직 공학을위한 사용자 정의 공사장 공중 발판

요약

여기 조직 공학을위한 개 층 사이의 끊임없는 인터페이스와 biocompatible, 다층 매트릭스를 만들기위한 독특한 전략을 설명합니다. 이러한 비계는 다양한 생물학적, 화학적 또는 기계적 신호에 의해 세포 행동을 조절하기 위해 이상적인 사용자 정의 환경을 제공 할 수

초록

유형 및 생물학적 자극 (예 : 성장 요인 억제제, 작은 분자) 또는 매트릭스 구조의 농도는 (매트릭스의 예 조성, 농도, 또는 강성) 공간을 통해 다양하고있는 복합 조직 문화 매트릭스는 조사의 다양한 사용 것 이 변수는 셀 차별화, 마이그레이션 및 기타 현상에 미치는 영향에 관한. 계층 매트릭스를 생성의 주요 과제는 각 레이어 ^1에서 개별 구성 요소의 확산없이 레이어 인터페이스의 구조 무결성을 유지하고 있습니다. 이를 위해 현재 방법론은 photopatterning ^2-3, 리소그래피 ⁴ 연속 functionalization5, ^{6 건조} 동결, microfluidics ⁷ 또는 어떤 많은 복잡한 장비 및 기술 능력을 필요로 원심 분리 ^8이 포함되어 있습니다. 기타 층 ⁹ 박리가 발생할 수 있습니다 개별 레이어의 연속 첨부 파일에 의존 DGMP는 밀도 ^{10 달러를} 변화의 레이어를 만들 수 같은 iodixanol 같은 불활성 밀도 변형을 사용하여 이러한 문제를 극복. 밀도 수정은 어떤 성 예비 중합체 또는 bioactive 분자와 혼합 될 수 있기 때문에, DGMP는 각 비계 층이 사용자 정의 할 수 있습니다. 그들은 수성 유지하면서 단순히 밀도 변형의 농도를 변화하는 것은 인접한 레이어의 혼합 방지 할 수 있습니다. 후속 단일 단계 중합은 각 층은 독특한 화학적, 기계적 성질을 가지고있는 구조적 연속 multilayered 발판에 상승을 제공합니다. 밀도 수정은 쉽게 개별 레이어 또는 구성 요소의 섭동없이 린스 충분한와 함께 제거 할 수 있습니다. 이 기술은 따라서 잘 다양한 크기, 형태, 및 자료의 hydrogels를 만들 적합합니다.

번갈아 가며 층 RGDS-350 통합하는 2D-폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 젤, 제조를위한 프로토콜은 아래 설명되어 있습니다. 우리는 PEG B를 사용이 biocompatible 및 불활성입니다 ecause. RGDS, 세포 접착 펩타이드 ^11, 생물학적 단서의 공간 제한을 설명하는 데 사용, 그리고 형광 (알렉사 형석 350)의 활용은 우리가 시각적으로 다양한 레이어를 구별 할 수 있습니다. 이 절차는 다른 재료에 적용 할 수 있습니다 (예 : 콜라겐, hyaluronan 등) ¹⁰ 일부 수정 3D 젤을 제조하도록 확장 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 휘황 레이블 Acryloyl-PEG-RGDS의 합성

1. 상온에서 아르곤에 따라 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 1.2:1:2 몰 비율에서와 NN diisopropylethylamine (DIPEA) : acryloyl-PEG-succinimidyl 카르복시 메틸 에스테르 (3천4백그램 / 몰 aPEG-SCM, PEG MW)로 RGDS 펩타이드를 반응 하룻밤.
2. 비행 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 / 이온화 시간 (든 - TOF) 질량 분광법에 의해 활용을 확인합니다. 든 대상과 드라이에 샘플 명소로 aPEG - RGDS 반응 용액 1 μl를 추가합니다. 유니버설 든 tetrahydrofuran의 매트릭스 (THF) 및 1 분에 소용돌이 포화 용액을 준비합니다. 동일한 샘플 지점이 솔루션의 ~ 1 μl를 추가합니다. 비교를 위해 aPEG-SCM 절차를 반복합니다. 로드 분석 할 수 있습니다. aPEG - RGDS의 분자 무게 aPEG-SCM (그림 2)보다 커야합니다.
3. 형광을 결합한하려면 용해 알렉사 형석 350 카르 복실 산 (succinimydyl 에스테르)의 몰 금액을 추가DMSO의 최소 볼륨에서, 1.1에서 aPEG-RGDS 반응 솔루션과 하룻밤 실온에서 아르곤에 따라 반응한다.
4. 하루에 적어도 두 번 dialysate 교환, 1,000:1 용적 비율 48 시간에 대해 4 ° C에서 DI-H ₂ O에 대해 (MW 3500 다) dialyzing에 의해 aPEG-RGDS-350 정화.
5. 정화 Labconco Freezone 플러스 또는 이에 상응하는 동결 건조 시스템에서 aPEG-RGDS을 350 및 -20 ° C.에 상점을 건조 고정

2. RGDS-350 레이어를 교대로 2D PEG 젤의 2D 몰드와 제작의 작성

1. 소수성 유리 슬라이드를 준비합니다. 진공 오븐에 유리 그릇에 깨끗한 유리 슬라이드를 놓습니다. 80 열 ° C 30 분에 완전히 표면을 건조합니다. 장소 퓸 후드에 슬라이드를 즐길 수있는 요리와 부드럽게 코트 전체 표면에 30 초에 흔들 각 슬라이드에 250 μl Sigmacote를 추가합니다. 철저히 leas에서의 5 분에 두 번 몸을 담근 채, 증류수에 세척 한 다음, 100 % 메탄올로 코팅 된 슬라이드를 헹굼t 10 ML.
2. 10mm 생검으로 주먹을 실리콘 스페이서 (두께 0.8 mm)을 자른다.
3. 실리콘 스페이서와 Sigmacote - 처리 유리 슬라이드를 압력솥.
4. 혼합 PEG diacrylate (PEGda)에 의해 개별 microfuge 튜브의 각 각 레이어에 대한 솔루션을 공식화 전구체 (최종 농도 15% w / V) 다양한 최종 농도 (예를 들면 40 %를, 얻을 수있는 iodixanol의 다른 양 (물에 60 %의 재고 솔루션)와 30 %, 20 %, 10 %), 인산과 나머지 볼륨을 보충하는 것은 등급 밀도의 솔루션을 얻기 위해 (PBS) 염분 버퍼. 비슷한 방법으로 레이어를 번갈아 가며 들어, iodixanol 및 PBS와 혼합 aPEG-RGDS-350 (최종 농도 8 MM)는 다양한 농도 (예를 들면 35%, 25 %, 15 %) 얻을 수 있습니다.
5. 다양한 층 (각 층 솔루션의 ML 당 재고 솔루션의 10 μl)에 대한 각 솔루션에 (2 - 히드 록시 4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone, N-비닐 pyrrolidone의 333mg/ml 주식) photoinitiator을 추가합니다. Photoinitiator 전S는 빛에 민감하므로, 금형의 젤의 레이어링하기 전에 중합을 방지하기 위해 마지막으로 추가되었습니다.
6. 이 프로토콜의 후속 단계는 불임을 보장하기 위해 바이오 안전성 캐비닛에서 수행됩니다.
7. 멸균 한 ML의 주사기와 0.2 μm 필터를 사용하여 각 솔루션을 필터 소독. 이 Sigmacore - 처리 유리 슬라이드와 그림 1에 묘사 된대로 배치 클램프와 보안 사이의 공백을 sandwiching하여 금형 설정을 조립.
8. 적은 고밀도 솔루션 (35 % iodixanol있는 예 aPEG-RGDS-350)에 이어 가장 고밀도 솔루션 (40 % iodixanol있는 예 PEGda) 첫을 추가하여 계층 젤을 던져. 그림 1과 같이 원하는 구성과 밀도의 여러 레이어를 달성하기 위해 다른 레이어링를 반복합니다.
9. 휴대용 UVR-9000 램프를 사용하여 3 분에 365 nm의 빛으로 금형을 비추다. polymerized 젤은 5 분 동안 치료 할 수 있습니다. 클램프를 제거하고 부드럽게 상단 유리를 들어슬라이드와 곰팡이, 층상 DGMP의 젤은 슬라이드에 남아있게됩니다. 멸균 주걱을 사용하여 조심스럽게 무균 PBS 또는 세척을위한 문화 매체를 포함하는 50 ML 튜브에 젤을 배치합니다.
10. 밀도 수정, photoinitiator 및 unreacted 폴리머를 제거하는 하루에 적어도 두 번 버퍼를 교환, 1,000:1 용적 비율로 PBS에 polymerized 젤을 씻는다. 또한 PBS는 세포의 성장 매체로 교환 할 수 있습니다. PBS 또는 3 단계에서 설명한 세포 배양 실험의 성장 매체에 DGMP 젤을 저장합니다.
11. 교대 레이어를 시각화하려면 VersaDoc 젤 문서 단위의 샘플 트레이에 자 함께 DGMP 젤을 (이 젤은 세포 배양에 사용할 수 없습니다) 주선합니다. 350 nm 정도의 젤을 노출, 노출 시간은 형광의 농도에 따라 달라질 수 있습니다. DGMP 히드로 겔에 어두운 파란색 밴드를 교체하는 것은 별개의 화학 성분 (그림 3)의 분리 층의 형성을 보여줍니다.

3. DGMP 젤의 2D 세포 배양

1. RGDS의 펩타이드를 통합 젤 들어, C2C12 myoblasts 등의 접착에 의존 세포를 사용합니다.
2. 부드럽게 바이오 안전성 캐비닛에 무균 세포 스크레이퍼를 사용하여 48도 세포 배양 플레이트의 우물에 DGMP 젤을 (PBS에 저장) 삽입합니다.
3. 사전 따뜻한 성장 매체 (Dulbecco의 수정 이글 배지 또는 DMEM 10 % V / V 태아 소 혈청과 1% 브이 / v 100x 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션과 보충)과 37 번 설정 물 목욕에 PBS ° C.
4. PBS로 C2C12 세포 세 번이나 60 % 합류 플레이트 (10mm)를 씻으십시오. 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML를 추가하고 2 분에 37 ° C에서 잠복기에 의해 PBS와 수확 세포를 대기음. 성장 매체와 카운트 세포에서 세포를 Resuspend. 종자 DGMP 젤이 포함 된 C2C12 myoblasts (20,000 세포 / cm ^2)과 잘 세포 배양합니다. 5 % CO _{95분의 2} % 상대 습도에서 37 ° C에서 세포를 배양. 주의 4 시간 후 부드럽게 교환 매체를 다시하지 않기가볍게 준수 세포를 이동합니다.
5. 24 시간 후, DGMP 젤의 RGDS 함유 층에 C2C12 myoblasts의 첨부 파일은 epifluorescence과 위상 대비 현미경 (Zeiss Axiovert 200)을 통해 확인 할 수 있습니다.

결과

든 - TOF 분석 acryloyl-PEG에 RGDS의 펩타이드 (그림 2)의 결합을 확인합니다. 젤 영상은 photopolymerization (그림 3A) 이후 RGDS-350 (파란색) 레이어를 번갈아 가며 보여준다. 그림 3a에 도시 된 바와 같이, 2D DGMP 젤 크기는 실리콘 금형 (왼쪽 10mm,, 8mm, 오른쪽)의 직경에 따라 다양 할 수 있으며, 따라서 여러 assays에 사용하기 쉽게 사용자 정의 할 수 있습니다 -이 경우에 맞게 48 잘 세포 배양 플레이트 (그림 3B). Epifluorescence과 DGMP 젤을 배양 C2C12 myoblasts의 위상 대비 현미경가 선택적 첨부 파일을 보여줍니다 RGDS-350이 포함 된 셀 접착 펩타이드 (RGDS)의 compartmentalization을 보여주는 PEG 레이어를 (그림 4).

1 그림. 분자 무게는든 - TOF는 RGDS의 펩타이드의 결합 후 얻은 aPEG - RGDS에 aPEG-SCM을 비교하여 HT 분석.

그림 2. DGMP 겔 제조의 개략도. 그라데이션이 층을 한 후에 그들이 photopolymerization 다음 단계적 인터페이스를 만들 시간 기간 _(t들) 변화에 정착 할 수 할 수 있습니다. 층상 DGMP의 젤 쉽게 더 사용을위한 금형에서 추출 할 수 있습니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3. photopolymerization 후 얻은 A) 2D multilayered 젤은 350 nm의와 마찬가지의 하얀 빛 채널을 사용하여 이미징닥터 겔 문서 단위입니다. 이 이미지는. B) DGMP 젤의 삽입 48도 세포 배양 요리에 흰색으로 RGDS를 포함하는 레이어를 번갈아 가며 나타 그레이 스케일.

그림 4. 통합 위상 대비, DGMP 젤 (스케일 바 50 μm)에서 성장 C2C12 myoblasts의 epifluorescence 이미지입니다.

그림 5. 2 NN 힘 트리거 ¹² 이전에 설정 한 방법을 사용하여 가교 PEG 기판의 정적 샘플 겔 표면 탄성에 iodixanol의 효과. 원자 힘 현미경 측정. * P <0.05와 ** P <0.01.

토론

DGMP 비싼 장비에 의존하지 않는 multilayered 젤을 준비하기위한 간단한 전략이다. 이 프로토콜은 이러한 콜라겐과 hyaluronic 산성 등의 biocompatible 재료를 사용하여 공사장 공중 발판을 만들기위한 적응 할 수 있습니다. 층 사이 신호의 혼합 방지하기 위해 Bioactive 작은 분자, 예를 들어 셀이 부착이 - 홍보 RGDS의 펩타이드를 고분자 매트릭스에 닿는 할 수 있습니다. 그들은, 매트릭스 메쉬 크기에 따라, hydrogels ^{~ 10} 무마 적은 경향이 같은 단백질은 화학 결합에 대한 필요없이 개 층에 캡슐화 할 수 있습니다. 여기 iodixanol (Nycoprep), 이전에 생균 응용 프로그램에 사용 된 불활성 밀도 변형을 사용 하였다. 이러한 자당 및 덱스 트로 오스와 같은 다른 밀도 조절도 사용할 수 있습니다. 정착 시간 _(t들)을 변화시킴으로써, 하나는 필요에 따라 두 레이어 사이의 인터페이스 (이상 정착 시간이 부드럽게 전환 할 수 있습니다) 과격하거나 날카로운 전환을 생산 조정 할 수 있습니다 <> 10 논의하게 될 것입니다. 예를 들어, DGMP 젤 레이어 사이의 부드러운 전환 효과는 같은 chemotaxis와 같은 세포 과정을 연구 할 수있는 생물학적 신호의 연속 그라디언트를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

겔 강성의 밀도 수정의 효과가 15 % aPEGda 젤에 대한 그림 5에 표시됩니다, PEGda과 iodixanol 농도의 함수로 강성 및 다공성의 더 완전한 특성화 현재 평가되고 있습니다. 이 예에서 PEGda의 농도가 상대적으로 높은 반면, 우리는없는 젤에 비해 30 % iodixanol와 젤에 60 % 더 큰 탄성 계수를 관찰했다. 겔 강성의 변화는 변조 macromer 농도 또는 crosslinking 밀도가 비용을 조정할 수 있습니다.

우리는 또한 polyacrylamide와 PEG의 전구체 ^(10)을 사용하여 3D multilayered 젤을 만들 수있는 DGMP 기술을 적용했습니다. 농도 또는 성 예비 중합체의 crosslinking의 정도를 변화하는 것은 허용의 구조 변화3D로 양극화 성장 및 마이그레이션과 같은 세포 행동을 탐색하는 데 사용할 수 있습니다 공사장 공중 발판.

요약, DGMP는 생물 의학 및 기초 연구 응용 프로그램의 광범위한 biocompatible 재료의 다양한 2D 및 3D 공사장 공중 발판을 제조에 적용 할 수있는 적응 기술이다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약 및 악기	회사	카탈로그 번호
폴리에틸렌 글리콜 succinimydyl 카르복시 메틸 (A-PEG-SCM)	Laysan	120-64
Polyethelyene 글리콜 diacrylate (PEGda)	Dajac 연구소	9359
아르기닌 - 글리신 - 아스파르트 산 - 세린 (RGDS)	미국의 펩타이드	49-01-4
N, N - Diisopropylethylamine (DIPEA)	시그마	D125806
디메틸 sulfoxide (DMSO)	시그마	D2438
N, N-dimethylformamide (DMF)	어부	D119-4
Tetrahydrofuran (THF)	어부	T397
투석 카세트 (3500다)	열 과학	66,330
알렉사 형석 350 카르 복실 산 succinimydyl 에스테르	생명 기술	A-10168
Sigmacote	시그마	SL2
실리콘 스페이서	Grainger	1MWA4
생검 펀치	Acuderm	P1025 (10 ㎜) P850 (8 ㎜)
Dulbecco의 인산은 (DPBS) 염분 버퍼	Hyclone	SH30028
Iodixanol (NycoPrep)	어부	NC9388846
2 - 히드 록시 4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	시그마	410896
Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM)	생명 기술	11,054
태아 소 혈청	생명 기술	10,082
페니실린 - 스트렙토 마이신	생명 기술	15,140
C2C12 myoblasts	ATCC	CRL-1772
든	Bruker	N / A
UVR-9000	Bayco	UVR-9000
VersaDoc	바이오 RAD	N / A